Summary
Vi beskriver en metode for å visualisere GFP-merket γδ IELs bruker intravital Imaging av murine tynntarmen av invertert spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi. Denne teknikken gjør det mulig sporing av levende celler i mucosa for opptil 4 h og kan brukes til å undersøke en rekke intestinal immun-epitel interaksjoner.
Abstract
Intraepithelial-lymfocytter uttrykker γδ T celle reseptor (γδ IEL) spiller en nøkkelrolle i immun overvåkning av tarm epitel. På grunn av mangelen på en definitiv ligand for γδ T celle reseptor, er vår forståelse av reguleringen av γδ IEL aktivering og deres funksjon i vivo fortsatt begrenset. Dette nødvendiggjør utviklingen av alternative strategier for å forhøre signalnettverk trasé involvert i å regulere γδ IEL funksjon og responsen av disse cellene til den lokale mikromiljøet. Selv om γδ IELs er allment forstått å begrense patogen translokasjon, har bruken av intravital Imaging vært avgjørende for å forstå den spatiotemporal dynamikken i IEL/epitel interaksjoner ved steady-state og som svar på invasive patogener. Heri presenterer vi en protokoll for å visualisere IEL trekk atferd i den lille tarmslimhinnen i en GFP γδ T celle reporter musen med invertert spinning disk konfokalmikroskopi laser mikroskopi. Til tross for det maksimum tenkelig dybden av denne adgang er begrenset i forhold til bruken av to-Foton laser-skanning mikroskopi, spinning diskett konfokalmikroskopi laser mikroskopi skaffer fordelen av høy fart image oppkjøpet med nedsatte photobleaching og photoskade. Bruke 4D bildeanalyse programvare, T celle overvåkning atferd og deres interaksjon med nabocellene kan analyseres etter eksperimentell manipulasjon for å gi ytterligere innsikt i IEL aktivisering og funksjon i tarmen mucosa.
Introduction
Intraepithelial-lymfocytter (IEL) ligger innenfor tarm epitel, og finnes både langs kjeller membranen og mellom tilstøtende epitelceller i lateral intercellulære plass1. Det er omtrent en IEL for hver 5-10 epitelceller; disse IELs tjene som Sentinels å gi immun overvåkning av den store hvelvingen av intestinal epitel barriere2. IELs uttrykker γδ T celle reseptor (TCR) utgjør opp til 60% av den totale IEL befolkningen i murine tynntarmen. Studier i γδ T-Cell-mangelfull mus demonstrere en stor grad beskyttende rolle i disse cellene som svar på intestinal skade, betennelser og infeksjoner3,4,5. Til tross for generering av Tcrd knockout Mouse6, vår forståelse av γδ IEL biologi fortsatt begrenset skyldes delvis det faktum at LIGANDER anerkjent av γδ TCR har ennå ikke identifisert7. Som et resultat, har mangelen på verktøy for å studere denne cellen befolkningen gjorde det vanskelig å undersøke rollen som γδ TCR aktivisering og funksjon under fysiologiske og patologiske tilstander. For å fylle dette gapet, har vi utviklet Live Imaging teknikker for å visualisere γδ IEL trekk atferd og interaksjoner med nabo enterocytes som et middel for å gi ytterligere innsikt i γδ IEL funksjon og respons på eksterne stimuli in vivo.
