Summary
نحن نوصف طريقة لتصور GFP المسمى + IELs باستخدام التصوير داخل vital من الأمعاء الدقيقة مورين عن طريق عكس الغزل القرص المجهر confocal. هذه التقنية تمكن من تتبع الخلايا الحية داخل الغشاء المخاطي لمدة تصل إلى 4 ح ويمكن استخدامها للتحقيق في مجموعة متنوعة من التفاعلات المعوية المناعية الظهارية.
Abstract
الخلايا الليمفاوية داخل الظهارية التي تعبر عن مستقبلات الخلايا التّية (γ δ IEL) تلعب دوراً رئيسياً في المراقبة المناعية للظهارة المعوية. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود ليجاننهائي لمستقبلات الخلية T γδ, فهمنا لتنظيم التنشيط iEL γδ ووظيفتها في الجسم الحي لا يزال محدودا. وهذا يتطلب وضع استراتيجيات بديلة لاستجواب مسارات الإشارة التي تنطوي على تنظيم وظيفة IEL δ ومدى استجابة هذه الخلايا للبيئة الدقيقة المحلية. على الرغم من أن الـ IELs من المفهوم على نطاق واسع للحد من نقل الممرض، فإن استخدام التصوير داخل الفيتال كان حاسماً لفهم الديناميات المكانية المكانية للتفاعلات الظهارية IEL/في حالة ثابتة واستجابة لمسببات الأمراض الغازية. هنا، نقدم بروتوكولا لتصور سلوك الهجرة IEL في الغشاء المخاطي المعوي ة من الماوس مراسل الخلية ت gfp باستخدام مقلوب الغزل القرص cofocal الليزر المجهري. على الرغم من أن عمق التصوير الأقصى لهذا النهج محدود بالنسبة لاستخدام المجهر المسح الضوئي بالليزر اثنين من الفوتونات، والغزل القرص مجهر الليزر البؤري يوفر ميزة الحصول على صورة عالية السرعة مع انخفاض photobleaching و الصورة الضرر. باستخدام برنامج تحليل الصور 4D، يمكن تحليل سلوك مراقبة الخلايا T وتفاعلاتها مع الخلايا المجاورة بعد التلاعب التجريبي لتوفير نظرة ثاقبة إضافية في تفعيل IEL ووظيفة داخل الغشاء المخاطي المعوي.
Introduction
توجد الخلايا اللمفاوية داخل الظهارة داخل الظهارة المعوية، وتوجد على طول غشاء الطابق السفلي وبين الخلايا الظهارية المجاورة في الفضاء الجانبي بين الخلايا1. هناك تقريبا واحد IEL لكل 5-10 خلايا الظهارية; هذه العبوات اللي ة كحراس لتوفير المراقبة المناعية للامتداد الكبير للحاجز الظهاري المعوي2. تشكل الـ IELs التي تعبر عن مستقبلات الخلايا t (TCR) ما يصل إلى 60% من إجمالي عدد السكان في الأمعاء الدقيقة في المورين. الدراسات في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا التائية تتثبت من دور وقائي لهذه الخلايا استجابة لإصابة الأمعاء والتهاب والعدوى3,4,5. على الرغم من جيل من Tcrd خروج المغلوب الماوس6, فهمنا لالبيولوجيا IEL γδ لا يزال محدودا ويرجع ذلك جزئيا إلى حقيقة أن الليجانس المعترف بها من قبل tcr γδ لم يتم تحديدها بعد7. ونتيجة لذلك، فإن عدم وجود أدوات لدراسة هذه الخلايا السكان جعلت من الصعب التحقيق في دور تنشيط ووظيفة tCR γδ في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. لسد هذه الفجوة، قمنا بتطوير تقنيات التصوير الحي لتصور سلوك الهجرة IEL δ δ والتفاعلات مع الخلايا المعوية المجاورة كوسيلة لتوفير نظرة إضافية على وظيفة IEL والقدرة على الاستجابة للمحفزات الخارجية في الجسم الحي.
