Summary
We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.
Abstract
Epitheliale lymfocyten uiten γδ T Cell receptor (γδ IEL) spelen een belangrijke rol in het immuunsysteem surveillance van het intestinale epitheel. Deels door het ontbreken van een definitief ligand voor de γδ T-cel receptor, blijft ons begrip van de regulatie van γδ IEL activering en hun functie in vivo beperkt. Dit vereist de ontwikkeling van alternatieve strategieën te ondervragen signalering trajecten die betrokken zijn bij de regulering van γδ IEL functie en de responsiviteit van deze cellen aan de lokale microenvironment. Hoewel γδ IELs op grote schaal worden begrepen om pathogeen translocatie te beperken, het gebruik van intravital Imaging is van cruciaal belang voor het begrijpen van de spatiotemporal dynamiek van IEL/epitheel interacties op Steady-State en in reactie op invasieve pathogenen. Hierin presenteren we een protocol voor het visualiseren van IEL trekgedrag in de kleine intestinale mucosa van een GFP γδ T Cell reporter muis met omgekeerde spinnen schijf confocale laser microscopie. Hoewel de maximale Imaging diepte van deze aanpak is beperkt ten opzichte van het gebruik van twee-foton laser-scanning microscopie, spinnen schijf confocale laser microscopie biedt het voordeel van hoge snelheid Beeldacquisitie met verminderde foto bleken en photodamage. Met behulp van 4D beeldanalyse software, T Cell surveillance gedrag en hun interacties met naburige cellen kunnen worden geanalyseerd na experimentele manipulatie om extra inzicht te geven in IEL activering en functie binnen de intestinale mucosa.
Introduction
Epitheliale lymfocyten (IEL) bevinden zich binnen het intestinale epitheel, en worden gevonden zowel langs de kelder membraan en tussen aangrenzende epitheelcellen in de laterale intercellulaire ruimte1. Er is ongeveer één IEL voor elke 5-10 epitheelcellen; Deze IELs dienen als Sentinels om immuun toezicht van de grote uitgestrektheid van de intestinale epitheel barrière2te bieden. IELs het uitdrukken van de γδ T Cell receptor (TCR) bestaat uit tot 60% van de totale IEL populatie in de muizen dunne darm. Studies in γδ T-cel-gebrekkige muizen tonen een grotendeels beschermende rol van deze cellen in reactie op intestinale verwonding, ontsteking en besmetting3,4,5. Ondanks de generatie van de Tcrd knock-out muis6, ons begrip van γδ iel biologie blijft beperkt te wijten aan het feit dat liganden erkend door de γδ TCR nog moeten worden geïdentificeerd7. Dientengevolge, heeft het gebrek aan hulpmiddelen om deze cel bevolking te bestuderen het moeilijk gemaakt om de rol van γδ TCR activering en functie onder fysiologische en pathologische voorwaarden te onderzoeken. Om dit gat te vullen, hebben wij levende beeldvormingstechnieken ontwikkeld om γδ IEL migrerend gedrag en interactie met naburige enterocyten als middel te visualiseren om extra inzicht in γδ IEL functie en ontvankelijkheid aan externe stimuli in vivo te verstrekken.