I løpet av det siste tiåret, har intravital Imaging betydelig utvidet vår forståelse av de molekylære hendelser som er involvert i flere fasetter av intestinal biologi, inkludert epitel celle shedding8, regulering av epitel barrierefunksjon9 ,10, myelogen celle prøvetaking av luminal innhold11,12og Host-mikrobe interaksjoner11,13,14,15,16 . I sammenheng med IEL biologi, har bruken av intravital mikroskopi belyse spatiotemporal dynamikk IEL motilitet og faktorene formidling deres overvåking atferd13,14,15, 16i den. Utviklingen av TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) reporter mus, som merker γδ IELs av kjernefysiske GFP uttrykk17, avslørte at γδ IELs er svært aktive innenfor epitel og viser en unik overvåking atferd som er mottakelig for mikrobiell infeksjon17,13,14. Nylig ble en annen γδ T celle reporter mus utviklet (Tcrd-GDL) som uttrykker GFP i cytoplasma å tillate visualisering av hele cellen18. Lignende metodikk har blitt brukt til å undersøke kravet om spesifikke chemokine reseptorer, slik som G protein-koblet reseptor (GPCR)-18 og-55, på dynamikken i IEL motilitet19,20. I fravær av en celle-spesifikk reporter, ble fluorescerende bøyd antistoffer mot CD8α brukt til å visualisere og spore IEL motilitet in vivo19,20. Til tross for to-Foton laserskanning mikroskopi er vanligvis anvendt for intravital tenkelig, bruken av roterer diskett konfokalmikroskopi laser mikroskopi skaffer enestående fordeler å fange høy fart og høy-resolution mange--kanalen profilen med minimal bakgrunnsstøyen. Denne teknologien er ideell for å belyse den spatiotemporal dynamikken av immun/epitel interaksjoner innenfor komplekse mikromiljøet av tarmslimhinnen. Videre, ved bruk av ulike transgene-og/eller knockout-mus modeller, kan disse studiene gi innsikt i den molekylære reguleringen av intestinal immun-og/eller epitel celle funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier ble gjennomført i en sammenslutning av Assessment og akkreditering av Laboratory Animal Care (AALAC)-akkreditert anlegg i henhold til protokoller godkjent av Rutgers New Jersey Medical School komparativ Medicine Resources.
1. klargjøring av mus
Merk: Følgende prosedyre, inkludert dyr forberedelse og kirurgi, vil ta 30 – 40 min. før operasjonen, slå på mikroskopet og varm opp vedlagte inkubator på mikroskopet til 37 ° c.
- Utføre eksperimenter på 8-10 uker gamle TcrdEGFP mus på en C57BL/6 bakgrunn, som ble innhentet fra Bernard Malissen (INSERM, Paris, Frankrike). Ifølge IACUC-godkjent prosedyre, bedøve musen ved IP injeksjon av ketamin (120 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) basert på vekten av dyret. Evaluere nivået av anestesi ved åndedrett rate (55 – 65 åndedrag per minutt)21, toe klype og palpebral refleks.
- Når kirurgisk fly anestesi er nådd, sikre bakbena på musen ved hjelp av tape til en oppvarming pad for å opprettholde kroppstemperatur, som kan overvåkes av rektal termometer. Hvis det er tegn til at anestesi er iført av (f. eks, økt åndedrett rate, blinkende og/eller øye muskel rykninger respons på palpebral refleks), re-administrere 50 μL av ketamin/xylazine om gangen til musen er fullt bedøvet.
- Klargjør det kjernefysiske fargestoffet ved å fortynne 50 μL av Hoechst 33342 (10 mg/mL) med 315 μL av 0,9% saltvann; den endelige konsentrasjonen er 37,5 mg/kg basert på vekten av musen (200 μL omtrentlig volum). Når musen er anesthetized, langsomt injisere Hoechst ved hjelp av en tuberkulin sprøyte gjennom retro-orbital venøs sinus.
Merk: Vent 1 – 2 min før du går videre til neste trinn for å la musen acclimate til endringen i sirkulerende volum etter retro-orbital injeksjon. - Plasser en liten mengde smøremiddel over øynene for å hindre at de tørker ut.
2. mus kirurgi: Laparotomy å utsette intestinal mucosa
- Lag en 2 cm vertikalt snitt gjennom huden og peritoneum langs midtlinjen i nedre del av magen for å externalize regionen i tarmen for å bli avbildet.
- Ved hjelp av vinklet pinsett, trekk forsiktig cecum ut av bukhulen og identifisere området av tynntarmen som skal avbildet. Vær forsiktig så du ikke rive chrezbryzheechno blodkar i løpet av denne prosessen. For å minimere potensiell skade eller blødning, unngå å gripe eller knipe tarmen med tang.
- Finn et egnet område av tynntarmen (2 – 3 cm) for bildebehandling som inneholder minimalt med avførings innhold. Returner forsiktig cecum og resterende tynntarmen inn i bukhulen, mens du forlater segmentet av interesse externalized.