على مدى العقد الماضي، وسعت التصوير داخل الحيوية بشكل كبير فهمنا للأحداث الجزيئية التي تنطوي على جوانب متعددةمن البيولوجيا المعوية، بما في ذلك الخلايا الظهارية سفك 8، وتنظيم وظيفة الحاجز الظهاري9 ،10،عينة الخلية النقوي من المحتويات المضيئة11،12، وتفاعلات المضيف ميكروب11،13،14،15،16 . في سياق علم الأحياء IEL، وقد ألقى استخدام المجهر داخل الفيتال الضوء على ديناميات المكانية الصدغية من الحركة IEL والعوامل التي تتوسط سلوك المراقبة13،14،15، 16. تطور TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) مراسل الفئران, الذي تسميات + IELs من قبل التعبير النووي GFP17, كشفت أن المحطات المثيلة هي motile عالية داخل ظهارة ومعرض سلوك مراقبة فريدة من نوعها التي تستجيب للميكروبات العدوى17,13,14. في الآونة الأخيرة، تم تطوير آخر ماوس مراسل الخلية t γδ (Tcrd-GDL) الذي يعبر عن GFP في السيتوبلازم للسماح تصور الخلية بأكملها18. وقد استخدمت منهجية مماثلة للتحقيق في متطلبات مستقبلات كيميائية محددة، مثل مستقبلات G البروتين مقرونة (GPCR)-18 و -55، على ديناميات الحركة IEL19،20. في غياب مراسل خلية محددة، استخدمت الأجسام المضادة المترافقة الفلورسنت ضد CD8α لتصور وتتبع حركة IEL في الجسم الحي19،20. على الرغم من أن المجهر المسح الضوئي بالليزر باثنين من الفوتونات يستخدم عادة في التصوير داخل الفيتال، فإن استخدام المجهر الليزري البؤري للقرص الدوار يوفر مزايا فريدة لالتقاط صور عالية السرعة وعالية الدقة متعددة القنوات مع الحد الأدنى من الضوضاء الخلفية. هذه التكنولوجيا مثالية لتوضيح الديناميات المكانية المكانية المكانية للتفاعلات المناعية/الظهارية داخل البيئة الدقيقة المعقدة للغشاء المخاطي المعوي. وعلاوة على ذلك، من خلال استخدام مختلف نماذج الماوس المعدلة وراثيا و / أو خروج المغلوب، وهذه الدراسات يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في التنظيم الجزيئي للمناعة المعوية و / أو وظيفة الخلية الظهارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع الدراسات في جمعية تقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوانات (ALAC) المعتمدة منشأة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها روتجرز نيو جيرسي كلية الطب الطب المقارن الموارد.
1. إعداد الماوس
ملاحظة: الإجراء التالي، بما في ذلك تحضير الحيوانات والجراحة، يستغرق 30-40 دقيقة قبل الجراحة، تشغيل المجهر وتسخين الحاضنة المغلقة على المجهر إلى 37 درجة مئوية.
- إجراء تجارب على الفئران TcrdEGFP 8-10 أسابيع القديمة على خلفية C57BL/6، والتي تم الحصول عليها من برنارد ماليسن (INSERM، باريس، فرنسا). ووفقاً للإجراء المعتمد من قبل الاتحاد الدولي للقضاء على الفقدان، يقوم بالتخدير بواسطة حقن الكيتامين (120 ملغم/كغم) وإكسيلازين (10 ملغم/كغم) على أساس وزن الحيوان. تقييم مستوى التخدير عن طريق معدل التنفس (55-65 نفسا في الدقيقة الواحدة)21، وقرصة إصبع القدم وردود الفعل الشاحب.
- بمجرد الوصول إلى التخدير بالطائرة الجراحية، قم بتأمين الساقين الخلفيتين للفأر باستخدام شريط إلى وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم، والتي يمكن رصدها بواسطة ميزان الحرارة المستقيم. إذا كانت هناك علامات على أن التخدير هو قبالة (على سبيل المثال، زيادة معدل التنفس، وامض و / أو العين العضلات الوخز استجابة لانعكاس بالببرال)، إعادة إدارة 50 ميكرولتر من الكيتامين / إكسيلازين في وقت واحد حتى يتم تخدير الماوس تماما.
- إعداد الصبغة النووية عن طريق تخفيف 50 μL من Hoechst 33342 (10 ملغ / مل) مع 315 ميكرولتر من 0.9٪ المالحة; التركيز النهائي هو 37.5 ملغم/كغم على أساس وزن الماوس (200 ميكرولتر الحجم التقريبي). مرة واحدة يتم تخدير الماوس، وحقن ببطء Hoechst باستخدام حقنة درنة من خلال الجيوب الوريدية الرجعية المدارية.
