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Immunology and Infection

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

doi: 10.3791/59853 Published: June 24, 2019

Summary

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Abstract

Os linfócitos intraepithelial que expressam o receptor da pilha de ltγδ T (ltγδ IEL) jogam um papel chave na fiscalização imune do epitélio intestinal. Devido, em parte, à falta de um ligantes definitivo para o receptor de células ltγδ T, nossa compreensão da regulação da ativação ltγδ IEL e sua função in vivo permanece limitada. Isso requer o desenvolvimento de estratégias alternativas para interrogar as vias de sinalização envolvidas na regulação da função ltγδ IEL e a responsividade dessas células ao microambiente local. Embora os IELS do ltγδ sejam compreendidos extensamente para limitar o translocation do micróbio patogénico, o uso da imagem latente intravital tem sido crítico a compreender a dinâmica armazenamento de interações de IEL/epithelial no estado estacionário e em resposta aos micróbios patogénicos invasores. Nisto, nós apresentamos um protocolo para visualizar o comportamento migratório de IEL na mucosa intestinal pequena de um rato do repórter da pilha de GFP ltγδ T usando a microscopia de laser confocal invertida do disco de giro. Embora a profundidade máxima da imagem latente desta aproximação seja limitada relativo ao uso da microscopia do laser-exploração do dois-fóton, a microscopia confocal do laser do disco de giro fornece a vantagem da aquisição de imagem de alta velocidade com photobranqueamento reduzido e photodamage. Usando o software da análise de imagem 4D, o comportamento da fiscalização da pilha de T e suas interações com pilhas vizinhas podem ser analisados depois da manipulação experimental para fornecer a introspecção adicional na ativação e na função de IEL dentro da mucosa intestinal.

Introduction

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Os linfócitos intraepithelial (IEL) são situados dentro do epitélio intestinal, e são encontrados ao longo da membrana do porão e entre pilhas epithelial adjacentes no espaço intercelular lateral1. Há aproximadamente um IEL para cada 5-10 pilhas epithelial; Estes IELs servem como sentinelas para fornecer a fiscalização imune da grande extensão da barreira epithelial intestinal2. Os IELs que expressam o receptor da célula ltγδ T (TCR) compreendem até 60% da população total de IEL no intestino delgado murino. Estudos em camundongos T-Cell-deficientes ltγδ demonstram um papel de grande proteção dessas células em resposta a lesão intestinal, inflamação e infecção3,4,5. Apesar da geração do mouse nocaute Tcrd 6, nossa compreensão da biologia ltγδ IEL permanece limitada devido, em parte, ao fato de que os ligantes reconhecidos pelo ltγδ TCR ainda não foram identificados7. Como resultado, a falta de ferramentas para estudar esta população celular dificultou a investigação do papel da ativação e função do ltγδ TCR condições fisiológicas e patológicas. Para preencher essa lacuna, desenvolvemos técnicas de imagem ao vivo para visualizar o comportamento migratório de ltγδ IEL e interações com enterócitos vizinhos como um meio para fornecer informações adicionais sobre a função ltγδ IEL e responsividade aos estímulos externos in vivo.