In de afgelopen tien jaar heeft intravital Imaging aanzienlijk uitgebreid ons begrip van de moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij meerdere facetten van intestinale biologie, met inbegrip van epitheelcellen afstoten8, regulering van de epitheel barrièrefunctie9 ,10, myeloïde Cell bemonstering van Luminale inhoud11,12, en gastheer-microbe interacties11,13,14,15,16 . In het kader van de iel biologie heeft het gebruik van intravital microscopie licht geworpen op de spatiotemporal dynamiek van iel beweeglijkheid en de factoren die hun surveillance gedrag bemiddelen13,14,15, 16. De ontwikkeling van TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) reporter muizen, die labels γδ IELs door nucleaire GFP expressie17, bleek dat γδ IELs zijn zeer beweeglijke binnen het epitheel en vertonen een unieke surveillance gedrag dat reageert op microbiële besmetting17,13,14. Onlangs, werd een andere γδ T Cell reporter muis ontwikkeld (Tcrd-gdl) die GFP in het cytoplasma uitdrukt om visualisatie van volledige cel18toe te staan. Gelijkaardige methodologie is gebruikt om de eis van specifieke chemokinen receptoren, zoals G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR)-18 en-55, op de dynamica van iel beweeglijkheid19,20te onderzoeken. Bij afwezigheid van een cel-specifieke verslaggever, fluorescerende geconjugeerde antilichamen tegen CD8α werden gebruikt om te visualiseren en te volgen iel beweeglijkheid in vivo19,20. Hoewel twee-foton laser scanning microscopie wordt vaak gebruikt voor intravital Imaging, het gebruik van spinnen schijf confocale laser microscopie biedt unieke voordelen voor hoge snelheid en High-Resolution Multi-Channel beelden vast te leggen met een minimale achtergrondruis. Deze technologie is ideaal om de spatiotemporal dynamiek van immuun/epitheel interacties in het complexe micromilieu van het intestinale slijmvlies te verhelderen. Bovendien, door het gebruik van verschillende transgene en/of knock-out muismodellen, deze studies kunnen inzicht geven in de moleculaire regulatie van intestinale immuun-en/of epitheelcellen functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studies werden uitgevoerd in een vereniging van de beoordeling en accreditatie van laboratorium Animal Care (AALAC)-geaccrediteerd faciliteit volgens protocollen goedgekeurd door de Rutgers New Jersey Medical School vergelijkende geneeskunde middelen.
1. muis voorbereiding
Opmerking: De volgende procedure, met inbegrip van dierlijke voorbereiding en chirurgie, duurt 30 tot 40 min. voorafgaand aan de operatie, zet de Microscoop en warming-up van de bijgevoegde incubator op de Microscoop tot 37 ° c.
- Voer experimenten uit op 8 – 10 weken oud TcrdEGFP muizen op een C57BL/6 achtergrond, die werden verkregen van Bernard Malissen (INSERM, Parijs, Frankrijk). Volgens dec-goedgekeurde procedure, verdoven de muis door i.p. injectie van ketamine (120 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) die op het gewicht van het dier wordt gebaseerd. Evalueer het niveau van anesthesie door ademhalingstarief (55-65 ademhalingen per minuut)21, Teen snuifje en palpebrale reflex.
- Zodra chirurgische vliegtuig anesthesie is bereikt, veilig de achterpoten van de muis met behulp van tape om een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te handhaven, die kan worden gecontroleerd door rectale thermometer. Als er tekenen zijn dat de anesthesie is het dragen van uit (bijv. verhoogde ademhalingssnelheid, knipperen en/of ogen spier twitching reactie op palpebrale reflex), opnieuw te beheren 50 l van ketamine/xylazine op een moment totdat de muis is volledig verdoofd.
- Bereid de nucleaire kleurstof door verdunning 50 µ L van Hoechst 33342 (10 mg/mL) met 315 µ L van 0,9% zoutoplossing; de uiteindelijke concentratie is 37,5 mg/kg op basis van het gewicht van de muis (200 µ L benaderende volume). Zodra de muis is verdoofd, langzaam injecteren van de Hoechst met behulp van een tuberculinespuit door de retro-orbitale veneuze sinus.
Opmerking: Wacht 1 – 2 min alvorens over te gaan tot de volgende stap om de muis te acclimatiseren aan de verandering in Circulerend volume na retro-orbitale injectie. - Plaats een kleine hoeveelheid smeermiddel over de ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen.
2. muis chirurgie: laparotomie om intestinale mucosa bloot
- Maak een 2 cm verticale incisie door de huid en het buikvlies langs de middellijn van de onderbuik te externaliseren de regio van de darm te worden afgebeeld.
