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Immunology and Infection

मौरीन स्मॉल इन्टेने्टर में इंट्राएपिथेल लिम्फोसाइट्स का इंट्रावाइटल इमेजिंग

doi: 10.3791/59853 Published: June 24, 2019

Summary

हम वर्धक-लेबलित आईईएल को उलटे कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मौरीन छोटी आंत के इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करके जीएफपी-लेबल वाली आईईएल की कल्पना करने की विधि का वर्णन करते हैं। इस तकनीक अप करने के लिए श्लेष्म के भीतर जीवित कोशिकाओं की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है 4 ज और आंतों प्रतिरक्षा-उपकला बातचीत की एक किस्म की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

आंतों के उपकला की प्रतिरक्षा निगरानी में इंट्राएपिथेल लिम्फोसाइट्स व्यक्त करने वाले टी सेल रिसेप्टर (जेड आईईएल) की प्रतिरक्षा निगरानी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। $ टी सेल रिसेप्टर के लिए एक निश्चित लिगन्ड की कमी के कारण, $ आईईएल सक्रियण के विनियमन की हमारी समझ और विवो में उनके कार्य सीमित रहता है। यह संकेत नरेषद ोंकाको विनियमित करने में शामिल संकेतन मार्गों से पूछताछ करने के लिए वैकल्पिक रणनीतियों के विकास और स्थानीय सूक्ष्म पर्यावरण के लिए इन कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है। यद्यपि रोगजनक स्थानांतरण को सीमित करने के लिए व्यापक रूप से समझ में आ जाता है, अंतःशिरात इमेजिंग का उपयोग स्थिर-स्थिति में और आक्रामक रोगजनकों के जवाब में आईईएल/एपिथेलियल बातचीत की स् पैटियोटेम्पोरल गतिशीलता को समझने के लिए महत्वपूर्ण रहा है। इसमें, हम एक GFP के छोटे आंत्र mucosa में आईईएल प्रवासी व्यवहार visualizing के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत - टी सेल रिपोर्टर माउस उल्टे कताई डिस्क confocal लेजर माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर. हालांकि इस दृष्टिकोण की अधिकतम इमेजिंग गहराई दो-फोटोन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के उपयोग के सापेक्ष सीमित है, कताई डिस्क confocal लेजर माइक्रोस्कोपी कम photobleaching के साथ उच्च गति छवि अधिग्रहण का लाभ प्रदान करता है और फोटो नुकसान. 4D छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, टी सेल निगरानी व्यवहार और पड़ोसी कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत प्रयोगात्मक हेरफेर के बाद विश्लेषण किया जा सकता है आईईएल सक्रियण और आंतों mucosa के भीतर समारोह में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.

Introduction

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इंट्राएपिथेल लिम्फोसाइट्स (आईईएल) आंतों के उपकला के भीतर स्थित होते हैं, और दोनों तहखाने झिल्ली के साथ और पार्श्व अंतरकोशिकीय अंतरिक्ष1में आसन्न उपकला कोशिकाओं के बीच पाए जाते हैं। हर 5-10 उपकला कोशिकाओं के लिए लगभग एक आईईएल है; ये आईईएल आंत्र उपकला बाधा2के बडे विस्तार की प्रतिरक्षा निगरानी प्रदान करने के लिए प्रहरी के रूप में कार्य करते हैं . आईईएल जो कि जेड टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) को व्यक्त करता है, में यूरीन छोटी आंत में कुल आईईएल जनसंख्या का 60% तक शामिल होता है। [ टी-सेल की कमी वाले चूहों में अध्ययन आंतों की चोट, सूजन और संक्रमण3,4,5के जवाब में इन कोशिकाओं की काफी सुरक्षात्मक भूमिका प्रदर्शित करते हैं । Tcrd नॉकआउट माउस6के उत्पादन के बावजूद , IEL जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ इस तथ्य के भाग में सीमित है कि ligands द्वारा मान्यता प्राप्त अभी तक7की पहचान की जानी है . नतीजतन, इस सेल आबादी का अध्ययन करने के लिए उपकरणों की कमी ने शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत टीसीआर सक्रियण और कार्य की भूमिका की जांच करना मुश्किल बना दिया है। इस अंतर को भरने के लिए, हमने विवो में बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करने के साधन के रूप में आईईएल प्रवासी व्यवहार और पड़ोसी आंत्रकोशिकाओं के साथ बातचीत को विज़ुअलाइज़ करने के लिए लाइव इमेजिंग तकनीक विकसित की है।

