Summary
我们描述了一种通过倒转旋转盘共聚焦显微镜,利用鼠小肠的细胞内成像来可视化GFP标记的IELs的方法。该技术能够跟踪粘液中的活细胞长达4小时,并可用于研究各种肠道免疫-皮皮相互作用。
Abstract
表达βT细胞受体(*IEL)的内皮淋巴细胞在肠道上皮的免疫监测中起着关键作用。部分由于缺乏一个明确的配体为β+T细胞受体,我们对α®IEL活化的调节及其在体内的功能的理解仍然有限。这就要求制定替代策略,以询问在调节[IEL功能]时涉及的信号通路,以及这些细胞对局部微环境的响应能力。尽管人们普遍认为® IEL 能够限制病原体的易位,但使用生命内成像对于了解稳态 IEL/上皮相互作用的时空动力学和对侵入性病原体的反应至关重要。在此,我们提出了一种使用倒转旋转盘共聚焦激光显微镜在GFP +T细胞报告小鼠的小肠道粘孔中可视化IEL迁移行为的协议。尽管这种方法的最大成像深度相对于使用双光子激光扫描显微镜有限,但旋转盘共聚焦激光显微镜具有高速图像采集的优势,减少了光漂白和光。使用4D图像分析软件,T细胞监测行为及其与相邻细胞的相互作用可以在实验操作后进行分析,以提供对肠道粘细胞内IEL激活和功能的更多洞察。
Introduction
内皮淋巴细胞(IEL)位于肠道上皮内,在侧细胞间空间1中沿基底膜和相邻上皮细胞之间发现。每5-10个上皮细胞大约有一个IEL;这些IEL作为哨兵,提供免疫监测的肠道上皮屏障2的广大。表达β+T细胞受体(TCR)的IELs占鼠小肠中IEL总种群的60%。对T细胞缺乏小鼠的研究表明,这些细胞对肠道损伤、炎症和感染的反应具有大部分的保护作用。尽管Tcrd敲除小鼠6的产生,我们对IEL生物学的理解仍然有限,部分原因是*TCR所承认的配体尚未确定7。因此,由于缺乏研究该细胞群的工具,因此难以研究βTCR激活和在生理和病理条件下的作用。为了填补这一空白,我们开发了活成像技术,以可视化 IEL 迁移行为和与邻近肠细胞的相互作用,以此提供对 [ IEL 功能和对体内外部刺激的反应) 的更多见解。
在过去十年中,生命内成像显著扩展了我们对肠道生物学多个方面涉及的分子事件的理解,包括上皮细胞脱落8、上皮屏障功能调节9 ,10,骨髓细胞采样的发光含量11,12,和宿主微生物相互作用11,13,14,15,16.在IEL生物学的背景下,使用生命内显微镜揭示了IEL运动的时空动力学和调解其监测行为的因素13,14,15, 16.TcrdH2BeGFP(TcrdEGFP)报告小鼠的发育表明,*IEL在上皮内具有很高的运动性,并且表现出一种对微生物有反应的独特监测行为。感染17,13,14。最近,另一种β细胞报告器小鼠被开发(Tcrd-GDL),在细胞质中表达GFP,允许整个细胞18的可视化。类似的方法也被用来研究特定化学素受体的需求,如G蛋白耦合受体(GPCR)-18和-55,对IEL运动19,20的动态。在没有细胞特异性报告器的情况下,针对CD8+的荧光结合抗体用于可视化和跟踪体内的IEL运动能力19,20。虽然双光子激光扫描显微镜通常用于生命内成像,但使用旋转盘共聚焦激光显微镜具有独特的优势,可以捕获以最小的背景噪声捕获高速和高分辨率多通道图像。该技术非常适合阐明肠道粘液复杂微环境中免疫/表皮相互作用的时空动力学。此外,通过使用各种转基因和/或敲除小鼠模型,这些研究可以深入了解肠道免疫和/或上皮细胞功能的分子调节。
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Protocol
所有研究均根据罗格斯新泽西医学院比较医学资源批准的协议,在实验室动物护理评估与认证协会(AALAC)认可的设施中进行。
1. 鼠标准备
注:以下程序,包括动物准备和手术,需要30-40分钟。 手术前,打开显微镜,将显微镜上的封闭培养箱加热至37°C。
- 在C57BL/6背景上对8-10周大的TcrdEGFP小鼠进行实验,这些实验来自伯纳德·马列森(INSERM,法国巴黎)。根据IACUC批准的程序,根据动物的重量,通过注射氯胺酮(120毫克/千克)和木兰辛(10毫克/千克)来麻醉小鼠。评估麻醉水平通过呼吸率(每分钟55-65次呼吸)21,脚趾捏和帕佩布拉反射。
- 一旦达到手术平面麻醉,用胶带固定小鼠的后腿,以保持体温,可以通过直肠温度计进行监测。如果有麻醉消失的迹象(例如,呼吸速率增加、眨眼和/或眼肌对帕普勃拉反射的抽搐反应),一次重新施用50μL的氯胺酮/西拉津,直到小鼠完全镇静。
