Summary
Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.
Abstract
Los linfocitos intraepiteliales que expresan el receptor de células T (IEL) desempeñan un papel clave en la vigilancia inmune del epitelio intestinal. Debido en parte a la falta de un ligando definitivo para el receptor de células T, nuestra comprensión de la regulación de la activación de IEL y su función in vivo sigue siendo limitada. Esto requiere el desarrollo de estrategias alternativas para interrogar las vías de señalización implicadas en la regulación de la función IEL y la capacidad de respuesta de estas células al microambiente local. A pesar de que se entiende que los IEL limitan la translocación de patógenos, el uso de imágenes intravitales ha sido fundamental para comprender la dinámica espaciotemporal de las interacciones IEL/epiteliales en estado estacionario y en respuesta a patógenos invasivos. En este documento, presentamos un protocolo para visualizar el comportamiento migratorio de IEL en la pequeña mucosa intestinal de un ratón reportero de células T de GFP utilizando microscopía láser confocal de disco giratorio invertido. Aunque la profundidad máxima de imagen de este enfoque se limita en relación con el uso de microscopía de escaneo láser de dos fotones, la microscopía láser confocal de disco giratorio proporciona la ventaja de la adquisición de imágenes de alta velocidad con fotoblanqueo reducido y Fotodaño. Usando el software de análisis de imágenes 4D, el comportamiento de vigilancia de células T y sus interacciones con las células vecinas se pueden analizar después de la manipulación experimental para proporcionar información adicional sobre la activación y la función de IEL dentro de la mucosa intestinal.
Introduction
Los linfocitos intraepiteliales (IEL) se encuentran dentro del epitelio intestinal, y se encuentran tanto a lo largo de la membrana del sótano como entre las células epiteliales adyacentes en el espacio intercelular lateral1. Hay aproximadamente un IEL por cada 5-10 células epiteliales; estos IEL sirven como centinelas para proporcionar vigilancia inmune de la granextensión de la barrera epitelial intestinal 2. Los IEL que expresan el receptor de células T (TCR) comprenden hasta el 60% de la población total de IEL en el intestino delgado murino. Los estudios realizados en ratones con deficiencia de células T demuestran un papel en gran medida protector de estas células en respuesta a lesiones intestinales, inflamación e infección3,4,5. A pesar de la generación del ratón noqueador Tcrd 6, nuestra comprensión de la biología de IEL sigue siendo limitada debido en parte al hecho de que los ligandos reconocidos por el TCR aún no se han identificado7. Como resultado, la falta de herramientas para estudiar esta población celular ha dificultado la investigación del papel de la activación y la función de la TCR en condiciones fisiológicas y patológicas. Para llenar este vacío, hemos desarrollado técnicas de imagen en vivo para visualizar el comportamiento migratorio de IEL y las interacciones con los enterocitos vecinos como un medio para proporcionar información adicional sobre la función y la capacidad de respuesta de IEL a los estímulos externos in vivo.
Durante la última década, la imagen intravital ha ampliado significativamente nuestra comprensión de los eventos moleculares involucrados en múltiples facetas de la biología intestinal, incluyendo el desprendimiento de células epiteliales8, la regulación de la función de barrera epitelial9 ,10, muestreo de células mieloides de contenidos luminales11,12, e interacciones host-microbio11,13,14,15,16 . En el contexto de la biología IEL, el uso de la microscopía intravital ha arrojado luz sobre la dinámica espaciotemporal de la motilidad IEL y los factores que median su comportamiento de vigilancia13,14,15, 16. El desarrollo de los ratones reportero tcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), que etiqueta los IEL por la expresión17de la FPG nuclear, reveló que los IEL son altamente motiles dentro del epitelio y exhiben un comportamiento de vigilancia único que responde a los microbianos infección17,13,14. Recientemente, se desarrolló otro ratón de reportero de células T (Tcrd-GDL) que expresa GFP en el citoplasma para permitir la visualización de toda la celda18. Se ha utilizado una metodología similar para investigar el requisito de receptores específicos de quimiocina, como el receptor acoplado a proteínas G (GPCR)-18 y -55, sobre la dinámica de la motilidad IEL19,20. En ausencia de un reportero específico de la célula, se utilizaron anticuerpos fluorescentes conjugados contra CD8 para visualizar y rastrear la motilidad de IEL in vivo19,20. Aunque la microscopía de escaneo láser de dos fotones se utiliza comúnmente para imágenes intravitales, el uso de la microscopía láser confocal de disco giratorio proporciona ventajas únicas para capturar imágenes multicanal de alta velocidad y alta resolución con un mínimo ruido de fondo. Esta tecnología es ideal para dilucidar la dinámica espaciotemporal de las interacciones inmunes/epiteliales dentro del complejo microambiente de la mucosa intestinal. Además, mediante el uso de varios modelos de ratón transgénicos y/o knockout, estos estudios pueden proporcionar información sobre la regulación molecular de la función intestinal inmune y/o epitelial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los estudios se llevaron a cabo en una instalación acreditada por la Asociación de Evaluación y Acreditación de Cuidado Animal de Laboratorio (AALAC) de acuerdo con protocolos aprobados por Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.