पिछले दशक में, intravital इमेजिंग काफी आंतों जीव विज्ञान के कई पहलुओं में शामिल आणविक घटनाओं की हमारी समझ का विस्तार किया गया है, उपकला सेल बहा8सहित, उपकला बाधा समारोह 9 के विनियमन ,10, luminal सामग्री के माइलॉयड सेल नमूना11,12, और मेजबान microbe बातचीत11,13,14,15,16 . आईईएल जीव विज्ञान के संदर्भ में, इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के उपयोग ने आईईएल गतिशीलता की spatiotemporal गतिशीलता और उनके निगरानी व्यवहार को मध्यस्थता करने वाले कारकों पर प्रकाश डालाहै 13,14,15, 16. TcrdH2BeGFP के विकास (TcrdEGFP) रिपोर्टर चूहों, जो परमाणु GFP अभिव्यक्ति17द्वारा IELs लेबल , पता चला है कि - आईएलएस उपकला के भीतर अत्यधिक गतिशील हैं और एक अद्वितीय निगरानी व्यवहार है कि माइक्रोबियल के लिए उत्तरदायी है प्रदर्शन संक्रमण17,13,14. हाल ही में, एक और जेड टी सेल रिपोर्टर माउस विकसित किया गया था (Tcrd-GDL) जो कोशिका द्रव्य में GFP व्यक्त करने के लिए पूरे सेल18के दृश्य की अनुमति है. इसी प्रकार की पद्धति का उपयोग विशिष्ट कीमोकीन रिसेप्टर्स की आवश्यकता की जांच करने के लिए किया गया है, जैसे जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर)-18 और -55, आईईएल गतिशीलता की गतिशीलता पर19,20. एक सेल-विशिष्ट संवाददाता की अनुपस्थिति में, सीडी 8 के विरुद्ध फ्लोरोसेंट संयुग्मी एंटीबॉडी का उपयोग विवो19,20में आईईएल गतिशीलता की कल्पना और ट्रैक करने के लिए किया गया था। हालांकि दो फोटोलेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी आमतौर पर intravital इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है, कताई डिस्क confocal लेजर माइक्रोस्कोपी का उपयोग कम से कम पृष्ठभूमि शोर के साथ उच्च गति और उच्च संकल्प मल्टी चैनल छवियों पर कब्जा करने के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करता है. यह प्रौद्योगिकी आंतों के श्लेष्म के जटिल सूक्ष्म पर्यावरण के भीतर प्रतिरक्षा/उपथीली बातचीत की spatiotemporal गतिशीलता को स्पष्ट करने के लिए आदर्श है। इसके अलावा, विभिन्न ट्रांसजेनिक और/

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Protocol

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सभी अध्ययनों के आकलन और प्रयोगशाला पशु देखभाल के प्रत्यायन के एक संघ में आयोजित किया गया (AALAC) Rutgers न्यू जर्सी मेडिकल स्कूल तुलनात्मक चिकित्सा संसाधन द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार मान्यता प्राप्त सुविधा.

1. माउस की तैयारी

नोट: पशु तैयार करने और सर्जरी सहित निम्नलिखित प्रक्रिया, 30-40 मिनट लगेंगे, सर्जरी से पहले, माइक्रोस्कोप चालू करें और माइक्रोस्कोप पर संलग्न इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।

  1. एक C57BL/6 पृष्ठभूमि पर 8-10 सप्ताह पुराने TcrdEGFP चूहों पर प्रयोगों प्रदर्शन, जो बर्नार्ड Malissen (INSERM, पेरिस, फ्रांस) से प्राप्त किए गए थे. आई सी सी सी-अनुमोदित प्रक्रिया के अनुसार, जानवर के वजन के आधार पर केटामाइन (120 मिलीग्राम/किग्रा) और जाइलेज़ीन (10 मिलीग्राम/किग्रा) के इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें। श्वसन दर (55-65 प्रति मिनट सांस)21,टो चुटकी और palpebral प्रतिवर्त द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का मूल्यांकन करें।
  2. एक बार शल्य विमान संज्ञाहरण तक पहुँच गया है, शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड के लिए टेप का उपयोग कर माउस के पिछले पैर सुरक्षित, जो गुदा थर्मामीटर द्वारा नजर रखी जा सकती है। यदि संकेत हैं कि संज्ञाहरण बंद पहने हुए है (जैसे, वृद्धि श्वसन दर, निमिष और / या आंख की मांसपेशी palpebral पलटा करने के लिए प्रतिक्रिया twitching), फिर से प्रशासन 50 ketamine /
  3. Hoechst 33342 (10 mg/mL) के 50 डिग्री सेल्सियस को कम करके नाभिकीय रंजक को 0.9% लवण के 315 $L के साथ तैयार करें; माउस (200 डिग्री एल अनुमानित आयतन) के वजन के आधार पर अंतिम सांद्रता 37.5 मिलीग्राम/किलोग्राम है। एक बार माउस एनेस्थेटाइज़ किया जाता है, धीरे-धीरे रेट्रो-ऑर्बिटल शिरापरक साइनस के माध्यम से एक ट्यूबरकुलिन सिरिंज का उपयोग करके होचस्ट को इंजेक्ट करें।
    नोट: रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन के बाद परिसंचरण मात्रा में परिवर्तन करने के लिए माउस acclimate करने के लिए अनुमति देने के लिए अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले 1-2 मिनट प्रतीक्षा करें।
  4. उन्हें बाहर सुखाने से रोकने के लिए आंखों पर स्नेहक की एक छोटी राशि रखें।