Durante a última década, a imagem latente Intravital expandiu significativamente nossa compreensão dos eventos moleculars envolvidos em facetas múltiplas da biologia intestinal, incluindo o derramamento epithelial8da pilha, regulamento da função epithelial 9 da barreira ,10, amostragem de células mielóides de conteúdo Luminal11,12e interações hospedeiro-micróide11,13,14,15,16 . No contexto da biologia de IEL, o uso da microscopia intravital tem derramado luz sobre a dinâmica espaciotemporal da motilidade de IEL e os fatores que mediam o seu comportamento de vigilância13,14,15, a 16. O desenvolvimento de camundongos de repórter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), que rotula ltγδ IELs pela expressão nuclear de GFP17, revelou que Ltγδ IELS são altamente motile dentro do epitélio e exibem um comportamento de vigilância único que é responsivo a microbiana infecção17,13,14. Recentemente, um outro rato do repórter da pilha de ltγδ T foi desenvolvido (Tcrd-GDL) que expressa GFP no citoplasma para permitir o visualização da pilha inteira18. Metodologia semelhante tem sido utilizada para investigar a exigência de receptores específicos de quimiocina, como o receptor acoplado à proteína G (GPCR)-18 e-55, sobre a dinâmica da motilidade de IEL19,20. Na ausência de um repórter Cell-specific, os anticorpos conjugado fluorescentes de encontro a CD8α foram usados para visualizar e seguir a motilidade de IEL in vivo19,20. Embora a microscopia de varredura do laser do dois-fóton seja usada geralmente para a imagem latente intravital, o uso da microscopia confocal do laser do disco de giro fornece vantagens originais para capturar imagens multicanal de alta velocidade e de alta resolução com ruído de fundo mínimo. Esta tecnologia é ideal para elucidar a dinâmica espaciotemporal das interações imunológicas/epiteliais dentro do complexo microambiente da mucosa intestinal. Além disso, através do uso de vários modelos transgênicos e/ou Knockout mouse, esses estudos podem fornecer informações sobre a regulação molecular da função intestinal imune e/ou células epiteliais.

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Protocol

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Todos os estudos foram conduzidos em uma associação de avaliação e acreditação de laboratório de cuidados com animais (AALAC)-instalações credenciadas de acordo com protocolos aprovados pela Rutgers New Jersey Medical School recursos de medicina comparativa.

1. preparação do mouse

Nota: O procedimento a seguir, incluindo preparação e cirurgia de animais, levará de 30 a 40 min. antes da cirurgia, ligue o microscópio e aqueça a incubadora fechada no microscópio para 37 ° c.

  1. Realize experimentos em camundongos TcrdEGFP de 8 – 10 semanas de idade em um fundo C57BL/6, que foram obtidos de Bernard Malissen (INSERM, Paris, França). De acordo com o procedimento aprovado pelo IACUC, anestesiam o camundongo pela injeção i.p. de cetamina (120 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) com base no peso do animal. Avaliar o nível de anestesia por taxa de respiração (55 – 65 respirs por minuto)21, pinça Toe e reflexo palpebral.
  2. Uma vez que a anestesia plana cirúrgica é alcançada, fixe os pés traseiros do rato usando a fita a uma almofada de aquecimento para manter a temperatura de corpo, que pode ser monitorada pelo termômetro rectal. Se houver sinais de que a anestesia está se desgastando (por exemplo, aumento da taxa de respiração, piscar e/ou músculo ocular espasmos resposta ao reflexo palpebral), re-administrar 50 μL de cetamina/xilazina em um momento até que o mouse é totalmente sedado.
  3. Prepare o corante nuclear diluindo 50 μL de Hoechst 33342 (10 mg/mL) com 315 μL de soro fisiológico de 0,9%; a concentração final é de 37,5 mg/kg com base no peso do rato (200 μL de volume aproximado). Uma vez que o rato é anestesiado, injete lentamente o Hoechst usando uma seringa da tuberculina através da cavidade venosa retro-orbital.
    Nota: Aguarde 1 – 2 min antes de prosseguir para a próxima etapa para permitir que o mouse aclimatar para a mudança no volume circulante após a injeção retro-orbital.
  4. Coloque uma pequena quantidade de lubrificante sobre os olhos para impedi-los de secar.

