Summary
逆紡糸円盤共焦点顕微鏡によるマウス小腸のインビタルイメージングを用いてGFP標識γΔ IElsを可視化する方法について述べた。この技術は、粘膜内の生細胞の追跡を最大4時間可能にし、腸内免疫上皮相互作用の様々な調査に使用することができる。
Abstract
γδT細胞受容体(γδ IEL)を発現する上皮内リンパ球は、腸上皮の免疫サーベイランスにおいて重要な役割を果たす。γΔT細胞受容体に対する決定的なリガンドの欠如により、γΔ IEL活性化の調節と生体内での機能に関する我々の理解は限られている。このため、γδ IEL機能の調節に関与するシグナル伝達経路と、これらの細胞の局所微小環境への応答性を調知るための代替戦略の開発が必要である。γδ IELは病原体の転移を制限することが広く理解されていますが、インビタルイメージングの使用は、定常状態および侵襲性病原体に応答するIEL/上皮相互作用の時空間的ダイナミクスを理解するために重要です。本明細書では、逆紡糸ディスク共焦点レーザー顕微鏡を用いてGFPγδT細胞レポーターマウスの小腸粘膜におけるIEL移動挙動を可視化するためのプロトコルを提示する。このアプローチの最大イメージング深さは、2光子レーザー走査顕微鏡の使用に比べて制限されていますが、回転ディスク共焦点レーザー顕微鏡検査は、光漂白を低減した高速画像集録の利点を提供し、光の損傷。4D画像解析ソフトウェアを使用して、T細胞監視挙動と隣接細胞との相互作用を実験操作後に解析し、腸粘膜内のIEL活性化と機能に関するさらなる洞察を提供します。
Introduction
上皮内リンパ球(IEL)は腸上皮内に位置し、横細胞間空間1の地下膜と隣接する上皮細胞の間の両方に見出される。5-10上皮細胞ごとに約1つのIELがあります。これらのIELsは、腸上皮バリア2の大きな広がりの免疫監視を提供するセンチネルとして機能する。γΔ T細胞受容体(TCR)を発現するIELは、マウス小腸におけるIEL集団全体の60%までを占める。γΔT細胞欠損マウスの研究は、腸損傷、炎症および感染3、4、5に応答してこれらの細胞の主に保護的役割を示す。Tcrdノックアウトマウス6の生成にもかかわらず、γδ IEL生物学の我々の理解は、γδ TCRによって認識されたリガンドがまだ同定されていないという事実のために、依然として限定的なままである。その結果、この細胞集団を研究するためのツールが不足し、生理的および病理学的条件下でのγΔ TCR活性化および機能の役割を調べることを困難にしている。このギャップを埋めるために、生体イメージング技術を開発し、β(IEL)の移動挙動や近隣腸細胞との相互作用を可視化し、生体内のβIEL機能と外部刺激に対する応答性に関するさらなる洞察を提供する手段として開発しました。
過去10年間にわたり、インビタルイメージングは、上皮細胞脱落8、上皮バリア機能の調節を含む腸生物学の複数の面に関与する分子事象に関する我々の理解を著しく拡大した9 ,10, 明るさ内容の骨髄細胞サンプリング11,12, 宿主微生物相互作用11,13,14,15,16.IEL生物学の文脈では、生体内顕微鏡の使用は、IEL運動の時空間ダイナミクスと、その監視行動を媒振する要因に光を当てた13,14,15, 16.核GFP発現17でβ(IELS)を標識するTcrdH2BeGFP(TcrdEGFP)レポーターマウスの開発により、γΔ Ielsは上皮内で非常に運動性が高く、微生物に反応する独自の監視挙動を示すことを明らかにした。感染17,13,14.最近、細胞質中のGFPを発現する別のβΔT細胞レポーターマウス(Tcrd-GDL)が開発され、細胞全体の可視化を可能にした。同様の方法論は、IEL運動性19、20のダイナミクス上のGタンパク質結合受容体(GPCR)-18および-55などの特定のケモカイン受容体の要件を調査するために使用されてきた。細胞特異的レポーターが存在しない場合、CD8αに対する蛍光共役抗体は、生体内19、20におけるIEL運動性を可視化および追跡するために使用された。2光子レーザースキャニング顕微鏡は、一般的にイントラビタルイメージングに使用されますが、スピニングディスク共焦点レーザー顕微鏡を使用すると、バックグラウンドノイズを最小限に抑えて高速かつ高解像度のマルチチャンネル画像をキャプチャする独自の利点があります。この技術は、腸粘膜の複雑な微小環境内の免疫/上皮相互作用の時空間的ダイナミクスを解明するのに理想的である。さらに、様々なトランスジェニックおよび/またはノックアウトマウスモデルの使用を通じて、これらの研究は腸内免疫および/または上皮細胞機能の分子調節に関する洞察を提供することができる。
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Protocol
すべての研究は、ラトガースニュージャージー医科大学比較医学リソースによって承認されたプロトコルに従って、実験室動物ケア(AALAC)認定施設の評価と認定の協会で行われました。
1. マウスの準備
注:動物の調製と手術を含む次の手順は、手術前に30〜40分かかります, 顕微鏡をオンにし、顕微鏡上の囲まれたインキュベーターを37 °Cにウォームアップ.