Merk: Unngå å punktering cecum eller avbryte chrezbryzheechno blodkar under dette trinnet. - Plasser to par tang på hver side av den underliggende mesenterium mellom blodkar, og forsiktig gni tuppen av Tang sammen for å lage et hull i membranen (figur 1)22. Dette vil tillate nålen å passere gjennom mesenterium når du lukker bukhulen under tarmen.
- Lukk snittet mens løkke av tarmen externalized. Ved hjelp av vinklet tang og en buet, taper punkt nål festet til en 5 cm Sutur, trenge den ene siden av peritoneum, gå gjennom hullet som er gjort i forrige trinn, og opp gjennom den andre siden av bukhulen fôr. Plasser en Sutur på toppen, og en annen nær bunnen av snittet.
Merk: Unngå å skade blodkar under dette trinnet. - Gjenta denne prosessen for å lukke huden under tarm sløyfen, ved å plassere en Sutur i midten av snittet, mellom den forrige sting i den underliggende peritoneum.
Merk: Det er viktig å bare externalize det området som skal avbildet; Dette vil redusere overflødig bevegelse under bildebehandling. Pass på å unngå å binde av chrezbryzheechno arterier. - Bruk en elektrokautering til å lage en linje med perforering langs den anti-chrezbryzheechno grensen. Umiddelbart etter cauterization, Påfør noen dråper vann til overflaten av tarmen for å hindre ytterligere varme-indusert vevsskade. Blot med en Kimwipe for å fjerne rester av vann.
- Skjær en liten horisontal spalte på den ytterste kanten av cauterized vev ved hjelp av Vännäs saks og Fortsett å skjære langs lengden av cauterized linjen mot den proksimale enden av externalized vev segmentet (ca 1,5 cm i lengde) for å avdekke slimhinnene Overflaten.
Merk: Om nødvendig, bruk tang for å forsiktig fjerne overflødig avføring innhold som gjenstår på den eksponerte slimhinnen overflaten. - Dekk til magen på musen med en fuktig Kimwipe å hindre at vevet blir dehydrert. Transporter musen til mikroskopet i et dekket fartøy.
3. image oppkjøp av spinning disk Konfokalmikroskopi mikroskopi
- Pipetter 150 μL av 1 μM AlexaFluor 633 i HBSS på glass påsatt dekkglass bunn på en 35 mm rett. Plasser musen slik at den åpnede slimhinne overflaten direkte kontakter dekkglass.
- Vipp hodet av mikroskopet tilbake og plassere musen på påsatt dekkglass parabolen på bildebehandling scenen i en forvarmet inkubator. Alternativt, dekket musa av en varmer teppe å vedlikeholde kropp temperatur.
- Innlede tenkelig programvare. Eksitasjon intensitet og eksponeringstid for hver laser bør ikke overstige 10 – 15 mW eller 120 – 150 MS, henholdsvis for å unngå photobleaching og for å minimere intervallet mellom tids punkter. Juster ramme gjennomsnittet til "2" og slå på EM Gain-funksjonen for å redusere bakgrunnsstøyen. Velg 63x objektiv kalibrering for å sikre riktig måling av pikselstørrelsen.
Merk: Innstillingene som er beskrevet ovenfor, er ment å gi en innledende referanse, men vil variere avhengig av individuelle mikroskop konfigurasjoner. - Bruke 405 NM laser og 20x luft objektiv, visualisere kjerner for å finne et felt av Villi som mangler merkbar bevegelse eller drift av øyet. Unngå områder med artifactual bevegelser på grunn av åndedrett, peristaltikk eller hjerterytme.
- Ved hjelp av XY-skanningen registrerer du XY-koordinaten til interesse feltet og bytter til det glyserol-63X-målet.
- Bekreft at Villi i det valgte feltet er stabilt ved å anskaffe et direktesendt bilde på 405 NM-kanalen i opptil 1 min.
- Mens anskaffe et levende bilde på 405 NM kanal, justere fokus for å finne ortogonale flyet like under villous spissen. Skaff Z-stabler fra rett under villous spiss epitel ned villus til det er vanskelig å løse kjerner, ca 15 – 20 μm, ved hjelp av et trinn på 1,5 μm.