1. Preparación del ratón
NOTA: El siguiente procedimiento, incluyendo la preparación y cirugía de animales, tomará de 30 a 40 minutos antes de la cirugía, encender el microscopio y calentar la incubadora encerrada en el microscopio a 37 oC.
- Realizar experimentos en ratones TcrdEGFP de 8-10 semanas de edad sobre un fondo C57BL/6, que se obtuvieron de Bernard Malissen (INSERM, París, Francia). Según el procedimiento aprobado por la IACUC, anestesiar el ratón mediante la inyección i.p. de ketamina (120 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) en función del peso del animal. Evaluar el nivel de anestesia por frecuencia respiratoria (55–65 respiraciones por minuto)21,pellizco de dedo del pie y reflejo palpebral.
- Una vez alcanzada la anestesia del plano quirúrgico, asegure las patas traseras del ratón usando cinta adhesiva a una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal, que puede ser monitoreada por el termómetro rectal. Si hay signos de que la anestesia se está desgastando (por ejemplo, aumento de la frecuencia de respiración, parpadeo y/o respuesta de espasmo muscular ocular al reflejo palpebral), vuelva a administrar 50 ml de ketamina/xilazina a la vez hasta que el ratón esté completamente sedado.
- Preparar el tinte nuclear diluyendo 50 ml de Hoechst 33342 (10 mg/ml) con 315 ml de salina al 0,9%; la concentración final es de 37,5 mg/kg en función del peso del ratón (200 ml de volumen aproximado). Una vez anestesiado el ratón, inyecte lentamente el Hoechst con una jeringa de tuberculina a través del seno venoso retroorbital.
NOTA: Espere de 1 a 2 minutos antes de continuar con el siguiente paso para permitir que el ratón se aclimate al cambio en el volumen circulante después de la inyección retro-orbital. - Coloque una pequeña cantidad de lubricante sobre los ojos para evitar que se sequen.
2. Cirugía del ratón: Laparotomía para exponer la mucosa intestinal
- Hacer una incisión vertical de 2 cm a través de la piel y el peritoneo a lo largo de la línea media de la parte inferior del abdomen para externalizar la región del intestino a ser imágena.
- Usando fórceps en ángulo, saque cuidadosamente el cecum de la cavidad peritoneal e identifique el área del intestino delgado que se va a tomar imágenes. Tenga cuidado de no desgarrar los vasos sanguíneos mesentéricos durante este proceso. Para minimizar el daño potencial o el sangrado, evita agarrar o pellizcar el intestino con los fórceps.
- Localice una región adecuada del intestino delgado (2-3 cm) para la toma de imágenes que contenga un contenido fecal mínimo. Devuelva cuidadosamente el cecum y el intestino delgado restante a la cavidad peritoneal, dejando el segmento de interés externalizado.
NOTA: Evite puncturing el cecum o interrumpir la vasculatura mesentérica durante este paso. - Coloque dos pares de fórceps a ambos lados del mesenteria subyacente entre los vasos sanguíneos, y frote suavemente las puntas de los fórceps para crear un agujero en la membrana (Figura1)22. Esto permitirá que la aguja pase a través del mesentery al cerrar la cavidad peritoneal debajo del intestino.