- ベルナール・マリッセン(INSERM、パリ、フランス)から得られたC57BL/6バックグラウンドで、8~10週齢のTcrdEGFPマウスに対して実験を行う。IACUC承認の手順によると、動物の体重に基づいてケタミン(120mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)のi.p.注射によってマウスを麻酔する。呼吸率(毎分55〜65呼吸)21、つま先ピンチとパルペブラル反射によって麻酔のレベルを評価します。
- 外科用飛行機麻酔に達したら、直腸温度計で監視できる体温を維持するために、テープを使用してマウスの後ろ足を加熱パッドに固定します。麻酔がすり減っている兆候がある場合(例えば、呼吸数の増加、点滅および/または眼筋のけいれん反応は、マウスが完全に鎮静されるまで一度に50 μLのケタミン/キシラジンを再投与する)。
- 0.9%の生理生理生理の315 μLでホーヒスト33342(10 mg/mL)の50 μLを希釈することによって核色素を調述します。最終的な濃度は、マウスの重量(200 μLおおよその容積)に基づいて37.5 mg/kgです。マウスが麻酔されたら、レトロ軌道静脈洞を通してツベルクリン注射器を用いてホエヒトをゆっくりと注入する。
注:次のステップに進む前に1〜2分待って、マウスがレトロ軌道注入後の循環体積の変化に順応できるようにします。 - 少量の潤滑油を目の上に置き、乾燥を防ぎます。
2. マウス手術:腸粘膜を露出させる腹腔内膜
- 下腹部の中線に沿って皮膚および腹膜を通して2cmの垂直切開を行い、画像化する腸の領域を外部化する。
- 斜めの鉗子を使用して、慎重に精巣腔から盲腸を引き出し、画像化される小腸の領域を特定する。このプロセス中に腸間膜血管を引き裂かないように注意してください。.潜在的な損傷や出血を最小限に抑えるために、鉗子で腸をつかむか、またはつまむのを避けてください。
- 最小限の大腸の内容物を含むイメージングのための小腸(2〜3センチメートル)の適切な領域を見つけます。慎重に盲腸と残りの小腸を精巣腔に戻し、関心のあるセグメントを外部化したままにする。
注:このステップの間に盲腸を穿刺したり、腸間膜血管を破壊することは避けてください。 - 血管間の下の腸間膜の両側に2組の鉗子を置き、鉗子の先端をそっとこすり合わせて膜に穴を開ける(図1)22。これは、腸の下の腹膜腔を閉じるときに針が腸間膜を通過することを可能にします。
- 腸のループを外部化したまま切開部を閉じます。斜めの鉗子と湾曲したテーパーポイント針を5cm縫合に取り付け、腹膜の片側を貫通し、前工程で作られた穴を通り抜け、腹膜裏地の反対側を通る。1つの縫合糸を上部に置き、もう1つは切開部の底部の近くに置きます。
注:このステップ中に血管系を損傷しないようにしてください。 - このプロセスを繰り返して、腸ループの下の皮膚を閉じ、切開の真ん中に1本の縫合糸を置き、下層の下腸膜の前の縫合糸の間に置く。
注:イメージ化する領域だけを外部化することが重要です。これはイメージ投射の間に無関係の動きを減らす。腸間膜動脈を結び付けないようにしてください。 - 電気焼灼を使用して、抗腸間膜境界に沿って穿起のラインを作ります。焼灼直後に、腸の表面に数滴の水を塗布し、熱誘発組織の損傷を防ぎます。残留水を除去するためにキンワイプでブロット。
- Vannasはさみを使用して焼灼組織の遠位端に小さな水平スリットを切断し、粘膜を露出させるために外部組織セグメントの近位端(長さ約1.5cm)に向かって焼灼線の長さに沿って切断に進みます。表面。
注:必要に応じて、鉗子を使用して、露出した粘膜表面に残っている余分な胎児含有量を穏やかに除去します。 - 湿ったキンワイプでマウスの腹部を覆い、組織が脱水するのを防ぎます。覆われた容器の顕微鏡にマウスを運ぶ。
3. スピニングディスク共焦点顕微鏡による画像取得
- HBSSの1 μM AlexaFluor 633のピペット150 μLは、35mm皿の底部を滑り落ちたガラスカバーに入れた。開いた粘膜面がカバースリップに直接接触できるように、マウスを配置します。
- 顕微鏡の頭部を後ろに傾け、あらかじめ温められたインキュベーターでイメージングステージの上にマウスを置きます。または、体温を維持するために加熱毛布でマウスを覆います。
- イメージング ソフトウェアを起動します。各レーザーの励起強度と露光時間は、光の漂白を避け、時間ポイント間の間隔を最小限に抑えるために、それぞれ10-15 mWまたは120〜150ミリ秒を超えてはなりません。フレーム平均を「2」に調整し、EMゲイン機能をオンにしてバックグラウンドノイズを低減します。63xの客観的なキャリブレーションを選択して、ピクセルサイズの正しい測定を確認します。