2. माउस सर्जरी: आंत्र म्यूकोसा उजागर करने के लिए Laparotomy

  1. त्वचा के माध्यम से एक 2 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा बनाओ और निचले पेट की मिडलाइन के साथ peritoneum आंत के क्षेत्र को बाहरी करने के लिए छवि हो.
  2. कोण वाले संदंश का उपयोग करके, सीकम को पर्टोनल गुहा से बाहर निकाल दें और छोटी आंत के क्षेत्र की पहचान करें। इस प्रक्रिया के दौरान मध्यरक्त रक्त वाहिकाओं को फाड़ने के लिए सावधान रहें। संभावित नुकसान या खून बह रहा कम से कम करने के लिए, बल के साथ आंत को हथियाने या चुटकी लेने से बचें।
  3. इमेजिंग के लिए छोटी आंत (2-3 सेमी) के एक उपयुक्त क्षेत्र का पता लगाएँ जिसमें न्यूनतम मल की सामग्री होती है। ब्याज के खंड को बाहरी छोड़ने के दौरान, सावधानी से सीकम और शेष छोटी आंत को पेरिटोनल गुहा में वापस करें।
    नोट: इस चरण के दौरान सीकम को सजाने या मेसेंटेरिक वास्कुलेचर को बाधित करने से बचें।
  4. रक्त वाहिकाओं के बीच अंतर्निहित आंत्रप्रेनरी के दोनों ओर दो जोड़े बलच रखें और झिल्ली में एक छिद्र बनाने के लिए बलप्स के सुझावों को धीरे से रगड़ें (चित्र 1)22. यह सुई आंत्र के नीचे peritoneal गुहा बंद करते समय आंत्र के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देगा।
  5. आंत के पाश को बाह्यीकृत रखते हुए चीरा बंद करें। angled forceps और एक घुमावदार, टेपर बिंदु सुई एक 5 सेमी सीवन से जुड़ी का उपयोग करना, peritoneum के एक तरफ घुसना, पिछले कदम में किए गए छेद के माध्यम से जाना, और peritoneal अस्तर के दूसरे पक्ष के माध्यम से. शीर्ष पर एक सीवन रखें, और चीरा के नीचे के पास एक और.
    नोट: इस चरण के दौरान vasculature को नुकसान पहुंचाने से बचें।
  6. इस प्रक्रिया को दोहराएँ आंतों के पाश के नीचे त्वचा को बंद करने के लिए, चीरा के बीच में एक सीवन रखकर, अंतर्निहित peritoneum में पिछले टांके के बीच.
    नोट: यह केवल क्षेत्र है कि छवि के लिए है बाह्य करने के लिए महत्वपूर्ण है; यह इमेजिंग के दौरान बाहरी गति को कम करेगा। आंत्रधम्य धमनियों को बांधने से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
  7. एंटी-मेसेंटेरिक सीमा पर छिद्र की एक लाइन बनाने के लिए एक इलेक्ट्रोक्यूटरी का उपयोग करें। cauterization के तुरंत बाद, अतिरिक्त गर्मी प्रेरित ऊतक क्षति को रोकने के लिए आंत की सतह के लिए पानी की कुछ बूँदें लागू होते हैं। अवशिष्ट पानी को हटाने के लिए एक Kimwipe के साथ ब्लॉट.
  8. Vannas कैंची का उपयोग कर cauterized ऊतक के distal किनारे पर एक छोटी सी क्षैतिज भट्ठा कट और बाहरी ऊतक खंड के समीचीन अंत की ओर cauterized लाइन की लंबाई के साथ कटौती करने के लिए आगे बढ़ना (लगभग 1.5 सेमी लंबाई में) mucosal का पर्दाफाश करने के लिए सतह.
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो उजागर म्यूकोसल सतह पर शेष किसी भी अतिरिक्त मल सामग्री को धीरे से हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  9. ऊतक को निर्जलित होने से रोकने के लिए माउस के पेट को एक नम किमविप से ढक दें। माउस को एक ढके हुए पात्र में सूक्ष्मदर्शी तक ले जाएं।