2. cirurgia do rato: laparotomia para expor a mucosa intestinal

  1. Faça uma incisão vertical de 2 cm através da pele e peritônio ao longo da linha média do abdômen inferior para externalizar a região do intestino a ser imaged.
  2. Usando fórceps angular, puxe com cuidado o cálio para fora da cavidade peritoneal e identifique a área do intestino delgado a ser imaged. Tenha cuidado para não rasgar os vasos sanguíneos mesentéricos durante este processo. Para minimizar potenciais danos ou sangramento, evite agarrar ou beliscar o intestino com o fórceps.
  3. Localize uma região adequada de intestino delgado (2 – 3 cm) para imagens que contêm conteúdo fecal mínimo. Retorne com cuidado o ceco e o intestino delgado restante na cavidade peritoneal, ao deixar o segmento do interesse externalized.
    Nota: Evite perfurar o ceco ou interromper a vasculatura mesentérica durante esta etapa.
  4. Coloque dois pares de fórceps em ambos os lados do mesenteria subjacente entre os vasos sanguíneos e esfregue suavemente as pontas da pinça juntas para criar um furo na membrana (Figura 1)22. Isto permitirá que a agulha passe através do mesentério ao fechar a cavidade peritoneal abaixo do intestino.
  5. Feche a incisão enquanto mantém o laço do intestino exteriorizado. Usando o fórceps angular e uma agulha curvada, do ponto do atarraxamento unida a uma sutura de 5 cm, penetre um lado do peritoneum, atravessa o furo feito na etapa precedente, e acima através do outro lado do forro peritonealny. Coloc uma sutura na parte superior, e outra perto da parte inferior da incisão.
    Nota: Evite danificar a vasculatura durante esta etapa.
  6. Repita este processo para fechar a pele o laço intestinal, colocando uma sutura no meio da incisão, entre as suturas anteriores no peritônio subjacente.
    Nota: É importante apenas externalizar a área a ser fotografada; Isto reduzirá o movimento estranho durante a imagem latente. Certifique-se de evitar amarrar as artérias mesentéricas.
  7. Use um eletrocautério para fazer uma linha de perfuração ao longo da beira antimesenteric. Imediatamente após a cauterização, aplique algumas gotas da água à superfície do intestino para impedir dano de tecido calor-induzido adicional. Blot com um Kimwipe para remover a água residual.
  8. Corte uma pequena fenda horizontal na borda distal do tecido cauterizado usando as tesouras de Vannas e prossiga para cortar ao longo do comprimento da linha cauterizada em direção à extremidade proximal do segmento de tecido externalizado (aproximadamente 1,5 cm de comprimento) para expor a mucosa Superfície.
    Nota: Se necessário, use fórceps para remover suavemente qualquer excesso de conteúdo fecal restante na superfície exposta da mucosa.
  9. Cubra o abdômen do rato com um Kimwipe úmido para impedir que o tecido se torne desidratado. Transportar o mouse para o microscópio em uma embarcação coberta.