Merk: Når bildebehandling med tre kanaler (405, 488, 640 NM) ved hjelp av eksponeringstidene beskrevet ovenfor, er det mulig å anskaffe alle tre kanalene sekvensielt på ca. 20 s intervaller. - Åpne programvaren i analyse modus, 3 – 5 min etter begynnelsen av oppkjøpet, for å bekrefte bildet stabilitet og γδ IEL motilitet. Fortsett å tilegne seg bilder i 30 – 60 min for hvert felt av Villi. Ta opp 2 – 3 felt for hver mus. Mens bildebehandling, overvåke musen hver 5 min.
Merk: Hvis anestesi begynner å slites av, bruk tang for å forsiktig scruff nakken av musen for å administrere 50 μL av ketamin/xylazine om gangen. Fortsett å overvåke anestesi nivåer og re-administrere når det er nødvendig. - Det er ikke tilrådelig å bildet en enkelt mus for mer enn 4 t. Når bildet oppkjøpet er fullført, ofre musene ved cervical forvridning etterfulgt av bilaterale pneumotoraks.
4.4D analyse av bilder
- Direkte importere bildefiler til 4D rendering programvare.
- Lag individuelle overflater for IELs og lumen, og spor deretter overflatene over tid ved hjelp av parametrene som er skissert i tabell 1 som en innledende referanse. For IELs, Aktiver Split berøre objekter ved hjelp av frø punkt diameter angitt.
- Bruk autoregressive sporing algoritmen til å bestemme IEL motilitet. Selv om sporing algoritmen er relativt nøyaktig, er det viktig å visuelt inspisere spor for hver enkelt IEL. Hvis et spor er feil, retter du det med funksjonene Koble fra og Koble til under kategorien Rediger spor .
- For å bestemme avstanden fra hver IEL til lumen, velger lumen overflaten og utføre avstand transformasjon funksjon under verktøy menyen. Velg utenfor Surfacenår du blir bedt om det. Når beregnet, vil avstanden transformasjon vises som den fjerde kanalen.
- Filtrer intensiteten min på den fjerde kanalen for å velge γδ IELs som er innenfor den laterale intercellulære PLASSEN (LIS). Denne verdien bør være nær 15 μm, basert på høyden av en søyle epitel celle. Prosentandelen av total γδ IELs innenfor dette området rapporteres som hyppigheten av γδ IELs i LIS.
- For videre analyse kan du eksportere statistiske data, inkludert: IEL spor hastighet, spor forskyvning, spor retthet og spor lengde. Du kan også analysere data ved hjelp av Vantage-modulen. Avhengig av eksperimentet, få ytterligere beregninger fra innhentet data, inkludert botid innenfor LIS eller IEL/epitel interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av intravital Imaging av TcrdEGFP reporter mus, har vi tidligere vist at γδ IELs viser en dynamisk overvåking atferd, der de patruljerer epitel ved å migrere langs kjelleren membranen og inn i lateral intercellulære plass (LIS) på jevn (figur 2, film 1).
Denne tilnærmingen kan også brukes til å evaluere hvordan hemming av bestemte celle signalering veier og/eller reseptorer påvirker γδ IEL trekk atferd. For eksempel, interleukin (Il)-15 er en pleiotropic cytokin som er avgjørende for γδ IEL homeostase23,24. For å avgjøre om IL-15 signalering gjennom IL-2Rβ reseptor bidrar til Kinetics av γδ IEL motilitet ved steady state, TcrdEGFP reporter mus ble avbildet 2 h etter administrering av anti-IL-2Rβ antistoff (TM-β1) eller isotype IgG2b kontroll. De fargede sporene indikerer trekk banene til de enkelte γδ IELs i løpet av 30 minutter (figur 3a). Selv om hyppigheten av γδ IELs i LIS ble økt i mus behandlet med TM-β1 (figur 3a,B), mer enn 30% av disse γδ IELs utstilt en tomgang oppførsel (figur 3a,C). Inaktiv γδ IELs ble definert ved å innføre øvre grenser på sporet retthet og spor forskyvning lengde. Dette tomgang fenotype ble bekreftet av en betydelig reduksjon i både momentant hastighet og fødsel ratio av γδ IELs følgende IL-2Rβ blokade i forhold til kontroll (figur 3D,E). Videre har den inaktive γδ IELs lengre botid og var oftere lokalisert innenfor LIS i forhold til aktive γδ IELs (figur 3F).