3. स्पिनिंग डिस्क Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि अधिग्रहण

  1. एक 35 मिमी डिश के कांच कवरफिसल्ड नीचे पर HBSS में 1 $M AlexaFluor 633 के Pipette 150 $L. माउस को रखें ताकि खोला mucosal सतह सीधे coverslip संपर्क.
  2. माइक्रोस्कोप के सिर को पीछे की ओर झुकाएं और माउस को पूर्व-वार्म्ड इनक्यूबेटर में इमेजिंग चरण पर कवरस्लिप्ड डिश पर रखें। वैकल्पिक रूप से, शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग कंबल द्वारा माउस को कवर करें।
  3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर लॉन्च करें. प्रत्येक लेजर के लिए उत्तेजना तीव्रता और जोखिम समय photobleaching से बचने के लिए और समय अंक के बीच अंतराल को कम करने के लिए, क्रमशः 10-15 mW या 120-150 एमएस से अधिक नहीं होना चाहिए। करने के लिए फ्रेम औसत समायोजित करें और पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए EM लाभ समारोह पर बारी. पिक्सेल आकार का सही माप सुनिश्चित करने के लिए 63x उद्देश्य अंशांकन का चयन करें.
    नोट: ऊपर विस्तृत सेटिंग्स एक प्रारंभिक संदर्भ प्रदान करने के लिए होती हैं, लेकिन व्यक्तिगत माइक्रोस्कोप विन्यास के आधार पर अलग अलग होंगे.
  4. 405 एनएम लेजर और 20x हवा उद्देश्य का उपयोग करना, नाभिक कल्पना villi के एक क्षेत्र है कि ध्यान देने योग्य आंदोलन की कमी है या आंख से बहाव का पता लगाने के लिए. श्वसन, peristalsis या दिल की धड़कन के कारण कृत्रिम आंदोलन के क्षेत्रों से बचें।
  5. XY स्कैन का उपयोग करना, ब्याज के क्षेत्र के XY निर्देशांक रिकॉर्ड और ग्लिसरोल विसर्जन 63X उद्देश्य के लिए स्विच.
  6. पुष्टि करें कि चयनित क्षेत्र में villi अप करने के लिए 1 मिनट के लिए 405 एनएम चैनल पर एक जीवित छवि प्राप्त करके स्थिर हैं.
  7. जबकि 405 एनएम चैनल पर एक जीवित छवि प्राप्त करने, बस ग्रामीण टिप के नीचे ऑर्थोगोनल विमान खोजने के लिए ध्यान समायोजित करें। गांव के नीचे से शुरू होने वाले जेड-स्टैक प्राप्त करें जब तक कि नाभिक को हल करना मुश्किल न हो, लगभग 15-20 डिग्री, 1.5 डिग्री मी चरण का उपयोग करके।
    नोट: जब ऊपर वर्णित जोखिम समय का उपयोग करते हुए तीन चैनलों (405, 488, 640 एनएम) के साथ इमेजिंग, लगभग 20 s अंतराल पर क्रमिक रूप से सभी तीन चैनलों को प्राप्त करने के लिए संभव है।
  8. विश्लेषण मोड में सॉफ्टवेयर खोलें, 3-5 मिनट अधिग्रहण की शुरुआत के बाद, छवि स्थिरता की पुष्टि करने के लिए - और आईईएल गतिशीलता. villi के प्रत्येक क्षेत्र के लिए 30-60 मिनट के लिए छवियों को प्राप्त करने के लिए जारी रखें। प्रत्येक माउस के लिए 2-3 फ़ील्ड रिकॉर्ड करें. जबकि इमेजिंग, माउस हर 5 मिनट की निगरानी.
    नोट: यदि संज्ञाहरण पहनना शुरू होता है, तो माउस की गर्दन को धीरे से घसीटने के लिए बल का उपयोग करें ताकि एक समय में 50 डिग्री सेल्सियस केकेटामाइन/xylazine का प्रशासन किया जा सके। संज्ञाहरण के स्तर पर नजर रखने के लिए जारी रखें और जब आवश्यक फिर से प्रशासन।
  9. यह 4 ज से अधिक समय के लिए एक एकल माउस छवि करने के लिए उचित नहीं है। एक बार छवि अधिग्रहण पूरा हो गया है, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों बलिदान द्विपक्षीय न्यूमोथोरैक्स द्वारा पीछा किया.