3. aquisição de imagem por microscopia confocal de disco giratório

  1. Pipete 150 μL de 1 μM AlexaFluor 633 em HBSS para o fundo de vidro de um prato de 35 mm. Posicione o mouse de modo que a superfície mucosa aberta entre em contato diretamente com a lamínula.
  2. Incline a cabeça do microscópio para trás e coloc o rato no prato coverescorregado na fase da imagem latente em uma incubadora pre-warmed. Alternativamente, cubra o rato por uma manta de aquecimento para manter a temperatura do corpo.
  3. Inicie o software de imagem. A intensidade de excitação e o tempo de exposição de cada laser não devem exceder 10 – 15 mW ou 120 – 150 ms, respectivamente, para evitar o fotobranqueamento e minimizar o intervalo entre os pontos temporais. Ajuste a média do quadro para "2" e ative a função de ganho EM para reduzir o ruído de fundo. Selecione a calibração objetiva de 63x para assegurar a medida correta do tamanho do pixel.
    Nota: Os ajustes detalhados acima são significados fornecer uma referência inicial, mas variarão dependendo das configurações individuais do microscópio.
  4. Usando o laser de 405 nanômetro e o objetivo do ar 20x, visualize os núcleos para encontrar um campo dos Villi que faltam o movimento ou a tração perceptível pelo olho. Evite áreas de movimento vesícula devido à respiração, peristaltismo ou batimento cardíaco.
  5. Usando a varredura XY, registre a coordenada XY do campo de interesse e mude para o objetivo da imersão 63X do glicerol.
  6. Confirme que as vilosidades no campo selecionado são estáveis adquirindo uma imagem ao vivo no canal 405 nm por até 1 min.
  7. Ao adquirir uma imagem ao vivo no canal 405 nm, ajuste o foco para encontrar o plano ortogonal logo abaixo da ponta villous. Adquira pilhas Z a partir do logo abaixo do epitélio da ponta villous abaixo do vilosidades até que seja difícil resolver os núcleos, aproximadamente 15 – 20 μm, usando uma etapa de 1,5 μm.
    Nota: Quando a imagem latente com três canaletas (405, 488, 640 nanômetro) usando os tempos da exposição descritos acima, é possível adquirir todos os três canaletas sequencialmente em intervalos de aproximadamente 20 s.
  8. Abra o software em modo de análise, 3 – 5 min após o início da aquisição, para confirmar a estabilidade da imagem e a motilidade ltγδ IEL. Continue a adquirir imagens por 30 – 60 min para cada campo de Villi. Registre 2 – 3 campos para cada mouse. Durante a imagem, monitore o mouse a cada 5 min.
    Nota: Se a anestesia começa a se desgastar, use fórceps para esfregar suavemente o pescoço do mouse para administrar 50 μL de cetamina/xilazina de cada vez. Continuar a monitorizar os níveis de anestesia e re-administrar quando necessário.
  9. Não é aconselhável a imagem de um único mouse por mais de 4 h. Após a conclusão da aquisição da imagem, Sacrifique os camundongos por luxação cervical seguida de pneumotórax bilateral.

4.4D análise de imagens

  1. Importe diretamente arquivos de imagem para o software de renderização 4D.
  2. Crie superfícies individuais para IELS e o lúmen e, em seguida, acompanhe as superfícies ao longo do tempo usando os parâmetros descritos na tabela 1 como uma referência inicial. Para os IELs, ative dividir objetos tocantes usando o diâmetro do ponto de semente indicado.
  3. Use o algoritmo de rastreamento autoregressivo para determinar a motilidade do IEL. Embora o algoritmo de rastreamento seja relativamente preciso, é imperativo inspecionar visualmente as faixas para cada IEL individual. Se uma faixa estiver incorreta, corrija-a usando as funções Desconectar e conectar a guia Editar faixas .
  4. Para determinar a distância de cada IEL ao lúmen, selecione a superfície do lúmen e realize a função de transformação de distância no menu de ferramentas . Quando solicitado, selecione fora do Surface. Uma vez calculado, a transformação de distância será exibida como o 4º canal.
  5. Filtre a intensidade mínima do 4º canal para selecionar Ltγδ IELS que estejam dentro do espaço intercelular lateral (LIS). Esse valor deve ser próximo a 15 μm, com base na altura de uma célula epitelial colunar. A percentagem de ltγδ IELs totais dentro deste intervalo é relatada como a frequência de ltγδ IELs no LIS.
  6. Para uma análise mais aprofundada, exporte dados estatísticos, incluindo: velocidade da faixa IEL, deslocamento da faixa, lineabilidade da faixa e comprimento da faixa. Alternativamente, analise os dados usando o módulo Vantage. Dependendo do experimento, obtenha métricas adicionais dos dados adquiridos, incluindo o tempo de permanência dentro das interações LIS ou IEL/epitelial.

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Representative Results

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Usando a imagem latente intravital de ratos do repórter de tcrdegfp, nós mostramos previamente que ltγδ IELS exibem um comportamento dinâmico da fiscalização, em que patrulham o epitélio migrando ao longo da membrana do porão e no espaço intercelular lateral (LIS) em constante Estado (Figura 2, filme 1).