注:上記の設定は、初期参照を提供することを目的としていますが、個々の顕微鏡構成によって異なります。 - 405 nmレーザーと20倍の空気目的を使用して、顕著な動きや目によるドリフトを欠く絨毛のフィールドを見つけるために核を視覚化します。呼吸、蠕動または心拍によるアーティフィカルな動きの領域を避けてください。
- XYスキャンを用いて、対象分野のXY座標を記録し、グリセロール浸漬63X目的に切り替える。
- 選択したフィールドの villi が、405 nm チャネルで最大 1 分間ライブ イメージを取得して安定していることを確認します。
- 405 nm チャネルでライブイメージを取得する場合は、フォーカスを調整して、ビロス先端のすぐ下にある直交面を見つけます。1.5 μmのステップを使用して、約15〜20 μmの核を解決することが困難になるまで、絨毛先端上皮のすぐ下から始まるZスタックを取得します。
注:上記の露光時間を用いて3チャンネル(405、488、640nm)で撮像する場合、約20秒間隔で3つのチャンネルすべてを順次取得することができる。 - 分析モードでソフトウェアを開き、取得開始後3~5分、画像安定性とβIEL運動性を確認する。ヴィリの各フィールドのための30-60分の画像を取得し続けます。各マウスの 2 ~ 3 つのフィールドを記録します。イメージング中は、マウスを 5 分ごとに監視します。
注:麻酔が摩耗し始める場合は、鉗子を使用してマウスの首をそっと擦り、一度に50 μLのケタミン/キシラジンを投与する。麻酔レベルを監視し、必要に応じて再管理を続けます。 - 1 つのマウスを 4 時間以上イメージすることはお勧めできません。画像取得が完了したら、子宮頸部脱臼によってマウスを犠牲にし、続いて両側気胸を犠牲にする。
4. 4D画像解析
- イメージング ファイルを 4D レンダリング ソフトウェアに直接インポートします。
- IEL とルーメンの個々のサーフェスを作成し、最初の参照として表 1で概説したパラメータを使用して、時間の経過と一度にサーフェスを追跡します。IEL の場合は、指定されたシード ポイントの直径を使用してタッチ オブジェクトを分割します。
- 自己回帰トラッキング アルゴリズムを使用して、IEL 運動性を決定します。トラッキング アルゴリズムは比較的正確ですが、個々の IEL のトラックを視覚的に検査することが不可欠です。トラックが正しくない場合は、[トラックの編集]タブの[切断]機能と[接続]機能を使用してトラックを修正します。
- 各 IEL から内膜までの距離を決定するには、内膜サーフェスを選択し、[ツール]メニューの下で距離変換機能を実行します。プロンプトが表示された場合は、[外部サーフェス]を選択します。計算されると、距離変換は 4 番目のチャネルとして表示されます。
- 4番目のチャネルの強度分をフィルタリングして、横細胞間空間(LIS)内にあるγΔ IElを選択します。この値は、柱上皮セルの高さに基づいて、15 μm に近い値にする必要があります。この範囲内の全βILsの割合は、LISにおけるγδ IElsの頻度として報告される。
- さらに分析を行う場合は、IEL トラック速度、トラックの変位、直線性、トラックの長さなどの統計データをエクスポートします。または、ヴァンテージモジュールを使用してデータを分析します。実験に応じて、取得したデータから、LISまたはIEL/上皮相互作用内の所持ち時間を含む追加のメトリックを取得します。
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Representative Results
TcrdEGFPレポーターマウスのインビタルイメージングを用いて、γδ IElsが動的な監視挙動を示し、地下膜に沿って横細胞間空間(LIS)に移動して上皮をパトロールすることを以前に示した。状態 (図 2、 ムービー 1)