4. छवियों के 4D विश्लेषण

  1. 4D रेंडरिंग सॉफ़्टवेयर में इमेजिंग फ़ाइलों को सीधे आयात करें.
  2. IELs और lumen के लिए अलग-अलग सतहों बनाएँ, तो एक प्रारंभिक संदर्भ के रूप में तालिका 1 में दिए गए मापदंडों का उपयोग कर समय के साथ सतहों ट्रैक। IELs के लिए, संकेत बीज बिंदु व्यास का उपयोग कर विभाजन छू वस्तुओं को सक्षम करें।
  3. आईईएल गतिशीलता निर्धारित करने के लिए autoregressive ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म का उपयोग करें। ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म अपेक्षाकृत सटीक है, यह नेत्रहीन प्रत्येक व्यक्ति आईईएल के लिए पटरियों का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है. एक ट्रैक गलत है, तो यह डिस्कनेक्ट करें और ट्रैक्स संपादित करें टैब के तहत कनेक्ट कार्यों का उपयोग कर सही है।
  4. लुमेन के लिए प्रत्येक आईईएल से दूरी निर्धारित करने के लिए, लुमेन सतह का चयन करें और उपकरण मेनू के तहत दूरी परिवर्तन समारोह प्रदर्शन। संकेत मिलने पर, सतह से बाहरका चयन करें. एक बार गणना, दूरी परिवर्तन 4 चैनल के रूप में प्रदर्शित किया जाएगा.
  5. 4 चैनल की तीव्रता मिनट फ़िल्टर करने के लिए का चयन करने के लिए $ IELs कि पार्श्व intercellular अंतरिक्ष (LIS) के भीतर हैं. यह मान स्तंभीय उपकला कक्ष की ऊँचाई के आधार पर 15 डिग्री सेल्सियस के करीब होना चाहिए. इस श्रेणी के भीतर कुल $ आईईएल का प्रतिशत एलआईएस में $ आईईएल की आवृत्ति के रूप में सूचित किया जाता है।
  6. आगे के विश्लेषण के लिए, सहित सांख्यिकीय डेटा निर्यात: आईईएल ट्रैक गति, ट्रैक विस्थापन, ट्रैक सीधापन और ट्रैक लंबाई। वैकल्पिक रूप से, सुविधाजनक मॉड्यूल का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण. प्रयोग के आधार पर, अधिगृहीत डेटा से अतिरिक्त मीट्रिक प्राप्त करें, जिसमें LIS या IEL/epithelial इंटरैक्शन में रहने का समय शामिल है.

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Representative Results

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TcrdEGFP रिपोर्टर चूहों के intravital इमेजिंग का उपयोग करना, हम पहले से पता चला है कि - IELs एक गतिशील निगरानी व्यवहार है, जिसमें वे तहखाने झिल्ली के साथ और पार्श्व intercellular अंतरिक्ष में प्रवास द्वारा उपकला गश्ती (LIS) स्थिर पर प्रदर्शन राज्य (चित्र 2, मूवी 1) .