ملاحظة: انتظر 1-2 دقيقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية للسماح للماوس بالتكيف مع التغير في حجم التداول بعد الحقن المداري الرجعية. - ضع كمية صغيرة من مواد التشحيم على العينين لمنعها من الجفاف.
2. جراحة الفأر: البطن لفضح الغشاء المخاطي المعوي
- إجراء شق عمودي 2 سم من خلال الجلد والصفاق على طول خط الوسط من أسفل البطن لخارج منطقة الأمعاء ليتم تصويرها.
- باستخدام ملقط الزاوية، وسحب بعناية cecum من تجويف الصفاوية وتحديد منطقة الأمعاء الدقيقة ليتم تصويرها. يجب الحرص على عدم تمزيق الأوعية الدموية المساريقية خلال هذه العملية. لتقليل الضرر أو النزيف المحتمل، تجنب الاستيلاء على الأمعاء أو معسر هابس هابس.
- حدد منطقة ملائمة من الأمعاء الدقيقة (2-3 سم) للتصوير الذي يحتوي على أقل قدر من محتويات البراز. إعادة بعناية التجويف الدقيق والأمعاء الدقيقة المتبقية إلى تجويف الصفاون، مع ترك الجزء من الاهتمام خارجيا.
ملاحظة: تجنب ثقب الأوعية الدموية أو تعطيل الأوعية الوعائية المساريقية خلال هذه الخطوة. - ضع زوجين من الملقط على جانبي الموضع الكامنة بين الأوعية الدموية، وفرك بلطف نصائح الملقط معا لخلق ثقب في الغشاء (الشكل1)22. وهذا سوف يسمح للإبرة لتمرير من خلال mesentery عند إغلاق تجويف الصفايا تحت الأمعاء.
- أغلق الشق مع الحفاظ على حلقة الأمعاء الخارجية. باستخدام ملقط الزاوية ومنحنية، تفتق نقطة إبرة تعلق على خياطة 5 سم، واختراق جانب واحد من البصاق، انتقل من خلال ثقب المحرز في الخطوة السابقة، وحتى من خلال الجانب الآخر من بطانة البصاق. ضع خيطاً واحداً في الأعلى، وآخر بالقرب من الجزء السفلي من الشق.
ملاحظة: تجنب الإضرار بالأوعية الدموية أثناء هذه الخطوة. - كرر هذه العملية لإغلاق الجلد تحت حلقة الأمعاء، عن طريق وضع خياطة واحدة في منتصف الشق، بين الغرز السابقة في البِاقَلة الكامنة.
ملاحظة: من المهم فقط أن تُستبعد المنطقة التي يجب تصويرها؛ وهذا سوف يقلل من الحركة الدخيلة أثناء التصوير. تأكد من تجنب ربط قبالة الشرايين المساريقية. - استخدام الكواتيري الكهربائي لجعل خط من ثقب على طول الحدود المضادة للخط. مباشرة بعد الكي، وتطبيق بضع قطرات من الماء على سطح الأمعاء لمنع أضرار إضافية الأنسجة الناجمة عن الحرارة. قم بلط مُنَزَه بـ Kimwipe لإزالة الماء المتبقي.
- قطع شق أفقي صغير على الحافة البعيدة للأنسجة الكيّة باستخدام مقص فاناس والمضي قدما في قطع طول الخط الكي نحو الطرف القريب من الجزء الخارجي من الأنسجة (حوالي 1.5 سم في الطول) لفضح الغشاء المخاطي السطح.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم الملقط لإزالة أي محتوى برازي زائد متبقي على السطح المخاطي المكشوف. - تغطية بطن الماوس مع Kimwipe رطبة لمنع الأنسجة من أن تصبح جافة. نقل الماوس إلى المجهر في وعاء مغطى.
3. الحصول على صورة بواسطة القرص الغزل كونبوكلوسكوبي
- ماصيت 150 ميكرولتر من 1 ميكرومتر أليكسافلور 633 في HBSS على أغطية الزجاجأسفل من طبق 35 مم. وضع الماوس بحيث السطح المخاطي فتح يتصل مباشرة غطاء.