Figur 1: bruke tang for å lage et hull i mesenterium. Plasser tang på hver side av membranen for å skape et hull for sting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representativt 3D-bilde av Γδ IELs i jejunum. En enkelt tid punkt ble valgt fra en time-lapse video av tatt av jejunal mucosa i en TcrdEGFP reporter musen på steady-state. γδ IELs er vist i grønt, kjerner i hvitt og lumen i rødt. Scale bar = 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Hemming av Il-2Rβ induserer ΓΔ IEL tomgang i lateral intercellulære plass. Dette tallet er tilpasset fra "epitel IL-15 er en kritisk regulator av γδ intraepithelial lymfocytter motilitet i Tarmslimhinnen." av Hu, M. D. et al. 2018, J Immunol, 201 (2), s. 747-756. 15 Copyright 2018 av American Association of Immunologer, Inc. (A) time-lapse bilder som viser migrerer GFP γδ IELs innenfor jejunal villous epitel etter 2 h behandling med 0,45 mg IgG2b eller TM-β1. Den motilitet av individuelle γδ IELs (grønn) i løpet av 30 min er vist med fargede spor. Kjerner er vist i hvitt, og lumen er vist i rødt. Skala bars = 20 μm. (B) hyppigheten av γδ IELS i LIS (n = 3 mus per behandling, n = 6-7 videoer). (C) prosent av γδ IELs som var inaktive i IgG2b-eller TM-β1-behandlede mus. (D) øyeblikkelig hastighet (n = 13 299 og 9 600 tids punkt). (E) spor forhold for fødsel (n = 350 og 278 spor) vises. (F) avstand på tomgang og aktive γδ IELs fra lumen. Mean + SEM er vist (+). * p < 0,05, * * p < 0,01, #p < 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| IEL | lumen | |
| Overflate detaljer (μm) | 1,2 for alle | 1,5 for alle |
| Subtraksjon (μm) | 1,67 for alle | 2 |
| Frø poeng diameter (μm) | 7,5 for alle | N/a |
| Filter: antall voxels | 250 for alle | 6 500 for alle |
| Sporing: Maks avstand (μm) | 10 | 10 |
| Sporing: maks gap | 2 | 2 |
Tabell 1: representative innstillinger for generering ΓΔ IEL og luminal "overflater" i Imaris. Disse innstillingene kan brukes som utgangspunkt når du genererer og sporer overflater på 488 NM-kanal (IEL) og 640 NM-kanal (lumen). Disse innstillingene må kanskje endres, avhengig av eksperimentelle forhold.
Film 1: Intravital avbildning av GFP ΓΔ IEL trekk adferd i mus jejunum. Time-lapse intravital mikroskopi av γδ IEL motilitet i jejunum fra en TcrdEGFP mus behandlet med 0,45 mg IgG2b. γδ IELs er vist i grønt, kjerner i blått, og lumen i rødt. Skala bar, 20 μm. Rammer ble samlet inn hver 30 s i ca 30 min. filmen er tilpasset fra Hu, M. D . et al. 201815. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av intravital mikroskopi teknikker har gitt en enestående mulighet til å observere omorganisering av subcellulære strukturer8,9,22, celle-celle interaksjoner12, 25 og celle trekk atferd13,14,15,16,26 i ellers utilgjengelige vev. Det har vært en generell mangel på verktøy for å studere regulering og funksjon av γδ IELs in vivo18,27, og som et resultat, bruk av intravital Imaging har åpnet nye muligheter for etterforskning om molekylær regulering og funksjonelle egenskaper ved IEL populasjoner13,14,15,16,20. γδ IELs var tidligere antatt å være stasjonære innenfor tarmslimhinnen28. Men videre analyse viste at disse cellene er svært dynamiske, men migrere saktere enn lymfocytter i sekundære lymfoide organer på grunn av den stramme rammen av epitel kupé13. Videre har bruk av in vivo Imaging gitt ytterligere innsikt i den spatiotemporal dynamikken i γδ IEL overvåking atferd, inkludert crosstalk mellom IELs og epitelceller som driver γδ IEL motilitet og funksjon13, 14 priser og priser , 15 priser og , 16. analyse av denne trekk atferden har definert nye beregninger for IEL cellulære svar som ikke ville ha vært nøyaktig målbare ved bruk av ex vivo-eller in vitro-eksperimenter.