इस दृष्टिकोण का उपयोग यह मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है कि विशिष्ट सेल संकेतन पथों और/या रिसेप्टर्स के अवरोध को कैसे प्रभावित करता है - आईईएल प्रवासी व्यवहार। उदाहरण के लिए, इंटरलेयूकिन (आईएल)-15 एक प्लेइओट्रोपिक साइटोकिन है जो कि आईईएल होमियोस्टेसिस23,24के लिए आवश्यक है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या आईएल-2आर जेड रिसेप्टर के माध्यम से आईएल-15 सिग्नलिंग स्थिर राज्य में आईईएल गतिशीलता की गतिज में योगदान देता है, TcrdEGFP रिपोर्टर चूहों को विरोधी आईएल-2आर जेड 1) या आइसोटाइप आईजीजी 2बी नियंत्रण के प्रशासन के बाद 2 एच छवि दी गई थी। रंगीन पटरियों से यह संकेत मिलता है कि 30 मिह (चित्र3क) के दौरान व्यक्ति के प्रवासी पथ । यद्यपि एलआईएल में एलआईएल की आवृत्ति टीएम-जेड1 (चित्र 3क,) के साथ उपचारित चूहों में बढ़ी थी , फिर भी इनमें से 30% से अधिक आईईएलने एक सुस्त व्यवहार का प्रदर्शन किया (चित्र 3क,ब्) का प्रदर्शन किया गया था। निष्क्रिय जेड आईएलको ट्रैक स्ट्रेटनेस और ट्रैक विस्थापन लंबाई पर ऊपरी सीमा एंलगाकर निर्धारित किया गया था। इस सुस्ती फीनोटाइप को नियंत्रण के सापेक्ष आईएल-2आर के बाद तात्कालिक गति और परिरोध अनुपात दोनों में महत्वपूर्ण कमी द्वारा पुष्टि की गई थी (चित्र 3D,) इसके अतिरिक्त, निष्क्रिय - आईईएल लंबे समय तक निवास करते हैं और गतिशील की तुलना में एलआईएस के भीतर अधिक बार स्थानीयकृत होते हैं (चित्र 3 एफ)।

Figure 1
चित्र 1: मेसेंटरी में एक छेद बनाने के लिए forceps का उपयोग करना. टांके के लिए एक छेद बनाने के लिए झिल्ली के दोनों ओर संदंश रखें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि 3 डी छवि के $ IELs के जेजुनम में. एक एकल समय बिंदु स्थिर राज्य में एक TcrdEGFP रिपोर्टर माउस के जेजुनल mucosa के लिया के एक समय चूक वीडियो से चुना गया था. श् ईएल हरे रंग में, नाभिक में सफेद और लुमेन में लाल रंग में दिखाए जाते हैं। स्केल बार ] 30 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: आईएल-2आर का अवरोध पार्श्व अंतरकोशिकीय स्थान में आईईएल की सुस्ती पैदा करता है। यह आंकड़ा "एपिथेलियल आईएल-15 से अनुकूलित किया गया है, आंत्र म्यूकोसा के भीतर इंट्राएपिथील लिम्फोसाइट गतिशीलता का एक महत्वपूर्ण नियामक है." हू, एम.डी. एट अल 2018, जे इम्यूनोल, 201 (2), p. 747-756. 15 कॉपीराइट 2018 प्रतिरक्षा विज्ञानियों के अमेरिकन एसोसिएशन द्वारा, इंक () समय चूक छवियों को दिखाने के पलायन GFP [ IELs के भीतर जेजुनल ग्रामीण उपकला के भीतर 2 एच उपचार के बाद 0.45 IgG2b या TM-$1 के साथ मिलीग्राम. 30 मिनट के दौरान व्यक्तिगत - आईएल (हरी) की गतिशीलता रंगीन पटरियों के साथ दिखाई जाती है। न्यूक्ली सफेद में दिखाए जाते हैं, और लुमेन लाल रंग में दिखाया गया है। स्केल बार्स [ 20 ]m. (B) एलआईएस (द ] 3 चूहे प्रति उपचार, n ] 6-7 वीडियो) में $ IELs की आवृत्ति। () इग्ग2बी- या टीएम-जेड 1-उपचारित चूहों में बेकार पड़े आईएलकाओं का प्रतिशत। (छ) तात्कालिक चाल (द $ 13,299 और 9,600 समय अंक)। () ट्रैक परिरोध अनुपात (द 350 और 278 पटरियों) दिखाए जाते हैं। () लुमेन से निष्क्रिय और गतिशील की दूरी। माध्य + SEM (+) दिखाया गया है। *p और 0.05, *p और lt; 0.01, #p और lt; 0.0001. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आईईएल लुमेन
सतह विस्तार ($m) १.२ 1.5
पृष्ठभूमि घटाव ($m) 1.67
बीज अंक व्यास ($m) 7.5 एन/ए
फ़िल्टर: voxels की संख्या 250 6,500
ट्रैकिंग: अधिकतम दूरी ($m) 10 10
ट्रैकिंग: अधिकतम अंतर

तालिका 1: जनरेट करने के लिए प्रतिनिधि सेटिंग्स Imaris में आईईएल और luminal "सतह". 488 एनएम चैनल (आईईएल) और 640 एनएम चैनल (ल्यूमेन) के सतहों का उत्पादन और ट्रैकिंग करते समय इन सेटिंग्स को प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जा सकता है। प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर, इन सेटिंग्स को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है.