- إمالة رأس المجهر مرة أخرى ووضع الماوس على طبق يغطي انزلق على مرحلة التصوير في حاضنة ما قبل تسخينها. بدلا من ذلك، وتغطي الماوس عن طريق بطانية التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
- إطلاق برنامج التصوير. يجب ألا تتجاوز كثافة الإثارة ووقت التعرض لكل ليزر 10-15 مللي واط أو 120-150 مللي ثانية، على التوالي، لتجنب التبييض الضوئي ولتقليل الفاصل الزمني بين النقاط الزمنية. اضبط متوسط الإطار إلى "2" واضبط وظيفة كسب EM لتقليل الضوضاء في الخلفية. حدد المعايرة الموضوعية 63x لضمان القياس الصحيح لحجم البكسل.
ملاحظة: الإعدادات المفصلة أعلاه تهدف إلى توفير مرجع أولي، ولكن سوف تختلف تبعاً لتكوينات المجهر الفردية. - باستخدام الليزر 405 نانومتر والهدف الجوي 20X، تصور النوى لتحديد موقع حقل من الزغب التي تفتقر إلى حركة ملحوظة أو الانجراف عن طريق العين. تجنب مناطق الحركة الارتبية بسبب التنفس أو التمعج أو ضربات القلب.
- باستخدام المسح الضوئي XY، تسجيل إحداثيات XY من مجال الاهتمام والتبديل إلى الغمر الغليسي هدف 63X.
- تأكد من أن الزغب في الحقل المحدد مستقر من خلال الحصول على صورة حية على قناة 405 نانومتر لمدة تصل إلى دقيقة واحدة.
- أثناء الحصول على صورة حية على قناة 405 نانومتر، ضبط التركيز للعثور على الطائرة المتعامدة فقط تحت طرف متعرج. الحصول على Z-المكدسات بدءا من أسفل ظهارة طرف أسفل الفيلز حتى أنه من الصعب حل النوى، حوالي 15-20 ميكرون، وذلك باستخدام خطوة 1.5 ميكرومتر.
ملاحظة: عند التصوير بثلاث قنوات (405، 488، 640 نانومتر) باستخدام أوقات التعرض المذكورة أعلاه، فمن الممكن الحصول على جميع القنوات الثلاث بالتتابع على فترات 20 ثانية تقريبا. - افتح البرنامج في وضع التحليل، 3-5 دقيقة بعد البدء في عملية الاستحواذ، لتأكيد استقرار الصورة وحركة iEL. استمر في الحصول على صور لمدة 30-60 دقيقة لكل حقل من حقول الزغب. سجل 2-3 حقول لكل ماوس. أثناء التصوير، راقب الماوس كل 5 دقائق.
ملاحظة: إذا بدأ التخدير في التآكل، استخدم الملقط لقشر ةيبلطف عنق الفأر لتدبير 50 ميكرولتر من الكيتامين/الزيلازين في وقت واحد. استمر في مراقبة مستويات التخدير وإعادة إدارتها عند الضرورة. - ليس من المستحسن لتصوير ماوس واحد لفترة أطول من 4 ح. بمجرد اكتمال الحصول على صورة، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم تليها استرواح الصدر الثنائية.
4. 4D تحليل الصور
- استيراد ملفات الصور مباشرة إلى برامج التجسيد 4D.
- إنشاء أسطح فردية لـ IELs والتجويف، ثم تتبع الأسطح مع مرور الوقت باستخدام المعلمات الموضحة في الجدول 1 كمرجع أولي. بالنسبة لـ IELs، قم بتمكين كائنات اللمس سبليت باستخدام قطر نقطة البذور المشار إليه.
- استخدم خوارزمية التتبع التلقائي لتحديد حركة IEL. على الرغم من أن خوارزمية التتبع دقيقة نسبيا، فإنه من الضروري لفحص بصريا المسارات لكل IEL الفردية. إذا كان المسار غير صحيح، قم بتصحيحه باستخدام دالات قطع الاتصال والاتصال ضمن علامة التبويب تحرير المسارات.
- لتحديد المسافة من كل IEL إلى التجويف، حدد سطح التجويف وقم بوظيفة تحويل المسافة ضمن قائمة الأدوات. عند المطالبة، حدد خارج Surface. بمجرد حساب، سيتم عرض تحويل المسافة كقناة 4.
- قم بتصفية الحد الأدنى للقناة الرابعة لتحديد الـ iels γδ الموجودة في الفضاء الجانبي بين الخلايا (LIS). يجب أن تكون هذه القيمة قريبة من 15 ميكرومتر، استناداً إلى ارتفاع خلية عمودية ظهارية. يتم الإبلاغ عن النسبة المئوية لمجموع الـ iels في هذا النطاق كتردد لـ (Δ IELs) في LIS.