Essa abordagem também pode ser usada para avaliar como a inibição de vias de sinalização celular específica e/ou receptores influencia o comportamento migratório de ltγδ IEL. Por exemplo, a interleucina (Il)-15 é uma citocinas pleiotrópicas que é essencial para a homeostase ltγδ IEL23,24. Para determinar se a sinalização IL-15 através do receptor IL-2Rβ contribui para a cinética da motilidade ltγδ IEL no estado estacionário, camundongos de repórter TcrdEGFP foram imaged 2 h após a administração do anticorpo anti-IL-2Rβ (TM-β1) ou isotipo IgG2b controle. As faixas coloridas indicam os caminhos migratórios das IELs individuais ltγδ ao longo de 30 min (Figura 3a). Embora a frequência de ltγδ IELs no LIS tenha aumentado em camundongos tratados com TM-β1 (Figura 3a,B), mais de 30% desses ltγδ IELS exibiram um comportamento em marcha lenta (Figura 3a,C). As IELs ociosas ltγδ foram definidas impondo limites superiores na lineabilidade da faixa e comprimento do deslocamento da faixa. Este phenotype em marcha lenta foi confirmado por uma redução significativa na velocidade instantânea e na relação do confinamento de ltγδ IELs que seguem o bloqueio de IL-2Rβ relativo ao controle (Figura 3D,E). Além disso, os inactivos ltγδ IELs têm tempos de permanência mais longos e foram mais freqüentemente localizados dentro do LIS em comparação com o motile ltγδ IELs (Figura 3F).

Figure 1
Figura 1: usando fórceps para criar um furo no mesenteria. Coloque o fórceps em ambos os lados da membrana para criar um furo para as suturas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: imagem 3D representativa de ltγδ IELs no jejuno. Um único ponto do tempo foi selecionado de um vídeo do lapso de tempo de tomado da mucosa jejunal de um rato do repórter de TcrdEGFP no steady-state. ltγδ IELs são mostrados em verde, núcleos em branco e o lúmen em vermelho. Barra de escala = 30 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: a inibição do Il-2Rβ induz ltγδ IEL em marcha lenta no espaço intercelular lateral. Este número foi adaptado de "IL-15 epithelial é um regulador crítico de ltγδ Motility intraepithelial do linfócito dentro da mucosa intestinal." por Hu, M. D. et al. 2018, J immunol, 201 (2), p. 747-756. 15 Copyright 2018 pela Associação Americana de immunologists, Inc. (a) imagens do lapso temporal que mostram a migração de GFP ltγδ IELS dentro do epitélio villous jejunal que segue o tratamento de 2 h com 0,45 mgs de IgG2b ou de TM-β1. A motilidade do indivíduo ltγδ IELs (verde) ao longo de 30 min é mostrada com faixas coloridas. Os núcleos são mostrados em branco, e o lúmen é mostrado em vermelho. Barras de escala = 20 μm. (B) frequência de Ltγδ IELS no LIS (n = 3 camundongos por tratamento, n = 6-7 vídeos). (C) percentual de Ltγδ IELS que estavam ociosos em camundongos tratados com IGG2B ou TM-β1. (D) velocidade instantânea (n = 13.299 e 9.600 pontos temporais). (E) as relações de confinamento da faixa (n = 350 e 278 faixas) são mostradas. (F) distância de inactividade e motile Ltγδ IELS do lúmen. Média + sem é mostrada (+). * p < 0, 5, * * p < 0, 1, #p < 0, 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Iel Lúmen
Detalhe da superfície (μm) 1,2 1,5
Subtração de fundo (μm) 1,67 2
Diâmetro dos pontos de semente (μm) 7,5 N/A
Filtro: número de voxels 250 6.500
Seguimento: distância máxima (μm) 10 10
Seguimento: Gap máximo 2 2

Tabela 1: definições representativas para a geração de ltγδ IEL e luminal "superfícies" em Imaris. Essas configurações podem ser usadas como ponto de partida ao gerar e rastrear superfícies do canal 488 nm (IEL) e do canal 640 nm (lúmen). Dependendo das condições experimentais, essas configurações podem precisar ser modificadas.