Gjennom hele prosedyren, er det viktig å kontinuerlig overvåke sedasjon nivået av musen. Kontinuerlig administrering av gass anestesi (isoflurane) kan brukes som et alternativ til ketamin/xylazine. Når du utfører laparotomy, er det avgjørende å holde nevrovaskulære forsyningen intakt for å gi en nøyaktig vurdering av biologi. Binding av chrezbryzheechno blodkar kan føre til hypoksi og gradvis nekrose av vevet. I kontrast vil severing blodkar føre til blødning i eksponert mucosa, noe som kan redusere den fluorescens intensiteten til enkelte kanaler under bildebehandling. Hvis IELs utvikle en avrundet morfologi og slutte å bevege seg under bildet oppkjøpet, kan dette skyldes en svak nedgang i kroppstemperaturen på musen. Ved å plassere temperatursensoren i nærheten av mikroskopet, sikrer du at temperaturen på stedet til den eksponerte slimhinnen opprettholdes ved 37 ° c. Det kan være nødvendig å heve temperaturen til 38 – 39 ° c avhengig av temperatur stabiliteten til det inkubasjons kammeret.
Når musen er plassert på scenen i mikroskopet, kan det være vanskelig å identifisere felt av Villi som mangler overdreven bevegelse på grunn av peristaltikk eller sammentrekning av tilstøtende blodkar. Hvis dette skjer, kan du omplassere musen i parabolen eller manipulere muse sidene eksternt i et forsøk på å tett pakke Villi mot dekkglass. Alternativt kan bildefeltet bli mer stabilt noen få minutter etter at du har plassert musen på scenen. Hvis det er gradvis XY drift under oppkjøpet, kan dette rettes ved hjelp av drift korreksjon i 4D rendering programvaren ved å velge 4-5 kjerner som er til stede på forskjellige steder i bildet hele tiden kurs og sporing av et sted for hver Kjernen. Når stedene er generert, velger du riktig drift undermenyen Rediger spor for å korrigere translational drift. Det er viktig at drift korreksjon gjøres før noen annen analyse, siden dette vil endre koordinatene brukes til å spore andre objekter i bildet.
Til tross for to-Foton laserskanning mikroskopi innrømmer for en bred dybden av tenkelig det er nyttig for inntrengende dyp i vev29, spinning diskett laser konfokalmikroskopi mikroskopi har dens egen enestående fordeler for intravital tenkelig søknadene. To-Foton laserskanning mikroskopi er avhengig av photomultiplier rør (PMT) som kan oppdage bare én piksel om gangen med en kvante virkningsgrad på 40 – 50%. I kontrast, spinning disk konfokalmikroskopi laser mikroskopi bruker et elektron multiplikasjon (EM) CCD-kamera for å direkte oppdage opp til en million piksler samtidig, og dermed øke Quantum effektivitet til 95%. Som et resultat, potensialet for photobleaching og photoskade er betydelig redusert, mens den økte anskaffelses hastighet maksimerer Temporal oppløsning når Imaging celle migrasjon i mer overfladisk vev. Uavhengig av Imaging modalitet, denne kirurgiske prosedyren er ideell for å utsette tarmslimhinnen for Imaging på en invertert mikroskop.
Med den økende tilgjengeligheten av musen stammer uttrykke fluorescerende journalister, fluorescensmerkete-merket sonder eller fluorescerende stammer av mikroorganismer som har blitt generert i en rekke bølgelengder, kombinasjonene å evaluere in vivo intestinal svar i sanntid er uendelige. Ikke bare kan intravital Imaging gi romanen innsikt i celle-celle og Host-mikrobe interaksjoner, men det kan også markere dynamiske molekylære og cellulære prosesser i både epitel og immunceller under homøostatisk eller patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Vi takker Madeleine Hu for hennes assistanse i å redigere manuskriptet og gi dataene som vises i representative resultater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