このアプローチは、特定の細胞シグナル伝達経路および/または受容体の阻害がγδ IEL移動挙動にどのように影響するかを評価するためにも使用することができる。例えば、インターロイキン(IL)-15は、γΔ IEL恒常性23、24に不可欠な多発性サイトカインである。IL-2Rβ受容体を介したIL-15シグナル伝達が定常状態でのβIEL運動の運動に寄与するかどうかを決定するために、TcrdEGFPレポーターマウスは、抗IL-2Rβ抗体(TM-β1)またはアイソタイプIgG2b制御の投与後2時間を画像化した。色付きの軌跡は、30分の経過の間に個々のγΔ IElsの移動経路を示す(図3A)。TM-β1(図3A,B)で処置したマウスではLIS中のγΔIElsの頻度は増加したが、これらのγδ IElsの30%以上はアイドリング挙動を示した(図3A、C)。アイドル性γδ IELsは、トラックの直線性とトラック変位長に上限を課すことによって定義された。このアイドリング表現型は、IL-2Rβ遮断後のγΔ IElsの瞬間速度および閉じ込め比の両方において、制御に対する有意な減少によって確認された(図3D,E)。また、遊休γδ IELsは所因時間が長く、LIS内では爬虫類α3(図3F)と比較してより頻繁に局在していた。
図1:鉗子を使用して腸間膜に穴を作る。縫合糸の穴を作成するために、膜の両側に鉗子を置きます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ジェジュナムにおけるγΔ IElsの代表的な3D画像。定常状態でTcrdEGFPレポーターマウスのジェジュナル粘膜を撮影したタイムラプスビデオから1つの時間ポイントを選択した。γδ IElsは緑色、核は白、内膜は赤色で示されています。スケールバー = 30 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:IL-2Rβの阻害は、横細胞間空間におけるγδ IELアイドリングを誘導する。この図は、「上皮IL-15は腸粘膜内のγ上皮リンパ球運動の重要な調節子である」から適応された。 15著作権2018米国免疫学者協会(A)IgG2bまたはTM-β1の0.45mgの0.45mgの治療後、ジジュール上皮内のGFP γδ IElsを移行する経度画像を示すタイムラプス画像。30分の経過に対する個々のβIELs(緑色)の運動性を着色されたトラックで示す。核は白色で示され、内膜は赤で示される。スケールバー = 20 μm. (B) LISにおけるγΔ IElsの頻度(治療あたりn=3マウス、n= 6-7ビデオ)。(C) IgG2b-またはTM-β1処理マウスで遊休したγΔIElsの割合。(D) 瞬間速度 (n = 13,299 および 9,600 時間ポイント)(E) トラックの閉じ込め比率(n = 350 および 278 トラック)が表示されます。(F) 内膜からのアイドルおよびモチルの距離平均+ SEM が表示されます (+)。*p < 0.05, **p < 0.01, #p < 0.0001.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| イエル | ルーメン | |
| 表面の詳細(μm) | 1.2年 | 1.5年 |
| 背景減算 (μm) | 1.67から | 2 |
| シードポイントの直径(μm) | 7.5年 | N/a |
| フィルタ: ボクセル数 | 250名 | 6,500の |
| トラッキング: 最大距離 (μm) | 10歳 | 10歳 |
| トラッキング: 最大ギャップ | 2 | 2 |
表 1: 生成の代表的な設定イマリスの「表面」と発光面これらの設定は、488 nm チャネル (IEL) および 640 nm チャネル (ルーメン) のサーフェスを生成および追跡する際の開始点として使用できます。実験条件によっては、これらの設定を変更する必要がある場合があります。
ムービー 1: GFP のイントラバイタル イメージングマウスジェジュナムにおけるγδ IEL移動挙動IgG2bの0.45mgで処理したTcrdEGFPマウスからのjejunumにおけるβIEL運動性の時間経過インビタル顕微鏡検査。γδ IElsは緑色、青色の核、赤の内膜で示されています。スケールバー、20 μm。フレームは約30分間30秒ごとに収集されたムービーは、Hu, M. D. et al. 201815.このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
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Discussion