- Cierre la incisión mientras mantiene el lazo del intestino externalizado. Usando fórceps en ángulo y una aguja curvada de punto cónico unida a una sutura de 5 cm, penetrar un lado del peritoneo, pasar por el agujero hecho en el paso anterior, y hacia arriba a través del otro lado del revestimiento peritoneal. Coloque una sutura en la parte superior y otra cerca de la parte inferior de la incisión.
NOTA: Evite dañar la vasculatura durante este paso. - Repita este proceso para cerrar la piel debajo del lazo intestinal, colocando una sutura en el centro de la incisión, entre las suturas anteriores en el peritoneo subyacente.
NOTA: Es importante sólo externalizar el área que se va a crear una imagen; esto reducirá el movimiento extraño durante la toma de imágenes. Asegúrese de evitar atir las arterias mesentéricas. - Utilice una electrocauterización para hacer una línea de perforación a lo largo del borde antimestérico. Inmediatamente después de la cauterización, aplicar unas gotas de agua en la superficie del intestino para evitar daños adicionales en el tejido inducido por el calor. Blot con un Kimwipe para eliminar el agua residual.
- Cortar una pequeña hendidura horizontal en el borde distal del tejido cauterizado usando tijeras Vannas y proceder a cortar a lo largo de la longitud de la línea cauterizada hacia el extremo proximal del segmento de tejido externalizado (aproximadamente 1,5 cm de longitud) para exponer la mucosa Superficie.
NOTA: Si es necesario, utilice fórceps para eliminar suavemente cualquier exceso de contenido fecal que quede en la superficie de la mucosa expuesta. - Cubra el abdomen del ratón con un Kimwipe húmedo para evitar que el tejido se deshidrate. Transporte el ratón al microscopio en un recipiente cubierto.
3. Adquisición de imágenes por microscopía confocal de disco giratorio
- Pipetear 150 l de AlexaFluor 633 de 1 m en HBSS en la parte inferior de vidrio de un plato de 35 mm. Coloque el ratón de modo que la superficie mucosa abierta entre directamente en contacto con el cubreobjetos.
- Incline la cabeza del microscopio hacia atrás y coloque el ratón sobre el plato tapado en la etapa de imagen en una incubadora precalentada. Alternativamente, cubra el ratón con una manta calefactora para mantener la temperatura corporal.
- Inicie el software de imágenes. La intensidad de excitación y el tiempo de exposición de cada láser no deben superar los 10-15 mW o 120–150 ms, respectivamente, para evitar el fotoblanqueo y minimizar el intervalo entre puntos de tiempo. Ajuste el promedio del fotograma a "2" y active la función de ganancia EM para reducir el ruido de fondo. Seleccione la calibración de objetivos 63x para garantizar la medición correcta del tamaño de píxel.
NOTA: Los ajustes detallados anteriormente están destinados a proporcionar una referencia inicial, pero variarán dependiendo de las configuraciones individuales del microscopio. - Usando el láser de 405 nm y el objetivo de aire 20x, visualice los núcleos para localizar un campo de vellosidades que carecen de movimiento notable o deriva a la vista. Evite áreas de movimiento artifreal debido a la respiración, la peristalsis o los latidos del corazón.
- Con el escaneo XY, registre la coordenada XY del campo de interés y cambie al objetivo de inmersión en glicerol 63X.
- Confirme que las vellosidades en el campo seleccionado son estables mediante la adquisición de una imagen en vivo en el canal de 405 nm durante un máximo de 1 min.
- Mientras adquiere una imagen en vivo en el canal de 405 nm, ajuste el enfoque para encontrar el plano ortogonal justo debajo de la punta villa. Adquirir pilas Z a partir del epitelio de la punta villosa por las vellosidades hasta que sea difícil resolver los núcleos, alrededor de 15-20 m, usando un paso de 1,5 m.
NOTA: Cuando las imágenes con tres canales (405, 488, 640 nm) utilizan los tiempos de exposición descritos anteriormente, es posible adquirir los tres canales secuencialmente a intervalos de aproximadamente 20 s. - Abra el software en modo de análisis, 3-5 minutos después de comenzar la adquisición, para confirmar la estabilidad de la imagen y la motilidad de IEL. Continúe adquiriendo imágenes durante 30-60 min para cada campo de vellosidades. Registre de 2 a 3 campos para cada ratón. Durante la toma de imágenes, monitoree el ratón cada 5 minutos.