- Met behulp van schuine Tang, voorzichtig Trek de blindedarm uit de buikholte en Identificeer het gebied van de dunne darm te worden afgebeeld. Wees voorzichtig niet te scheuren mesenterica bloedvaten tijdens dit proces. Om potentiële schade of bloeden te minimaliseren, te voorkomen grijpen of knijpen de darm met de Tang.
- Bepaal de plaats van een geschikte streek van dunne darm (2-3 cm) voor weergave die minimale fecale inhoud bevat. Voorzichtig terug de blindedarm en de resterende dunne darm in de buikholte, terwijl het verlaten van het segment van de rente extern.
Opmerking: Vermijd prikken de blindedarm of het onderbreken van de mesenterica vasculatuur tijdens deze stap. - Plaats twee paren van een tang aan beide zijden van de onderliggende mesenterium tussen de bloedvaten, en wrijf de uiteinden van de Tang samen om een gat in het membraan te maken (Figuur 1)22. Hierdoor kan de naald door de mesenterium gaan bij het sluiten van de buikholte onder de darm.
- Sluit de incisie terwijl het houden van de lus van de darm extern. Met behulp van schuine Tang en een gebogen, spitse punt naald bevestigd aan een 5 cm hechting, doordringen een kant van het buikvlies, ga door het gat gemaakt in de vorige stap, en omhoog door de andere kant van het buikvlies voering. Plaats een hechtdraad aan de bovenkant, en een andere in de buurt van de onderkant van de incisie.
Opmerking: Voorkom beschadiging van de vasculatuur tijdens deze stap. - Herhaal dit proces om de huid te sluiten onder de intestinale lus, door het plaatsen van een hechting in het midden van de incisie, tussen de vorige hechtingen in de onderliggende peritoneum.
Opmerking: Het is belangrijk om alleen externaliseren het gebied dat moet worden afgebeeld; Dit zal verminderen vreemde beweging tijdens de beeldvorming. Zorg ervoor om te voorkomen dat koppelverkoop van de mesenterica slagaders. - Gebruik een elektrocauterisatie om een lijn van perforatie langs de anti-mesenterica grens te maken. Onmiddellijk na cauterisatie, breng een paar druppels water op het oppervlak van de darm om extra warmte-geïnduceerde beschadiging van het weefsel te voorkomen. Blot met een Kimwipe om residueel water te verwijderen.
- Snijd een kleine horizontale spleet aan de distale rand van de dichtgeschroeid weefsel met behulp van Vannas schaar en ga verder te snijden langs de lengte van de dichtgeschroeid lijn in de richting van de proximale einde van het uitgesneden weefsel segment (ongeveer 1,5 cm in lengte) om het slijmvlies bloot Oppervlak.
Opmerking: Indien nodig, gebruik een tang om voorzichtig te verwijderen overtollige fecale inhoud resterende op de blootgestelde mucosale oppervlak. - Bedek de buik van de muis met een vochtige Kimwipe om te voorkomen dat het weefsel van steeds uitgedroogd. Transporteer de muis naar de Microscoop in een overdekt vat.
3. image acquisitie door spinnen schijf confocale microscopie
- Pipetteer 150 µ L van 1 µ M AlexaFluor 633 in Peeters op de glazen coverslipped onderkant van een 35 mm schaal. Plaats de muis, zodat de geopende mucosale oppervlak rechtstreeks contact met de dekglaasje.
- Kantel het hoofd van de Microscoop terug en plaats de muis op de coverslipped schotel op de Imaging fase in een pre-verwarmde incubator. Alternatief, bedek de muis door een verwarmingsdeken om de lichaamstemperatuur te handhaven.
