Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intravital Imaging av intraepitelial lymfocyter i murina tunn tarmen

doi: 10.3791/59853 Published: June 24, 2019

Summary

Vi beskriver en metod för att visualisera GFP-märkta γδ IELs med intravital avbildning av murina tunn tarmen genom inverterad spinning disk konfokalmikroskopi. Denna teknik gör det möjligt att spåra levande celler i slem hinnan i upp till 4 h och kan användas för att undersöka en mängd olika intestinal immun-epitelial interaktioner.

Abstract

Intraepitelial lymfocyter som uttrycker γδ T cell receptor (γδ IEL) spelar en nyckel roll i immun övervakningen av tarm epitelet. Beror delvis på avsaknaden av en definitiv ligand för γδ T cell receptorn, vår förståelse av regleringen av γδ IEL aktivering och deras funktion in vivo förblir begränsad. Detta nödvändiggjorde utvecklingen av alternativa strategier för att förhöra signal vägar inblandade i regleringen γδ IEL funktion och lyhördhet för dessa celler till den lokala mikromiljön. Även om γδ IELs är allmänt förstått att begränsa patogenen translocation, användning av intravital avbildning har varit avgörande för att förstå spatiotemporal dynamiken i IEL/epitelial interaktioner vid Steady-State och som svar på invasiva patogener. Häri presenterar vi ett protokoll för att visualisera IEL migrations beteende i den lilla tarm slem hinnan i en GFP γδ T cell reporter mus med inverterad spinning disk konfokalmikroskopi lasermikroskopi. Även om den maximala Imaging djupet av denna metod är begränsad i förhållande till användningen av två-Photon laser-scanning mikroskopi, spinning disk konfokalmikroskopi lasermikroskopi ger fördelen av hög hastighet bild förvärv med minskad fotoblekning och photodamage. Använda 4D bild analys program vara, T cell övervakning beteende och deras interaktioner med angränsande celler kan analyseras efter experimentell manipulation för att ge ytterligare insikt i IEL aktivering och funktion inom tarm slem hinnan.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Intraepitelial lymfocyter (IEL) ligger inom tarm epitel, och finns både längs källaren membranet och mellan angränsande epitelceller i sidled intercellulära rymden1. Det finns ungefär en IEL för varje 5-10 epitelceller; dessa IELs fungerar som vakt poster för att ge immun övervakning av den stora vidden av intestinal epitelial barriär2. IELs uttrycker γδ T cell receptor (TCR) omfattar upp till 60% av den totala IEL populationen i murina tunn tarmen. Studier på möss med γδ T-cells brist uppvisar en till stor del skyddande roll för dessa celler som svar på tarm skador, inflammation och infektion3,4,5. Trots generering av Tcrd knockout Mouse6, är vår förståelse av γδ IEL biologi begränsad beror delvis på det faktum att ligander som erkänts av γδ TCR ännu inte har identifierats7. Som ett resultat av bristen på verktyg för att studera denna cell population har gjort det svårt att undersöka vilken roll γδ TCR aktivering och funktion under fysiologiska och sjukdoms tillstånd. För att fylla denna lucka, har vi utvecklat Live Imaging tekniker för att visualisera γδ IEL flyttande beteende och interaktioner med angränsande enterocyter som ett sätt att ge ytterligare insikt i γδ IEL funktion och lyhördhet för yttre stimuli in vivo.

Under det senaste decenniet, intravital Imaging har avsevärt utökat vår förståelse av molekyl ära händelser inblandade i flera aspekter av intestinal biologi, inklusive epitelial cell shedding8, reglering av epitelial barriär funktion9 ,10, myeloisk cell provtagning av Luminal innehåll11,12och Host-Microbe interaktioner11,13,14,15,16 . I samband med IEL biologi, har användningen av intravital mikroskopi belysa spatiotemporal dynamiken i IEL motilitet och de faktorer som medierar deras övervakning beteende13,14,15, och 16. Utvecklingen av TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) reporter möss, som etiketter γδ IELs av nukleära GFP uttryck17, visade att γδ iels är mycket rörliga inom epitelet och uppvisar en unik övervakning beteende som är lyhörd för mikrobiell infektion17,13,14. Nyligen, en annan γδ T cell reporter mus utvecklades (Tcrd-GDL) som uttrycker GFP i cytoplasman att möjliggöra visualisering av hela cellen18. Liknande metod har använts för att undersöka kravet på specifika chemokine receptorer, såsom G proteinkopplad receptor (GPCR)-18 och-55, på dynamiken i IEL motilitet19,20. I avsaknad av en cellspecifik reporter användes fluorescerande konjugerade anti kroppar mot CD8α för att visualisera och spåra IEL motilitet in vivo19,20. Fastän två-Photon lasern avsökningen mikroskopi är vanligen använd för intravital tänkbar, den använda av snurrande bricka konfokalmikroskopi lasern mikroskopi skaffar unik forellerna till ta till fånga hög fart och hög-beslutsamhet många--kanal profilen med minimal bakgrunden buller. Denna teknik är idealisk för att belysa den spatiotemporal dynamiken i immun/epitelial interaktioner inom den komplexa mikromiljön i tarm slem hinnan. Dessutom, genom användning av olika transgena och/eller knockout mus modeller, dessa studier kan ge insikt i den molekyl ära regleringen av intestinal immun-och/eller epitelceller funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla studier genomfördes i en sammanslutning av bedömning och ackreditering av laboratorie djur omsorg (AALAC)-ackrediterad anläggning enligt protokoll som godkänts av Rutgers New Jersey Medical School Komparativ medicin Resources.