- لمزيد من التحليل، تصدير البيانات الإحصائية بما في ذلك: IEL سرعة المسار، وتتبع النزوح، وتتبع الاستقامة وطول المسار. بدلاً من ذلك، تحليل البيانات باستخدام الوحدة النمطية Vantage. اعتمادا على التجربة، الحصول على مقاييس إضافية من البيانات المكتسبة، بما في ذلك وقت الإيذب في LIS أو IEL/التفاعلات الظهارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام التصوير داخل الحيات من الفئران مراسل TcrdEGFP، وقد أظهرنا سابقا أن + Δ IELs يحمل سلوك مراقبة ديناميكية، التي تقوم بدوريات في ظهارة عن طريق الهجرة على طول غشاء الطابق السفلي وإلى الفضاء الجانبي بين الخلايا (LIS) في ثابت الدولة (الشكل 2, فيلم 1).
ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتقييم كيفية تثبيط مسارات إشارة خلية محددة و / أو مستقبلات يؤثر على سلوك الهجرة iEL. على سبيل المثال، interleukin (IL)-15 هو cytokine البنيوتروبيك الذي هو ضروري لـ +δ IEL التوازن23،24. لتحديد ما إذا كان IL-15 الإشارات من خلال مستقبلات IL-2Rβ يساهم في حركية الحركة iEL δ في حالة ثابتة، تم تصوير الفئران مراسل TcrdEGFP 2 ح بعد إدارة الأجسام المضادة للIL-2Rβ (TM-+1) أو ISOType IgG2b التحكم. تشير المسارات الملونة مسارات الهجرة من IELs γδ الفردية على مدى 30 دقيقة (الشكل 3A). على الرغم من أن تردد الـ iels في الـ lis زاد في الفئرانالمعالجة بـ TM-β1 (الشكل3A, B), أكثر من 30% من هذه الـ IELs التي تحتوي على الـ γδ أظهرت سلوكاً للتسكع (الشكل 3A,C). تم تعريف خمول الـ iels γδ بفرض حدود عليا على استقامة المسار وطول الإزاحة. وقد تم تأكيد هذا النمط الظاهري تسكع من خلال انخفاض كبير في كل من سرعة فورية ونسبة الحبس من الليفية δ بعد IL-2Rβ الحصار بالنسبة للتحكم (الشكل 3D,E). وعلاوة على ذلك، فإن الـ iels الساكنة الساكنة لها أوقات أطول، وكانت أكثر تواتراً في حدود LIS مقارنة بـ motile γδ IELs (الشكل3F).
الشكل 1: استخدام الملقط لإنشاء ثقب في الموضع. ضع الملقط على جانبي الغشاء لإنشاء ثقب للخياطة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة تمثيلية ثلاثية الأبعاد لـ iels في الـ "الـ "سيو" في "جيجونوم". تم اختيار نقطة زمنية واحدة من شريط فيديو الفاصل الزمني من التقاط الغشاء المخاطي للفأر مراسل TcrdEGFP في حالة ثابتة. تظهر الـ iels بالأخضر، والنوى باللون الأبيض، والتجويف باللون الأحمر. شريط مقياس = 30 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تثبيط IL-2Rβ يحفز التسكع iEL δ δ في الفضاء الجانبي بين الخلايا. وقد تم تكييف هذا الرقم من "الظهارية IL-15 هو منظم حاسم من δ الخلايا اللمفاوية داخل الظهارة اللازية حركية داخل الغشاء المخاطي المعوي." من قبل هو, M. D. وآخرون. 2018, J المناعة, 201 (2), p. 747-756. 