- 通过稀释 50 μL 的 Hoechst 33342 (10 mg/mL) 与 315 μL 的 0.9% 盐碱制备核染料;最终浓度为37.5毫克/千克,根据小鼠的重量(200 μL近似体积)。一旦小鼠被麻醉,通过回溯轨道静脉鼻塞,使用结核菌内注射器缓慢地注射Hoechst。
注:等待 1⁄2 分钟,然后继续执行下一步,让鼠标适应逆轨注入后循环体积的变化。 - 在眼睛上放置少量润滑剂,以防止它们干燥。
2. 小鼠手术:腹腔切除术,以暴露肠道粘沙
- 沿下腹部的中线通过皮肤和腹膜进行2厘米垂直切口,使要成像的肠道区域外在。
- 使用倾斜的钳子,小心地从围肠腔中拉出cecum,并确定要成像的小肠区域。在这个过程中,小心不要撕裂血管。为了尽量减少潜在的损伤或出血,避免用钳子抓住或挤压肠道。
- 找到一个合适的小肠区域(2⁄3厘米),用于包含最小粪便内容的成像。小心地将cecum和剩余的小肠返回到围肠腔中,同时使兴趣部分外化。
注:在这一步中,避免刺穿cecum或破坏鼻管。 - 在血管之间的底面两侧放置两对钳子,轻轻擦合钳尖,在膜上形成一个洞(图1)22。这将允许针通过肠下围肠腔时穿过管子。
- 关闭切口,同时保持肠道环外化。使用倾斜的钳子和弯曲的锥形针连接到5厘米缝合线,穿透围肠的一侧,穿过上一步所造的孔,然后穿过围膜衬里的另一侧。将一个缝合线放在顶部,另一个缝合线靠近切口的底部。
注:避免在这一步中损坏血管。 - 重复此过程,关闭肠道循环下的皮肤,在切口中间,在底层围肠的先前缝合线之间放置一个缝合线。
注:重要的是只将要成像的区域外部化;这将减少成像过程中的无关运动。一定要避免绑住肠动脉。 - 使用电穿孔沿防气边界进行穿孔。烧灼后,立即向肠道表面施用几滴水,以防止额外的热源性组织损伤。用金刷去除残留水。
- 使用 Vannas 剪刀在烧焦组织的远端边缘切割一个小水平狭缝,然后沿着烧焦线的长度沿外化组织段的近端切割(长度约 1.5 厘米),以暴露粘膜表面。
注:如有必要,使用钳子轻轻去除裸露的粘膜表面残留的任何多余的粪便内容。 - 用湿的 Kimwipe 盖住小鼠的腹部,以防止组织脱水。将鼠标运送到有盖容器中的显微镜上。
3. 通过旋转磁盘共聚焦显微镜获取图像
- HBSS 中的移液器 150 μL 1 μM AlexaFluor 633 放在 35 mm 盘子底部的玻璃盖上。放置鼠标,使打开的粘膜表面直接接触盖玻片。
- 将显微镜的头部向后倾斜,将鼠标放在成像阶段的盖板上,放在预热的培养箱中。或者,用加热毯盖住鼠标以保持体温。
- 启动成像软件。每个激光器的激发强度和曝光时间不应分别超过 10~15 mW 或 120*150 ms,以避免光漂白并最小化时间点之间的间隔。将帧平均值调整为"2"并打开 EM 增益功能以减少背景噪音。选择 63x 目标校准以确保正确测量像素大小。
注:上述详细设置旨在提供初始参考,但会因显微镜配置而异。 - 使用 405 nm 激光和 20x 空气目标,可视化原子核以定位缺乏明显运动或眼睛漂移的绒带场。避免因呼吸、蠕动或心跳而出现伪性运动区域。
- 使用 XY 扫描,记录感兴趣领域的 XY 坐标,并切换到甘油浸没 63X 目标。
- 通过在 405 nm 通道上获取实时图像长达 1 分钟,确认所选字段中的绒布是稳定的。
- 在 405 nm 通道上获取实时图像时,调整焦点以查找正交平面正下方的绒面尖。从正下方的绒毛尖下下,使用1.5 μm步进,获取Z-堆栈,直到难以解析核,约15~20μm。
注:当使用上述曝光时间对三个通道(405、488、640 nm)进行成像时,可以按大约 20 秒的间隔顺序获取所有三个通道。 - 在分析模式下打开软件,在开始采集后3~5分钟,确认图像稳定性和[IEL运动性]。继续获取每个 villi 领域的 30-60 分钟的图像。记录每只鼠标的 2⁄3 个字段。成像时,每 5 分钟监控一次鼠标。
注:如果麻醉开始磨损,使用钳子轻轻刮伤小鼠的脖子,一次施用50μL的氯胺酮/西他辛。继续监测麻醉水平,必要时重新管理。 - 不建议将单个鼠标的映像时间超过 4 小时。一旦图像采集完成,通过宫颈错位牺牲小鼠,然后是双边肺气肿。
4. 图像的4D分析
- 直接将成像文件导入 4D 渲染软件。
- 为IEL 和流明创建单独的曲面,然后使用表 1中概述的参数作为初始参考来跟踪一段时间内的曲面。对于 IEL,启用使用指示的种子点直径拆分接触对象。