生体内顕微鏡技術の開発は、細胞内構造の再編成を観察する前例のない機会を提供している8,9,22, 細胞細胞相互作用12, 25および細胞移動挙動13、14、15、16、26は、そうでなければアクセスできない組織において。生体内18、27のβILsの調節と機能を研究するツールが一般的に欠如しており、その結果、イントラビタルイメージングの使用は、分子調節に関する新たな調査の道を開き、IEL集団の機能特性13,14,15,16,20.γδ IELsは、以前に腸粘膜28内で静止していると推定された。しかし、さらなる分析は、これらの細胞が非常に動的であることを実証したが、上皮室13の狭い閉じ込めによる二次リンパ球器官におけるリンパ球よりもゆっくりと移動する。さらに、インビボイメージングの使用は、γ IELの運動性と機能13を駆動するIELと上皮細胞間のクロストークを含むγΔ IEL監視行動の時空間ダイナミクスに関する追加の洞察を提供しました。14歳,15歳,16.この移動行動の分析は、ex vivoまたはインビトロ実験を使用して正確に定量化できなかったIEL細胞応答の新しい指標を定義しました。
全体の手順を通して、マウスの座り込みレベルを継続的に監視することが不可欠です。ガス麻酔(イソファラン)の連続投与は、ケタミン/キシラジンの代替として使用することができる。腹腔切除を行う場合、生物学の正確な評価を提供するためには、神経血管の供給をそのまま維持することが重要です。腸間膜血管を結び付けると、低酸素症や組織の徐々に壊死を引き起こす可能性があります。対照的に、血管を切断すると、露出した粘膜に出血し、イメージング中にいくつかのチャネルの蛍光強度を低下させることができる。IELsが丸みを帯びた形態を発症し、画像集録中に移動を停止した場合、これはマウスの体温がわずかに低下したためである可能性があります。顕微鏡段階の近くに温度センサーを置くことは露出した粘膜の部位の温度が37 °Cで維持されることを保障する。インキュベーションチャンバの温度安定性に応じて、温度を38~39°Cに引き上げる必要がある場合があります。
マウスを顕微鏡の段階に置くと、隣接する血管の蠕動や収縮による過度の動きに欠ける絨毛の分野を特定することが困難な場合があります。この場合は、皿の中にマウスを置き直すか、マウスの側面を外側に操作して、カバースリップに対してビリルをしっかりと詰め込みます。あるいは、イメージングフィールドは、マウスをステージ上に置いてから数分後に、より安定してもよい。取得中に徐々にXYドリフトがある場合は、4Dレンダリングソフトウェアのドリフト補正を使用して、時間経過を通じて画像の異なる場所に存在する4~5個の核を選択し、それぞれにスポットを追跡することで修正できます。核。スポットが生成されたら、[トラックの編集]メニューの下にある[正しいドリフト]を選択して、翻訳ドリフトを修正します。これは、画像内の他のオブジェクトを追跡するために使用される座標を変更するので、他の解析の前にドリフト補正を行うことを重要です。
2光子レーザー走査顕微鏡は、組織29に深く浸透するのに有用な広い深さのイメージングを可能にするが、回転ディスクレーザー共焦点顕微鏡は、イントラビタルイメージングアプリケーションのための独自の利点を有する。2光子レーザー走査顕微鏡は、40~50%の量子効率で一度に1ピクセルしか検出できない光増倍管(PMT)に依存しています。対照的に、回転ディスク共焦点レーザー顕微鏡は、電子乗算(EM)CCDカメラを使用して、最大100万画素を同時に直接検出するため、量子効率を95%に向上させます。その結果、光漂白や光損傷の可能性が大幅に減少し、獲得速度の向上は、より表面的な組織で細胞の移動をイメージングする際の時間分解能を最大化します。イメージ投射の様式にかかわらず、この外科的処置は反転した顕微鏡でイメージ投射のための腸粘膜を露出させるための理想的である。
蛍光レポーターを発現するマウス株の入手可能性の増加に伴い、多数の波長で生成された微生物の蛍光標識プローブまたは蛍光株は、その組み合わせを生体内腸内で評価する。リアルタイムでの応答は無限大です。インビタルイメージングは、細胞と宿主微生物の相互作用に関する新しい洞察を提供できるだけでなく、恒法状態または病理学的条件下で上皮細胞と免疫細胞の両方で動的な分子および細胞プロセスを強調することができます。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、NIH R21 AI143892、ニュージャージー州保健財団助成金、ブッシュバイオメディカルグラント(KLE)によってサポートされています。私たちは、原稿を編集し、代表的な結果に示されたデータを提供する彼女の支援のためにマドレーヌHuに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
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