Filme 1: imagem latente intravital de GFP comportamento migratório de ltγδ IEL no jejuno do rato. Microscopia intravital do tempo-lapso da motilidade de ltγδ IEL no jejuno de um rato de tcrdegfp tratou com 0,45 mgs de IgG2b. ltγδ IELs são mostrados em verde, núcleos em azul, e o lúmen em vermelho. Barra de escala, 20 μm. Os quadros foram coletados a cada 30 s por aproximadamente 30 min. o filme é adaptado de Hu, M . D. et al. 201815. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

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Discussion

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O desenvolvimento de técnicas de microscopia intravital proporcionou uma oportunidade inédita de observar a reorganização das estruturas subcelulares8,9,22, interações célula-celular12, 25 e comportamento migratóriocelular 13,14,15,16,26 em tecidos de outra forma inacessíveis. Tem havido uma falta geral de ferramentas para estudar a regulação e função de ltγδ IELS in vivo18,27, e como resultado, o uso de imagens intravital abriu novas vias de investigação sobre a regulação molecular e características funcionais das populações de IEL13,14,15,16,20. ltγδ IELs foram previamente presumidos ser estacionários dentro da mucosa intestinal28. Entretanto, uma análise mais adicional demonstrou que estas pilhas são altamente dinâmicas, mas migram mais lentamente do que linfócitos em órgãos lymphoid secundários devido aos limites apertados do compartimento epithelial13. Além disso, o uso da imagem latente in vivo forneceu a introspecção adicional na dinâmica armazenamento do comportamento da fiscalização de ltγδ IEL, incluindo o conversa cruzada entre IELS e pilhas epithelial que conduz a motilidade do ltγδ IEL e a função13, 14 anos de , 15 anos de , 16. a análise deste comportamento migratório definiu novas métricas para respostas celulares IEL que não teriam sido quantificáveis com precisão por meio de experimentos ex vivo ou in vitro.

Ao longo de todo o procedimento, é essencial para monitorar continuamente o nível de sedação do mouse. A administração contínua de anestesia gasosa (isoflurano) pode ser usada como uma alternativa à cetamina/xilazina. Ao executar a laparotomia, é crítico manter a fonte neurovascular intacta para fornecer uma avaliação exata da biologia. Amarrar os vasos sanguíneos mesentéricos pode levar a hipóxia e necrose gradual do tecido. Em contraste, cortando os vasos sanguíneos resultará em sangramento na mucosa exposta, que pode reduzir a intensidade de fluorescência de alguns canais durante a imagem. Se o IELs desenvolver uma morfologia arredondada e parar de se mover durante a aquisição de imagem, isso pode ser devido a uma ligeira diminuição na temperatura do corpo do mouse. Coloc o sensor de temperatura perto da fase do microscópio assegura-se de que a temperatura no local da mucosa exposta esteja mantida em 37 ° c. Elevar a temperatura para 38 – 39 ° c pode ser necessário, dependendo da estabilidade da temperatura da câmara de incubação.

Uma vez que o rato foi posicionado no estágio do microscópio, pode ser difícil identificar os campos dos Villi que faltam o movimento excessivo devido ao peristaltismo ou à contração de vasos sanguíneos adjacentes. Se isso ocorrer, reposicione o mouse dentro do prato ou manipule os flancos do mouse externamente em um esforço para embalar firmemente as vilosidades contra a lamínula. Alternativamente, o campo da imagem latente pode tornar-se mais estável alguns minutos após ter coloc o rato no estágio. Se houver deriva XY gradual durante a aquisição, isso pode ser corrigido usando a correção de deriva no software de renderização 4D, selecionando 4 – 5 núcleos que estão presentes em diferentes locais da imagem ao longo do curso de tempo e rastreamento de um ponto para cada Núcleo. Uma vez que os pontos foram gerados, selecione deriva correta o menu Editar faixa para corrigir deriva translacional. É importante que a correção de deriva seja feita antes de qualquer outra análise, pois isso alterará as coordenadas usadas para rastrear outros objetos na imagem.