15 حقوق الطبع والنشر 2018 من قبل الجمعيةالأمريكية لعلماء المناعة, Inc. ( A) الوقت الفاصل بين الصور التي تظهر المهاجرة GFP γδ IELs داخل ظهارة ة بعد 2 ح العلاج مع 0.45 ملغ من IgG2b أو TM-β1. يتم عرض الحركة من ال [ف] فرديّة [γδ] [إيل] (اللون الأخضر) على المسلك من 30 [مين] مع يلوّن آثار. تظهر النوى باللون الأبيض، ويظهر التجويف باللون الأحمر. أشرطة المقياس = 20μm. ( B) تردد الـ iels γδ في LIS (n = 3 فئران لكل علاج، n = 6-7 أشرطة فيديو). (C) النسبة المئوية لـ iels δ التي كانت خاملة في الفئران المعاملة IgG2b أو TM-β1. (D) سرعة لحظية (n = 13,299 و 9,600 نقطة زمنية). (E) تظهر نسب الولادات (n = 350 و 278 مسار). (F) المسافة من الخمول وmotile γδ IELs من التجويف. يظهر المتوسط + SEM (+). * p < 0.05, ** p < 0.01, #p < 0.0001. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| IEL | التجويف | |
| تفاصيل السطح (ميكروم) | 1-2 | 1.5 |
| الطرح في الخلفية (ميكروم) | 1.67 | 2 |
| قطر نقاط البذور (ميكروم) | 7.5 | غير مـن |
| مرشح: عدد من فوكسل | 250 | 6,500 |
| تتبع: المسافة القصوى (ميكروم) | 10 | 10 |
| تتبع: أقصى فجوة | 2 | 2 |
الجدول 1: إعدادات التمثيل للإنشاء [ا] [إل] و [إينمرل] "سطوح" في [إيماريس]. يمكن استخدام هذه الإعدادات كنقطة انطلاق عند إنشاء وتتبع الأسطح لقناة 488 نانومتر (IEL) وقناة 640 نانومتر (لومن). اعتماداً على الظروف التجريبية، قد تحتاج هذه الإعدادات إلى تعديل.
فيلم 1: التصوير داخل الفيتال من GFP [ميو] δ [إيل] مهاجرة تصرف في فأرة [جوجنوم]. التنظير المجهري داخل الحيات الفاصل الزمني لحركية iEL في الـ "غاما" في الـ "جي جي" من فأرة TcrdEGFP المعالجة بـ 0.45 ملغ من IgG2b. تظهر الـ iels في اللون الأخضر، والنوى باللون الأزرق، والتجويف باللون الأحمر. شريط مقياس، 20 ميكرومتر. تم جمع الإطارات كل 30 ق لمدة 30 دقيقة تقريبا. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أتاح تطوير تقنيات الفحص المجهري داخل الفيتال فرصة غير مسبوقة لمراقبة إعادة تنظيم الهياكل الفرعية8و9و22و تفاعلات الخلية12، 25 وسلوك هجرة الخلية13،14،15،16،26 في الأنسجة التي يتعذر الوصول إليها خلاف ذلك. كان هناك نقص عام في الأدوات اللازمة لدراسة تنظيم ووظيفة الـ iels في الجسم الحي18،27، ونتيجة لذلك ، فتح استخدام التصوير داخل الفيتال سبلا جديدة للتحقيق فيما يتعلق بالتنظيم الجزيئي و الخصائص الوظيفية للسكان IEL13،14،15،16،20. كان يفترض في السابق أن تكون الغشاء المخاطي في الأمعاء28ثابتة داخل الغشاء المخاطي للمعوي. ومع ذلك، أظهر مزيد من التحليل أن هذه الخلايا هي ديناميكية للغاية، ولكن تهاجر ببطء أكبر من الخلايا الليمفاوية في الأعضاء اللمفاوية الثانوية بسبب ضيق حدود المقصورة الظهارية13. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام في التصوير الحي قد وفرت نظرة ثاقبة إضافية في ديناميات المكانية الصدغية من السلوك مراقبة iEL، بما في ذلك التكلم المتبادل بين الخلايا الظهارية وIELs التي تدفع الحركية iEL والدالة13، 14 , 15 , 16. وقد حدد تحليل هذا السلوك الهجرة مقاييس جديدة لاستجابات IEL الخلوية التي لم تكن قابلة للقياس الكمي بدقة باستخدام التجارب الحية أو المختبرية.