- Start imaging software. De excitatie-intensiteit en de belichtingstijd voor elke Laser mag niet meer dan 10 tot 15 mW of 120 – 150 MS, respectievelijk, om te voorkomen dat fotobleken en om het interval tussen de tijdpunten te minimaliseren. Stel het frame gemiddelde in op "2" en zet de EM Gain functie aan om achtergrondruis te verminderen. Selecteer 63x objectieve kalibratie om de juiste meting van de pixelgrootte te garanderen.
Opmerking: De hierboven beschreven montages zijn bedoeld om een aanvankelijke verwijzing te verstrekken, maar zullen afhankelijk van individuele Microscoop configuraties variëren. - Met behulp van de 405 nm laser en de 20x Air doelstelling, visualiseer de kernen te lokaliseren een gebied van Villi dat een gebrek aan merkbare beweging of drift door het oog. Vermijd gebieden van artefactuele beweging als gevolg van ademhaling, Peristalsis of hartslag.
- Met behulp van de XY-scan, registreert de XY-coördinaat van het gebied van belang en overschakelen naar de glycerol onderdompeling 63X doelstelling.
- Bevestig dat de Villi in het geselecteerde veld stabiel zijn door het verwerven van een live image op de 405 nm kanaal voor maximaal 1 min.
- Terwijl het verwerven van een levend beeld op het kanaal van 405 nm, pas de nadruk aan om het orthogonale vliegtuig enkel onder het villous uiteinde te vinden. Verwerven Z-stacks vanaf de net onder de villous Tip epitheel vaststelling van de vlokken totdat het moeilijk is om de kernen op te lossen, ongeveer 15 tot 20 µm, met behulp van een 1,5 µm stap.
Opmerking: Bij de beeldvorming met drie kanalen (405, 488, 640 nm) met behulp van de belichtingstijden hierboven beschreven, is het mogelijk om alle drie de kanalen sequentieel te verwerven op ongeveer 20 s intervallen. - Open de software in Analysis mode, 3 – 5 min na het begin van de overname, om de beeldstabiliteit en γδ IEL beweeglijkheid te bevestigen. Doorgaan met het verwerven van beelden voor 30 tot 60 min voor elk gebied van Villi. Record 2 – 3 velden voor elke muis. Terwijl de beeldvorming, monitor de muis om de 5 minuten.
Opmerking: Als de anesthesie begint te slijten, gebruik een tang om zachtjes Scruff de nek van de muis te beheren 50 µ L van ketamine/xylazine op een moment. Blijf de anesthesie niveaus te controleren en opnieuw te beheren wanneer dat nodig is. - Het is niet raadzaam om het imago van een enkele muis langer dan 4 uur. Zodra de beeldaanwinst volledig is, offer de muizen door cervicale dislocatie die door bilaterale pneumothorax wordt gevolgd.
4.4D analyse van beelden
- Direct importeren Imaging bestanden naar 4D rendering software.
- Maak individuele oppervlakken voor IELs en het lumen, dan volgen de oppervlakken na verloop van tijd met behulp van de parameters beschreven in tabel 1 als een eerste referentie. Voor de IELs, in staat stellen splitsen aanraken van objecten met behulp van de zaad punt diameter aangegeven.
- Gebruik de autoregressieve tracking algoritme om te bepalen IEL beweeglijkheid. Hoewel de tracking-algoritme is relatief nauwkeurig, is het noodzakelijk om visueel te inspecteren tracks voor elke individuele IEL. Als een track onjuist is, corrigeert u deze met de functies verbinding verbreken en verbinden onder het tabblad tracks bewerken .
- Om de afstand van elke IEL tot het lumen te bepalen, selecteert u het lumen oppervlak en voert u de afstands transformatie functie uit onder het gereedschaps menu. Selecteer buitenoppervlakwanneer daarom wordt gevraagd. Eenmaal berekend, zal de afstand transformatie worden weergegeven als de 4e kanaal.