NOTA: Si la anestesia comienza a desaparecer, utilice fórceps para estrujera suavemente el cuello del ratón para administrar 50 s de ketamina/xilazina a la vez. Continúe monitoreando los niveles de anestesia y vuelva a administrar los niveles de anestesia cuando sea necesario. - No es aconsejable crear una imagen de un solo ratón durante más de 4 h. Una vez completada la adquisición de la imagen, sacrificar a los ratones por dislocación cervical seguida de neumotórax bilateral.
4. Análisis 4D de imágenes
- Importe directamente archivos de imágenes al software de renderizado 4D.
- Cree superficies individuales para IEL y lumen y, a continuación, realice un seguimiento de las superficies a lo largo del tiempo utilizando los parámetros descritos en la Tabla 1 como referencia inicial. Para los IEL, habilite Dividir objetos táctiles utilizando el diámetro de punto de semilla indicado.
- Utilice el algoritmo de seguimiento autoregresivo para determinar la motilidad de IEL. Aunque el algoritmo de seguimiento es relativamente preciso, es imperativo inspeccionar visualmente las pistas para cada IEL individual. Si una pista es incorrecta, corríjala con las funciones Desconectar y Conectar en la pestaña Editar pistas.
- Para determinar la distancia de cada IEL al lumen, seleccione la superficie de lumen y realice la función Transformación de distancia en el menú Herramienta. Cuando se le solicite, seleccione Superficie exterior. Una vez calculada, la transformación de distancia se mostrará como el 4o canal.
- Filtre el min de Intensidad del 4o canal para seleccionar los IEL que se encuentran dentro del espacio intercelular lateral (LIS). Este valor debe ser cercano a 15 m, en función de la altura de una célula epitelial columnar. El porcentaje de los IEL totales dentro de este rango se notifica como la frecuencia de los IEL en el LIS.
- Para un análisis posterior, exporte datos estadísticos que incluyen: velocidad de la pista IEL, desplazamiento de la pista, recto de la pista y longitud de la pista. Alternativamente, analice los datos utilizando el módulo Vantage. Dependiendo del experimento, obtenga métricas adicionales de los datos adquiridos, incluido el tiempo de permanencia dentro de las interacciones LIS o IEL/epitelial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando imágenes intravitales de ratones reporteros tcrdEGFP, hemos demostrado previamente que los IEL exhiben un comportamiento dinámico de vigilancia, en el que patrullan el epitelio migrando a lo largo de la membrana del sótano y hacia el espacio intercelular lateral (LIS) en constante estado (Figura 2, Película 1).
Este enfoque también se puede utilizar para evaluar cómo la inhibición de las vías de señalización celular específicas y/o los receptores influye en el comportamiento migratorio de IEL. Por ejemplo, la interleucina (IL)-15 es una citoquina pleiotrópica que es esencial para la homeostasis IEL23,24. Para determinar si la señalización DE IL-15 a través del receptor IL-2R contribuye a la cinética de la motilidad de IEL en estado estacionario, los ratones reportero de TcrdEGFP fueron imágenes 2 h después de la administración de anticuerpos anti-IL-2R (TM-1) o control de isotipo IgG2b. Las vías de color indican las rutas migratorias de los IEL individuales en el transcurso de 30 min (Figura3A). Aunque la frecuencia de los IEL en el LIS se incrementó en ratonestratados con TM-1 (Figura3A, B), más del 30% de estos IEL mostraron un comportamiento de ralentí (Figura3A,C). Los IEL inactivos se definieron imponiendo límites superiores a la recta indirecto de la pista y a la longitud del desplazamiento de la vía. Este fenotipo en ralentí se ha confirmado mediante una reducción significativa tanto de la velocidad instantánea como de la relación de confinamiento de los IEL que siguen al bloqueo IL-2R en relación con el control (Figura3D,E). Además, los IEL inactivos tienen tiempos de permanencia más largos y se localizaron con más frecuencia dentro del LIS en comparación con los IEL móviles (Figura3F).