طوال الإجراء بأكمله، من الضروري مراقبة مستوى التخدير باستمرار من الماوس. يمكن استخدام الإدارة المستمرة للتخدير الغازي (isoflurane) كبديل للكيتامين / إكسيلازين. عند إجراء عملية استئصال البطن، من المهم جداً الحفاظ على الإمدادات العصبية الوعائية سليمة لتوفير تقييم دقيق للبيولوجيا. يمكن أن يؤدي ربط الأوعية الدموية المساريقية إلى نقص الأكسجة والنخر التدريجي للأنسجة. وعلى النقيض من ذلك، فإن قطع الأوعية الدموية يؤدي إلى نزيف في الغشاء المخاطي المكشوف، مما يمكن أن يقلل من شدة الفلورسنت لبعض القنوات أثناء التصوير. إذا كانت المحطات الدائرية (IELs) تطور مورفولوجيا مستديرة وتتوقف عن التحرك أثناء اكتساب الصورة، فقد يكون ذلك بسبب انخفاض طفيف في درجة حرارة جسم الفأر. وضع استشعار درجة الحرارة بالقرب من مرحلة المجهر يضمن أن يتم الحفاظ على درجة الحرارة في موقع الغشاء المخاطي المكشوفة في 37 درجة مئوية. قد يكون من الضروري رفع درجة الحرارة إلى 38-39 درجة مئوية اعتمادا على استقرار درجة الحرارة في غرفة الحضانة.
بمجرد وضع الماوس على مرحلة المجهر ، قد يكون من الصعب تحديد حقول الزغب التي تفتقر إلى الحركة المفرطة بسبب التمعج أو انكماش الأوعية الدموية المجاورة. إذا حدث ذلك، قم بإعادة وضع الماوس داخل الطبق أو التعامل مع جوانب الماوس خارجياً في محاولة لحزمة الزغب بإحكام ضد الغطاء. بدلا من ذلك، قد يصبح حقل التصوير أكثر استقرارا بعد بضع دقائق من وضع الماوس على خشبة المسرح. إذا كان هناك انحراف تدريجي XY أثناء عملية الاستحواذ، يمكن تصحيح هذا باستخدام تصحيح الانجراف في برنامج التقديم 4D عن طريق اختيار 4-5 نوى الموجودة في مواقع مختلفة من الصورة طوال الدورة الزمنية وتتبع بقعة لكل نواه. بمجرد إنشاء البقع، حدد "الانحراف الصحيح" ضمن قائمة "تحرير المسار" لتصحيح الانجراف الترجمة. ومن المهم أن يتم تصحيح الانجراف قبل أي تحليل آخر، لأن هذا سيغير الإحداثيات المستخدمة لتتبع الأجسام الأخرى في الصورة.
على الرغم من أن الفوتونين ليزر المسح المجهري يسمح لعمق واسع من التصوير التي هي مفيدة لاختراق عميق في الأنسجة29،والغزل القرص الليزر مجهر لها مزايا فريدة من نوعها لتطبيقات التصوير داخل vital. يعتمد المجهر الضوئي للمسح الضوئي بالليزر بفوتونعلى أنابيب مضاعفة للضوء (PMT) التي يمكنها اكتشاف بكسل واحد فقط في كل مرة بكفاءة كمية تُقدّم من 40 إلى 50%. وعلى النقيض من ذلك، يستخدم المجهر الليزري البؤري للقرص الدوار كاميرا CCD لمضاعفة الإلكترونات (EM) للكشف مباشرة عن ما يصل إلى مليون بكسل في وقت واحد، مما يزيد من كفاءة الكم إلى 95%. ونتيجة لذلك، فإن احتمال ية التبييض الضوئي وتلف الصورة ينخفض بشكل كبير، في حين أن زيادة سرعة الاقتناء تزيد من الدقة الزمنية عند نقل خلايا التصوير في الأنسجة السطحية. بغض النظر عن طريقة التصوير، هذا الإجراء الجراحي هو مثالي لفضح الغشاء المخاطي المعوي للتصوير على المجهر المقلوب.
مع تزايد توافر سلالات الماوس التي تعبر عن مراسلين الفلورسنت، تحقيقات ذات العلامات الفلورية أو سلالات الفلورسنت من الكائنات الحية الدقيقة التي تم إنشاؤها في العديد من الأطوال الموجية، وتركيبات لتقييم في الأمعاء الحي الردود في الوقت الحقيقي لا نهاية لها. لا يمكن للتصوير داخل الحيوية توفير نظرة جديدة في التفاعلات خلية الخلية والمضيف-ميكروب، ولكن يمكن أيضا تسليط الضوء على العمليات الجزيئية والخلوية الديناميكية في كل من الخلايا الظهارية والمناعية في ظل ظروف الهيموستات أو المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R21 AI143892، نيو جيرسي منحة مؤسسة الصحة، بوش الطبية الحيوية غرانت (KLE). نشكر مادلين هو على مساعدتها في تحرير المخطوطة وتقديم البيانات الواردة في النتائج التمثيلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