- Filter de intensiteit min van de 4e kanaal te selecteren γδ IELs die zich binnen de laterale intercellulaire ruimte (LIS). Deze waarde moet dicht bij 15 µm, gebaseerd op de hoogte van een zuilvormige epitheel cel. Het percentage van de totale γδ IELs binnen dit bereik wordt gerapporteerd als de frequentie van γδ IELs in de LIS.
- Voor verdere analyse, export statistische gegevens, waaronder: IEL track snelheid, track verplaatsing, track rechtheid en track lengte. U ook gegevens analyseren met behulp van de Vantage-module. Afhankelijk van het experiment, het verkrijgen van extra statistieken van de verworven gegevens, met inbegrip van stilstaan tijd binnen de LIS of IEL/epitheel interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van intravital Imaging van TcrdEGFP reporter muizen, hebben we eerder aangetoond dat γδ IELs vertonen een dynamisch surveillance gedrag, waarin zij patrouilleren het epitheel door te migreren langs de kelder membraan en in de laterale intercellulaire ruimte (LIS) op steady staat (Figuur 2, film 1).
Deze benadering kan ook worden gebruikt om te evalueren hoe de remming van specifieke cel signalering paden en/of receptoren invloeden γδ IEL migratiegedrag. Bijvoorbeeld, interleukin (Il)-15 is een pleiotropic cytokine die essentieel is voor γδ iel homeostase23,24. Om te bepalen of IL-15 signalering via IL-2Rβ receptor bijdraagt aan de kinetiek van γδ IEL beweeglijkheid bij steady state, TcrdEGFP reporter muizen werden afgebeeld 2 h na toediening van anti-IL-2Rβ antilichaam (TM-β1) of Isotype IgG2b controle. De gekleurde sporen wijzen op de migrerende wegen van individuele γδ IELs in de loop van 30 min (Figuur 3a). Hoewel de frequentie van γδ IELs in de LIS werd verhoogd bij muizen behandeld met TM-β1 (Figuur 3a,B), meer dan 30% van deze γδ IELs tentoongesteld een stationair gedrag (Figuur 3a,C). Idle γδ IELs werden gedefinieerd door het opleggen van de bovengrens op het spoor rechtheid en track verplaatsing lengte. Dit fenotype stationair draaien werd bevestigd door een significante vermindering van zowel de momentane snelheid en opsluiting ratio van γδ IELs volgende IL-2Rβ blokkade ten opzichte van de controle (figuur 3D,E). Verder, de idle γδ IELs hebben langer stilstaan tijden en werden vaker gelokaliseerd binnen de LIS ten opzichte van beweeglijke γδ IELs (figuur 3F).
Figuur 1: het gebruik van een tang om een gat in de mesenterium te creëren. Plaats een tang aan beide zijden van het membraan om een gat voor de hechtingen te creëren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve 3D-beeld van Γδ IELs in de jejunum. Een enkel tijdpunt werd geselecteerd uit een time-lapse video van genomen van de jejunal mucosa van een TcrdEGFP reporter muis bij steady-state. γδ IELs worden weergegeven in het groen, kernen in het wit en het lumen in het rood. Schaalbalk = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: remming van Il-2Rβ induceert ΓΔ iel stationair draaien in de laterale intercellulaire ruimte. Dit cijfer is aangepast van "epitheel IL-15 is een kritische regulator van γδ epitheliale lymfocyten beweeglijkheid binnen de intestinale mucosa." door hu, M. D . et al. 2018, J immuun, 201 (2), p. 747-756. 