Figura 1: Uso de fórceps para crear un agujero en el mesentery. Coloque fórceps a ambos lados de la membrana para crear un agujero para las suturas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen 3D representativa de los IEL en el yunque. Un único punto de tiempo fue seleccionado de un video de lapso de tiempo tomado de la mucosa jejunal de un ratón reportero TcrdEGFP en estado estacionario. Los IEL se muestran en verde, los núcleos en blanco y el lumen en rojo. Barra de escala a 30 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La inhibición de IL-2R tm induce el ralentí IEL en el espacio intercelular lateral. Esta figura ha sido adaptada de "Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of á Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa." por Hu, M. D. et al. 2018, J Immunol, 201 (2), p. 747-756. 15 Copyright 2018 de la Asociación Americana de Inmunologistas, Inc. (A) Imágenes de lapso de tiempo que muestran la migración de IEL de GFP dentro del epitelio villoso jejunal después del tratamiento de 2 horas con 0,45 mg de IgG2b o TM-1. La motilidad de los IEL individuales (verde) en el transcurso de 30 min se muestran con pistas de colores. Los núcleos se muestran en blanco, y el lumen se muestra en rojo. Barras de escala a 20 m. (B) Frecuencia de los IEL en el LIS (n 3 ratones por tratamiento, n a 6-7 vídeos). (C) Porcentaje de IEL que estaban inactivos en ratones tratados con IgG2b o TM-1. (D) Velocidad instantánea (n a 13.299 y 9.600 puntos de tiempo). (E) Se muestran las relaciones de confinamiento de pista (n a 350 y 278 pistas). (F) Distancia de los Ili en reposo y en el móvil desde el lumen. Se muestra la media + SEM (+). *p < 0.05, **p < 0.01, #p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Iel | Lumen | |
| Detalle de la superficie (m) | 1.2 | 1.5 |
| Resta de fondo (m) | 1.67 | 2 |
| Diámetro de los puntos de semilla (m) | 7.5 | N/A |
| Filtro: número de vóxeles | 250 | 6.500 |
| Seguimiento: distancia máxima (m) | 10 | 10 |
| Seguimiento: brecha máxima | 2 | 2 |
Tabla 1: Ajustes representativos para generar • IEL y "Superficies" luminosas en Imaris. Estos ajustes se pueden utilizar como punto de partida al generar y rastrear superficies del canal de 488 nm (IEL) y del canal de 640 nm (lumen). Dependiendo de las condiciones experimentales, es posible que sea necesario modificar estos ajustes.
Película 1: Imágenes intravitales de GFP • Comportamiento migratorio de IEL en el jejunum del ratón. Microscopía intravital de lapso de tiempo de motilidad IEL en jejunum a partir de un ratón TcrdEGFP tratado con 0,45 mg de IgG2b. Los IEL se muestran en verde, núcleos en azul y el lumen en rojo. Barra de escala, 20 m. Los marcos fueron recogidos cada 30 s durante aproximadamente 30 min. Película está adaptada de Hu, M. D. et al. 201815. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El desarrollo de técnicas de microscopía intravital ha proporcionado una oportunidad sin precedentes para observar la reorganización de las estructuras subcelulares8,9,22, interacciones célula-célula12, 25 y comportamiento migratorio celular13,14,15,16,26 en tejidos inaccesibles. Se ha producido una falta general de herramientas para estudiar la regulación y la función de los IEL in vivo18,27, y como resultado, el uso de imágenes intravitales ha abierto nuevas vías de investigación con respecto a la regulación molecular y características funcionales de las poblaciones IEL13,14,15,16,20. Antes se suponía que los IEL eran estacionarios dentro de la mucosa intestinal28. Sin embargo, otros análisis demostraron que estas células son altamente dinámicas, pero migran más lentamente que los linfocitos en órganos linfoides secundarios debido a los estrechos confines del compartimiento epitelial13. Por otra parte, el uso de imágenes in vivo ha proporcionado información adicional sobre la dinámica espaciotemporal del comportamiento de vigilancia de IEL, incluida la interrelación entre los IEL y las células epiteliales que impulsa la motilidad y la función13de IEL, 14 , 15 , 16. El análisis de este comportamiento migratorio ha definido nuevas métricas para las respuestas celulares IEL que no habrían sido cuantificables con precisión mediante experimentos ex vivo o in vitro.