- 使用自动回归跟踪算法确定 IEL 运动性。尽管跟踪算法相对准确,但必须直观地检查每个 IEL 的轨道。如果轨道不正确,请使用"编辑轨道"选项卡下的"断开连接和连接"功能进行更正。
- 要确定从每个 IEL 到流明的距离,请选择流明曲面并在"工具"菜单下执行距离变换功能。当出现提示时,选择"外部曲面"。计算后,距离变换将显示为第 4 个通道。
- 过滤第 4 个通道的强度最小值,以选择位于横向细胞间空间 (LIS) 内的 IEL。此值应接近 15 μm,基于柱上皮细胞的高度。此范围内总 α + IELl 的百分比报告为 LIS 中 α IEL 的频率。
- 为进一步分析,出口统计数据包括:IEL 轨道速度、轨迹位移、轨道直线和轨道长度。或者,使用 Vantage 模块分析数据。根据实验的不同,从采集的数据中获取其他指标,包括在 LIS 或 IEL/表观相互作用中的停机时间。
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Representative Results
使用 TcrdEGFP 实验鼠的维生成像技术,我们之前已经表明 , * IELs 表现出动态监视行为, 它们沿着基底膜迁移到侧细胞间空间 (LIS) 中,以稳定的方式巡视上皮状态 (图 2, 影片1。
这种方法还可用于评估特定细胞信号通路和/或受体的抑制如何影响[]IEL迁移行为。例如,白细胞介素(IL)-15是一种多性细胞因子,对ΑIEL平衡症23、24至关重要。为了确定IL-15信号通过IL-2R+受体是否有助于在稳定状态下α®IEL运动动能的动力学,TcrdEGFP报告小鼠在给药抗IL-2R®抗体(TM-+1)或同型IgG2b对照后2小时成像。彩色轨道指示个体 + IEL 在 30 分钟内的迁移路径(图 3A)。虽然使用TM-+1(图3A,B)治疗的小鼠中αIELs的频率增加,但超过30%的这些βIEL表现出怠速行为(图3A,C)。通过对轨道直线度和轨道位移长度施加上限来定义空闲 α IEL。在IL-2R+封锁后,IEL的瞬时速度和约束比相对于控制显著降低,从而证实了这种怠速表型(图3D,E)。此外,空闲 + IEL 的停留时间更长,并且比活动 * IEL 更频繁地在 LIS 中进行本地化(图 3F)。
图1:使用钳子在画孔中创建一个孔。在膜的两侧放置钳子,为缝合线创建一个孔。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:在jejunum中代表IEL的3D图像。从 TcrdEGFP 报告器鼠标在稳态下拍摄的 Jejunal 粘膜的延时视频中选择了一个时间点。• IELl 以绿色显示,核以白色显示,流明显示为红色。刻度条 = 30 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:IL-2R+的抑制诱导ΑIEL在侧细胞间空间中怠速。这个数字改编自"内皮IL-15是肠道粘液内淋巴细胞运动的关键调节器",由Hu,M.D.等人2018年,J免疫,201 (2),第747-756页。15版权 2018 由美国免疫学家协会 (A) 延时图像显示迁移 GFP + IELs 在 Jejunal villoum 内 2 小时处理后与 0.45 毫克 IgG2b 或 TM-+1.在 30 分钟内,单个 + IELs(绿色)的动向以彩色轨道显示。核以白色显示,流明以红色显示。刻度条 = 20 μm. (B) LIS 中 IELl 的频率 [] (n = 每次处理 3 个小鼠,n = 6-7 个视频)。(C) IgG2b-或TM-β1处理小鼠中闲置的βILT的百分比。(D) 瞬时速度(n = 13,299 和 9,600 个时间点)。(E) 显示轨道约束比率(n = 350 和 278 轨道)。(F) 空闲和活动距距与流明的距离。表示平均值= SEM(*)。*p < 0.05, \p < 0.01, #p < 0.0001.请点击此处查看此图的较大版本。
| 耶尔 | 腔 | |
| 表面细节(微米) | 1.2 | 1.5 |
| 背景减法(微米) | 1.67 | 2 |
| 种子点直径(微米) | 7.5 | 不适用 |
| 过滤器:体素数量 | 250 | 6,500 |
| 跟踪:最大距离(μm) | 10 | 10 |