फिल्म 1: GFP के इंट्राविटल इमेजिंग [ ] आईईएल प्रवासी व्यवहार में माउस जेजुनम। इगजी2बी के 0.45 मिलीग्राम के साथ इलाज किए गए TcrdEGFP माउस से जेजुनम में जेड आईईएल गतिशीलता की समय-चूक इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी। हरे रंग में, नीले रंग में नाभिक, और लाल रंग में लुमेन में ईईएल दिखाए जाते हैं। स्केल बार, 20 डिग्री मी. फ्रेम्स लगभग 30 मिनट के लिए हर 30 s एकत्र किए गए थे मूवी हू से अनुकूलित है, एम डी एट अल 201815. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

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अंत:प्रज्ञा माइक्रोस्कोपी तकनीकों के विकास ने उपकोशिकीय संरचनाओं के पुनर्गठन का निरीक्षण करने का एक अभूतपूर्व अवसर प्रदान किया है8,9,22, सेल-सेल बातचीत12, 25 और सेल प्रवासी व्यवहार13,14,15 ,16,26 अन्यथा दुर्गम ऊतकों में. विवो18,27, 27 में आईईएल के विनियमन और कार्य का अध्ययन करने के लिए उपकरणों की एक सामान्य कमी रही है , और इसके परिणामस्वरूप, इंट्राविटल इमेजिंग के उपयोग ने आणविक विनियमन के संबंध में जांच के नए रास्ते खोल दिए हैं और आईईएल की जनसंख्या13,14,15,16,20के कार्यात्मक लक्षण हैं . पहले माना जाता था कि यह आंतों के श्लेष्म28के भीतर स्थिर है . तथापि, आगे के विश्लेषण से पता चला है कि ये कोशिकाएं अत्यधिक गतिशील हैं, लेकिन उपकला डिब्बे13के तंग दायरे के कारण माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में लिम्फोसाइटों की तुलना में अधिक धीरे-धीरे प्रवास करती हैं। इसके अलावा, विवो इमेजिंग में के उपयोग ने आईईएल और एपिथेल कोशिकाओं के बीच क्रॉसटॉक सहित आईईएल निगरानी व्यवहार की spatiotemporal गतिशीलता में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान की है, जो कि ड्राइव करता है - आईईएल गतिशीलता और समारोह13, 14 , 15 , 16. इस प्रवासी व्यवहार के विश्लेषण ने आईईएल सेलुलर प्रतिक्रियाओं के लिए नए मीट्रिक्स को परिभाषित किया है जो पूर्व विवो या इन विट्रो प्रयोगों का उपयोग करके सही मात्रा में नहीं होते।

पूरी प्रक्रिया के दौरान, यह लगातार माउस के sedation स्तर की निगरानी के लिए आवश्यक है. गैस संज्ञाहरण के सतत प्रशासन (isoflurane) ketamine के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता / लैपरोटोमी प्रदर्शन करते समय, जीव विज्ञान का सही मूल्यांकन प्रदान करने के लिए न्यूरोवास्कुलर आपूर्ति को बरकरार रखना महत्वपूर्ण है। आंत्ररक्त रक्त वाहिकाओं को बंद करने से ऊतक के हाइपोक्सिया और क्रमिक परिगलन हो सकते हैं। इसके विपरीत, रक्त वाहिकाओं को तोड़ने से उजागर श्लेष्म में रक्तस्राव हो सकता है, जो इमेजिंग के दौरान कुछ चैनलों की फ्लोरोसेंट तीव्रता को कम कर सकता है। यदि आईईएल एक गोल आकारिकी विकसित और छवि अधिग्रहण के दौरान आगे बढ़ बंद करो, यह माउस के शरीर के तापमान में एक मामूली कमी के कारण हो सकता है. माइक्रोस्कोप चरण के करीब तापमान सेंसर रखने से यह सुनिश्चित होता है कि उजागर श्लेष्म के स्थल पर तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है। ऊष्मायन कक्ष के ताप स्थिरता के आधार पर तापमान को 38-39 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाना आवश्यक हो सकता है।