15 copyright 2018 door de American Association of immunologen, Inc (a) time-lapse beelden waaruit blijkt migrerende GFP γδ IELs binnen de jejunal villous epitheel na 2 h behandeling met 0,45 mg van IgG2b of TM-β1. De beweeglijkheid van individuele γδ IELs (groen) in de loop van 30 min worden getoond met gekleurde tracks. Kernen worden weergegeven in het wit, en het lumen wordt weergegeven in het rood. Schaal staven = 20 µm. (B) frequentie van γδ IELs in de Lis (n = 3 muizen per behandeling, n = 6-7 Video's). (C) percentage van γδ IELs die niet actief waren in IgG2b-of TM-β1-behandelde muizen. (D) momentane snelheid (n = 13.299 en 9.600 tijdpunten). (E) track opsluitings ratio's (n = 350 en 278 tracks) worden weergegeven. (F) afstand van idle en beweeglijke γδ IELs van het lumen. Mean + SEM wordt weergegeven (+). * p < 0,05, * * p < 0,01, #p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| IEL | lumen | |
| Oppervlakte detail (μm) | 1,2 | 1,5 |
| Achtergrond aftrekken (μm) | 1,67 | 2 |
| Zaad punten diameter (μm) | 7,5 | N/a |
| Filter: aantal voxels | 250 | 6.500 |
| Het volgen: maximumafstand (μm) | 10 | 10 |
| Tracking: Max gap | 2 | 2 |
Tabel 1: representatieve instellingen voor het genereren ΓΔ iel en Luminale "oppervlakten" in imaris. Deze instellingen kunnen worden gebruikt als uitgangspunt bij het genereren en bijhouden van oppervlakken van de 488 nm kanaal (IEL) en 640 nm kanaal (lumen). Afhankelijk van de experimentele omstandigheden moeten deze instellingen mogelijk worden gewijzigd.
Film 1: Intravital beeldvorming van GFP ΓΔ iel migratiegedrag in muis jejunum. Time-lapse intravital microscopie van γδ IEL beweeglijkheid in jejunum van een TcrdEGFP muis behandeld met 0,45 mg IgG2b. γδ IELs worden weergegeven in het groen, kernen in het blauw, en het lumen in het rood. Schaalbalk, 20 μm. Frames werden verzameld om de 30 s voor ongeveer 30 min. film is aangepast van Hu, M. D . et al. 201815. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van intravital microscopie technieken heeft een ongekende kans om de reorganisatie van subcellulaire structurenacht,9,22, cel-cel interacties12, 25 en het migrerende gedrag van de cel13,14,15,16,26 in anders ontoegankelijke weefsels. Er is een algemeen gebrek aan instrumenten om de verordening en de functie van γδ IELs in vivo18,27te bestuderen, en als gevolg daarvan heeft het gebruik van intravital Imaging opende nieuwe wegen van het onderzoek met betrekking tot de moleculaire regulering en functionele kenmerken van iel populaties13,14,15,16,20. γδ IELs werden eerder geacht stationair te zijn binnen de intestinale mucosa28. Echter, verdere analyse aangetoond dat deze cellen zijn zeer dynamisch, maar migreren langzamer dan lymfocyten in secundaire lymfeorganen als gevolg van de strakke grenzen van de epitheel compartiment13. Bovendien heeft het gebruik van in vivo imaging extra inzicht verschaft in de spatiotemporal dynamiek van γδ IEL surveillance gedrag, inclusief de Overspraak tussen IELs en epitheelcellen die γδ IEL beweeglijkheid en functie13drijft, 14 , 15 , 16. de analyse van dit migrerende gedrag heeft nieuwe metriek voor iel cellulaire reacties bepaald die niet nauwkeurig kwantificeerbaar gebruikend ex vivo of in vitro experimenten zouden geweest zijn.