| 跟踪:最大间隙 | 2 | 2 |
表 1:用于生成的代表性设置• 伊马里斯中的 IEL 和亮度"表面"。在生成和跟踪 488 nm 通道 (IEL) 和 640 nm 通道 (流明)的曲面时,这些设置可用作起点。根据实验条件,可能需要修改这些设置。
电影1:GFP的内成像• 在小鼠杰朱努姆的IEL迁移行为。用0.45毫克IgG2b处理的TcrdEGFP小鼠在jejunum中进行延时性生命内显微。• IELl 以绿色显示,核以蓝色显示,流明以红色显示。刻度条,20 μm。帧收集每30秒约30分钟。 电影改编自胡,M.D.等人201815。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
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Discussion
生命体间显微镜技术的发展为观察亚细胞结构的重组提供了前所未有的机会, 25和细胞迁移行为13,14,15,16,26在否则无法进入的纸巾。在体内研究IEL的调节和功能时,普遍缺乏研究工具,因此,生命内成像的使用为分子调控和IEL种群的功能特征13,14,15,16,20。* IELs先前被推定为在肠道黏粘内28静止。然而,进一步分析表明,这些细胞是高度动态的,但迁移速度比淋巴细胞在继发性淋巴器官,由于上皮室13的严格限制。此外,在体内成像的使用提供了对[IEL监测行为的时空动力学,包括IELs和上皮细胞之间驱动[IEL运动和功能13]的串扰的更多见解。14,15,16.分析这种迁移行为为IEL细胞反应定义了新的指标,这些指标在体外或体外实验中无法准确量化。
在整个过程中,必须持续监控鼠标的镇颤水平。持续给药(亚氟兰)可作为氯胺酮/西拉辛的替代品。在进行腹腔切除术时,保持神经血管供应完好无损,以提供生物学的准确评估至关重要。绑住脑血管会导致缺氧和组织逐渐坏死。相反,切断血管会导致出血进入暴露的粘体,这可以减少某些通道在成像过程中的荧光强度。如果 IEL 形成圆角形态并在图像采集期间停止移动,这可能是由于小鼠的体温略有下降。将温度传感器置于显微镜台附近可确保暴露粘部部位的温度保持在 37°C。根据孵化室的温度稳定性,可能需要将温度提高到38~39°C。
一旦小鼠被放置在显微镜阶段,就很难确定由于相邻血管蠕动或收缩而缺乏过度运动的绒带领域。如果发生这种情况,请重新定位鼠标在盘内,或从外部操作鼠标的侧翼,以将绒漏紧密地包装在盖玻上。或者,将鼠标放在舞台上几分钟后,成像场可能会变得更加稳定。如果在采集过程中有逐渐的 XY 漂移,则可以在 4D 渲染软件中使用漂移校正来纠正此问题,为此可以通过选择在整个时间过程中图像的不同位置存在的 4×5 个核并跟踪每个点的位置核。生成"点"后,选择"编辑轨迹"菜单下的"正确漂移"以校正平移漂移。在进行任何其他分析之前,必须执行漂移校正,因为这将改变用于跟踪图像中其他对象的坐标。
虽然双光子激光扫描显微镜允许广泛的成像深度,这是有用的穿透深度到组织29,旋转磁盘激光共聚焦显微镜有其独特的优势,在生命内成像应用。双光子激光扫描显微镜依靠光电倍增管(PMT),一次只能检测一个像素,量子效率为40-50%。相比之下,旋转盘共聚焦激光显微镜使用电子乘法(EM)CCD相机直接检测高达100万像素,从而将量子效率提高到95%。因此,光漂白和光损伤的可能性大大降低,而当成像细胞在更表面的组织中迁移时,采集速度的提高可最大化时间分辨率。无论成像方式如何,此外科手术都非常适合在倒置显微镜上暴露肠道粘部进行成像。
随着表达荧光报告器的小鼠菌株、荧光标记探针或以多种波长生成的微生物荧光菌株的不断增加,这些组合用于评估体内肠道实时响应是无止境的。生命内成像不仅可以对细胞-细胞和宿主-微生物相互作用提供新的认识,而且还可以突出上皮和免疫细胞在静息或病理条件下的动态分子和细胞过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由NIH R21 AI143892、新泽西健康基金会赠款、布施生物医学赠款(KLE)支持。我们感谢马德琳·胡协助编辑手稿并提供代表性结果中显示的数据。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
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