A lo largo de todo el procedimiento, es esencial monitorear continuamente el nivel de sedación del ratón. La administración continua de anestesia de gas (isoflurano) se puede utilizar como alternativa a la ketamina/xilazina. Al realizar la laparotomía, es fundamental mantener el suministro neurovascular intacto para proporcionar una evaluación precisa de la biología. Amarre los vasos sanguíneos mesentéricos puede provocar hipoxia y necrosis gradual del tejido. Por el contrario, la separación de los vasos sanguíneos dará lugar a sangrado en la mucosa expuesta, lo que puede reducir la intensidad de la fluorescencia de algunos canales durante la toma de imágenes. Si los IEL desarrollan una morfología redondeada y dejan de moverse durante la adquisición de la imagen, esto puede deberse a una ligera disminución de la temperatura corporal del ratón. La colocación del sensor de temperatura cerca de la etapa del microscopio garantiza que la temperatura en el sitio de la mucosa expuesta se mantenga a 37 oC. Puede ser necesario elevar la temperatura a 38–39 oC dependiendo de la estabilidad de la temperatura de la cámara de incubación.
Una vez que el ratón se ha colocado en la etapa del microscopio, puede ser difícil identificar campos de vellosidades que carecen de movimiento excesivo debido a la peristalsis o contracción de los vasos sanguíneos adyacentes. Si esto ocurre, cambie la posición del ratón dentro del plato o manipule los flancos del ratón externamente en un esfuerzo por empacar las vellosidades contra el cubreobjetos. Alternativamente, el campo de imágenes puede volverse más estable unos minutos después de colocar el ratón en el escenario. Si hay una deriva XY gradual durante la adquisición, esto se puede corregir mediante la corrección de deriva en el software de renderizado 4D seleccionando 4-5 núcleos que están presentes en diferentes ubicaciones de la imagen a lo largo del curso de tiempo y rastreando un spot para cada Núcleo. Una vez generados los puntos, seleccione Corregir deriva en el menú Editar pista para corregir la deriva traslacional. Es importante que la corrección de deriva se realice antes de cualquier otro análisis, ya que esto alterará las coordenadas utilizadas para rastrear otros objetos de la imagen.
Aunque la microscopía de escaneo láser de dos fotones permite una amplia profundidad de imagen que es útil para penetrar profundamente en los tejidos29,la microscopía confocal láser de disco giratorio tiene sus propias ventajas únicas para aplicaciones de imágenes intravitales. La microscopía de escaneo láser de dos fotones se basa en tubos fotomultiplicadores (PMT) que pueden detectar solo un píxel a la vez con una eficiencia cuántica de 40-50%. Por el contrario, la microscopía láser confocal de disco giratorio utiliza una cámara CCD de multiplicación de electrones (EM) para detectar directamente hasta un millón de píxeles simultáneamente, aumentando así la eficiencia cuántica al 95%. Como resultado, el potencial de fotoblanqueo y fotodaño se reduce significativamente, mientras que el aumento de la velocidad de adquisición maximiza la resolución temporal cuando la migración celular por imágenes en tejidos más superficiales. Independientemente de la modalidad de imagen, este procedimiento quirúrgico es ideal para exponer la mucosa intestinal para la toma de imágenes en un microscopio invertido.
Con la creciente disponibilidad de cepas de ratón que expresan reporteros fluorescentes, sondas etiquetadas fluorescentes o cepas fluorescentes de microorganismos que se han generado en una multitud de longitudes de onda, las combinaciones para evaluar in vivo intestinal respuestas en tiempo real son infinitas. Las imágenes intravitales no solo pueden proporcionar una visión novedosa de las interacciones de células celulares y de microbios del huésped, sino que también pueden resaltar los procesos moleculares y celulares dinámicos en células epiteliales e inmunitarias en condiciones homeosticas o patológicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo de NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Agradecemos a Madeleine Hu por su ayuda en la edición del manuscrito y el suministro de los datos que se muestran en los resultados representativos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