एक बार माउस माइक्रोस्कोप चरण पर तैनात किया गया है, यह villi के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है कि peristalsis या आसन्न रक्त वाहिकाओं के संकुचन के कारण अत्यधिक आंदोलन की कमी है. यदि ऐसा होता है, तो माउस को डिश के भीतर की स्थिति दें या कवरस्लिप के खिलाफ विली को कसकर पैक करने के प्रयास में माउस के पार्श्वों को बाह्य रूप से हेरफेर करें। वैकल्पिक रूप से, इमेजिंग क्षेत्र मंच पर माउस रखने के बाद कुछ मिनट और अधिक स्थिर हो सकता है। यदि अधिग्रहण के दौरान क्रमिक XY बहाव है, यह 4D प्रतिपादन सॉफ्टवेयर में बहाव सुधार का उपयोग कर सही किया जा सकता है 4-5 नाभिक है कि समय पाठ्यक्रम भर में छवि के विभिन्न स्थानों में मौजूद हैं और प्रत्येक के लिए एक स्थान पर नज़र रखने का चयन करके नाभिक. स्पॉट उत्पन्न किया गया है एक बार, अनुवाद बहाव को सही करने के लिए संपादित करें ट्रैक मेनू के तहत सही बहाव का चयन करें. यह महत्वपूर्ण है कि बहाव सुधार किसी भी अन्य विश्लेषण से पहले किया जाना है, क्योंकि यह छवि में अन्य वस्तुओं को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया निर्देशांक बदल जाएगा.

हालांकि दो-फोटोन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की एक विस्तृत गहराई के लिए अनुमति देता है कि ऊतकों में गहरी मर्मज्ञ के लिए उपयोगी है29,कताई डिस्क लेजर confocal माइक्रोस्कोपी intravital इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए अपने स्वयं के अद्वितीय लाभ है. दो-फोटोलेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी फोटोप्लियर ट्यूब (पीएमटी) पर निर्भर करती है जो 40-50% की क्वांटम दक्षता के साथ एक समय में केवल एक पिक्सेल का पता लगा सकती है। इसके विपरीत, कताई डिस्क confocal लेजर माइक्रोस्कोपी एक इलेक्ट्रॉन गुणन (EM)CCD कैमरा का उपयोग करता है सीधे एक लाख पिक्सल एक साथ पता लगाने के लिए, इस प्रकार 95% के लिए क्वांटम दक्षता में वृद्धि. एक परिणाम के रूप में, photobleaching और photodamage के लिए क्षमता काफी कम है, जबकि वृद्धि हुई अधिग्रहण की गति अस्थायी संकल्प अधिकतम जब अधिक सतही ऊतकों में सेल प्रवास इमेजिंग. इमेजिंग मोडलिटी के बावजूद, यह शल्य प्रक्रिया एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए आंतों के श्लेष्म को उजागर करने के लिए आदर्श है।

फ्लोरोसेंट पत्रकारों को व्यक्त माउस उपभेदों की बढ़ती उपलब्धता के साथ, फ्लोरोसेंट लेबल जांच या सूक्ष्मजीवों के फ्लोरोसेंट उपभेदों कि तरंगदैर्ध्य की एक भीड़ में उत्पन्न किया गया है, संयोजन vivo आंतों में मूल्यांकन करने के लिए वास्तविक समय में प्रतिक्रियाएं अंतहीन हैं. न केवल intravital इमेजिंग सेल सेल और मेजबान microbe बातचीत में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह भी दोनों उपकला और होम्योपैथिक या रोग की स्थिति के तहत प्रतिरक्षा कोशिकाओं में गतिशील आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं को उजागर कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम NIH R21 AI143892, न्यू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन अनुदान, Busch जैव चिकित्सा अनुदान (KLE) द्वारा समर्थित है. हम पांडुलिपि संपादन और प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया डेटा प्रदान करने में उसकी सहायता के लिए Madeleine हू धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm dish, No. 1.5 Coverslip MatTek P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide Invitrogen A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G Thermo Fisher Scientific 14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Tuberculin Syringe Thermo Fisher Scientific 14-829-9
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 08-940
Electrocautery Thermo Fisher Scientific 50822501
Enclosed incubation chamber OKOLAB Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length Roboz RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich 55037C
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules Bitplane Software
Inverted DMi8 Leica Microscope
IQ3 (v. 3.6.3) Andor Software
Ketamine Putney Anesthesia
Kimwipes VWR 21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp Roboz RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided Fisher Scientific NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip Roboz RS-5228
Puralube Vet Ointment Dechra Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser Andor Confocal system
Xylazine Akorn Anesthesia

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References

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मौरीन स्मॉल इन्टेने्टर में इंट्राएपिथेल लिम्फोसाइट्स का इंट्रावाइटल इमेजिंग
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Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).More

Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).

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