Embora a microscopia de varredura do laser do dois-fóton permita uma profundidade larga da imagem latente que seja útil para penetrar profundamente nos tecidos29, a microscopia confocal do laser do disco de giro tem suas próprias vantagens originais para aplicações intravital da imagem latente. A microscopia de varredura a laser de dois fótons depende de tubos fotomultiplicadores (PMT) que podem detectar apenas um pixel de cada vez com uma eficiência quântica de 40 – 50%. Em contraste, a microscopia de laser confocal de disco giratório usa uma câmera CCD de multiplicação eletrônica (EM) para detectar diretamente até um milhão de pixels simultaneamente, aumentando assim a eficiência quântica para 95%. Como resultado, o potencial de fotobranqueamento e Fotodano é significativamente reduzido, enquanto a velocidade de aquisição aumentada maximiza a resolução temporal quando a migração de células de imagem em tecidos mais superficiais. Não obstante a modalidade da imagem latente, este procedimento cirúrgico é ideal para expor a mucosa intestinal para a imagem latente em um microscópio invertido.

Com a crescente disponibilidade de cepas de camundongo expressando repórteres fluorescentes, sondas com rótulo fluorescentamente ou cepas fluorescentes de microrganismos que foram geradas em uma infinidade de comprimentos de onda, as combinações para avaliar in vivo intestinal respostas em tempo real são infinitas. Não somente pode a imagem latente intravital fornecer a introspecção nova em interações da pilha-pilha e do anfitrião-micrótomo, mas pode igualmente realçar processos moleculares e celulares dinâmicos em pilhas epithelial e imunes circunstâncias homeostático ou patológicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado pela NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Agradecemos a Madeleine Hu por sua ajuda na edição do manuscrito e no fornecimento dos dados mostrados nos resultados representativos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm dish, No. 1.5 Coverslip MatTek P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide Invitrogen A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G Thermo Fisher Scientific 14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Tuberculin Syringe Thermo Fisher Scientific 14-829-9
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 08-940
Electrocautery Thermo Fisher Scientific 50822501
Enclosed incubation chamber OKOLAB Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length Roboz RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich 55037C
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules Bitplane Software
Inverted DMi8 Leica Microscope
IQ3 (v. 3.6.3) Andor Software
Ketamine Putney Anesthesia
Kimwipes VWR 21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp Roboz RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided Fisher Scientific NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip Roboz RS-5228
Puralube Vet Ointment Dechra Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser Andor Confocal system
Xylazine Akorn Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11, (7), 445-456 (2011).
  2. Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3, (6), 321-334 (2017).
  3. Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99, (22), 14338-14343 (2002).
  4. Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
  5. Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131, (3), 818-829 (2006).
  6. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, (2), 274-282 (1993).
  7. Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20, (2), 121-128 (2019).
  8. Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140, (4), e1201-e1202 (2011).
  9. Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189, (1), 111-126 (2010).
  10. Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107, (18), 8237-8241 (2010).
  11. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203, (13), 2841-2852 (2006).
  12. McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483, (7389), 345-349 (2012).
  13. Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109, (18), 7097-7102 (2012).
  14. Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148, (7), 1417-1426 (2015).
  15. Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201, (2), 747-756 (2018).
  16. Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171, (4), 783-794 (2017).
  17. Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7, (9), 995-1003 (2006).
  18. Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215, (12), 3006-3018 (2018).
  19. Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211, (12), 2351-2359 (2014).
  20. Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2, (18), (2017).
  21. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2, (2), (2011).
  22. Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129, (3), 902-912 (2005).
  23. Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9, (5), 669-676 (1998).
  24. Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183, (2), 1044-1054 (2009).
  25. Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8, (4), 400-411 (2017).
  26. Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352, (6293), 1581-1586 (2016).
  27. Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195, (9), 4282-4291 (2015).
  28. Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185, (9), 5160-5168 (2010).
  29. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine
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Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).More

Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).

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