Gedurende de gehele procedure, is het essentieel om continu toezicht op de sedatie niveau van de muis. Continue toediening van gas anesthesie (Isofluraan) kan worden gebruikt als een alternatief voor ketamine/xylazine. Bij het uitvoeren van de laparotomie, is het essentieel om de neurovasculaire levering intact te houden om een nauwkeurige evaluatie van de biologie te verstrekken. Afbinden mesenterica bloedvaten kan leiden tot hypoxie en geleidelijke necrose van het weefsel. In tegenstelling, verbreken bloedvaten zal resulteren in bloeden in de blootgestelde mucosa, die de fluorescentie-intensiteit van sommige kanalen kan verminderen tijdens de beeldvorming. Als de IELs ontwikkelen van een afgeronde morfologie en stoppen met bewegen tijdens de Beeldacquisitie, kan dit te wijten zijn aan een lichte daling van de lichaamstemperatuur van de muis. Het plaatsen van temperatuur sensor dicht bij de Microscoop fase zorgt ervoor dat de temperatuur op de site van het blootgestelde slijmvlies wordt gehandhaafd op 37 ° c. Verhoging van de temperatuur tot 38-39 ° c kan nodig zijn, afhankelijk van de temperatuur stabiliteit van de incubatie kamer.
Zodra de muis is geplaatst op de Microscoop fase, kan het moeilijk zijn om velden van Villi die gebrek aan buitensporige beweging als gevolg van Peristalsis of samentrekking van aangrenzende bloedvaten te identificeren. Als dit gebeurt, de positie van de muis binnen de schotel of manipuleren van de muis flanken extern in een poging om strak Pack Villi tegen de dekglaasje. Als alternatief kan het Imaging veld stabieler worden een paar minuten na het plaatsen van de muis op het podium. Als er geleidelijk XY drift tijdens de overname, kan dit worden gecorrigeerd met behulp van drift correctie in de 4D rendering software door het selecteren van 4 tot 5 kernen die aanwezig zijn op verschillende locaties van het beeld gedurende de tijd cursus en het bijhouden van een plek voor elke Nucleus. Zodra de vlekken zijn gegenereerd, selecteert u de juiste drift onder de Edit track menu om translationele drift te corrigeren. Het is belangrijk dat de afwijking correctie worden gedaan voorafgaand aan een andere analyse, omdat dit zal veranderen de coördinaten gebruikt om andere objecten in het beeld te volgen.
Hoewel twee-foton laser scanning microscopie zorgt voor een brede diepte van de beeldvorming die nuttig is voor het penetreren van diep in weefsels29, spinnen schijf Laser confocale microscopie heeft zijn eigen unieke voordelen voor intravital imaging toepassingen. Twee-foton laser scanning microscopie is gebaseerd op fotovermenigvuldiger buizen (bet) dat kan slechts een pixel te detecteren in een tijd met een Quantum-efficiëntie van 40-50%. In tegenstelling, spinnen schijf confocale laser microscopie maakt gebruik van een elektron vermenigvuldiging (EM) CCD-camera om direct te detecteren tot een miljoen pixels gelijktijdig, waardoor de Quantum-efficiëntie tot 95%. Als gevolg, het potentieel voor het fotobleken en fotoschade is aanzienlijk verminderd, terwijl de verhoogde acquisitie snelheid maximaliseert temporele resolutie bij de Imaging cel migratie in meer oppervlakkige weefsels. Ongeacht de Imaging modaliteit, deze chirurgische ingreep is ideaal voor het blootstellen van de intestinale mucosa voorbeeld vorming op een omgekeerde Microscoop.
Met de toenemende beschikbaarheid van muis stammen uiten van TL-verslaggevers, fluorescerende-gelabelde sondes of fluorescerende stammen van micro-organismen die zijn gegenereerd in een veelheid van golflengten, de combinaties te evalueren in vivo intestinale Reacties in real-time zijn eindeloos. Niet alleen kan intravital Imaging nieuw inzicht geven in cel-cel en gastheer-microbe interacties, maar het kan ook dynamische moleculaire en cellulaire processen in zowel epitheel als immune cellen onder homeostatische of pathologische omstandigheden benadrukken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch biomedische Grant (KLE). Wij danken Madeleine hu voor haar hulp bij het bewerken van het manuscript en het verstrekken van de gegevens in de representatieve resultaten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