1. förberedelse av musen

Anmärkning: Följande procedur, inklusive förberedelse och operation av djur, kommer att ta 30 – 40 min. innan operationen, slå på Mikroskop och värma upp den bifogade inkubator på Mikroskop till 37 ° c.

  1. Utför experiment på 8 – 10 veckor gamla TcrdEGFP möss på en C57BL/6 bakgrund, som erhölls från Bernard Malissen (INSERM, Paris, Frankrike). Enligt IACUC-godkända förfarande, bedöva musen genom i.p. injektion av Ketamin (120 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) baserat på vikten av djuret. Utvärdera nivån av anestesi genom respirationshastighet (55 – 65 andetag per minut)21, Toe nypa och palpebrala reflex.
  2. När kirurgisk plan anestesi nås, säkra bakbenen på musen med tejp till en värme pad för att bibehålla kropps temperaturen, som kan övervakas av rektal termometer. Om det finns tecken på att anestesi är nötning (t. ex. ökad andning, blinkande och/eller ögon muskel ryckningar svar på palpebrala reflex), re-administrera 50 μL Ketamin/xylazin i taget tills musen är helt sedated.
  3. Bered det nukleära färg ämnet genom spädning av 50 μL Hoechst 33342 (10 mg/mL) med 315 μL av 0,9% saltlösning. koncentrationen är 37,5 mg/kg baserat på musens vikt (200 μL ungefärlig volym). När musen är sövda, långsamt injicera Hoechst med en tuberkulin spruta genom retroorbital venös sinus.
    Anmärkning: Vänta 1 – 2 min innan du fortsätter till nästa steg för att låta musen att vänja sig vid förändringen i cirkulerande volym efter retro-orbital injektion.
  4. Placera en liten mängd Smörj medel över ögonen för att förhindra att de torkar ut.

2. mus kirurgi: Laparotomy att exponera intestinal slem hinna

  1. Gör en 2 cm vertikalt snitt genom huden och bukhinnan längs mitt linjen i nedre delen av buken för att externalisera den region i tarmen som ska avbildas.
  2. Med hjälp av vinklade pincett, dra försiktigt av blind tarmen ur peritonealkaviteten och identifiera området av tunn tarmen som ska avbildas. Var noga med att inte riva mesenteriska blod kärl under denna process. För att minimera potentiell skada eller blödning, undvika gripa tag eller nypa tarmen med pincett.
  3. Lokalisera en lämplig region av tunn tarmen (2-3 cm) för avbildning som innehåller minimal fekal innehåll. Försiktigt returnera blind tarmen och kvarvarande tunntarm i peritonealhålan, samtidigt som segmentet av intresse externalized.
    Anmärkning: Undvik att punktera blind tarmen eller störa den mesenteriska kärl under detta steg.
  4. Placera två par pincett på vardera sidan om den underliggande mesenteri mellan blod kärlen, och försiktigt gnugga spetsarna på pincett tillsammans för att skapa ett hål i membranet (figur 1)22. Detta gör det möjligt för nålen att passera genom krös när du stänger peritonealhålan under tarmen.
  5. Stäng snittet och samtidigt hålla slingan av tarmen externalized. Använda vinklade pincett och en böjd, Kona punkt nål bifogas en 5 cm sutur, penetrera ena sidan av bukhinnan, gå igenom hålet som gjorts i föregående steg, och upp genom den andra sidan av peritonealdialys foder. Placera en sutur i toppen, och en annan nära botten av snittet.
    Anmärkning: Undvik att skada kärl under detta steg.
  6. Upprepa denna process för att stänga huden under tarm slingan, genom att placera en sutur i mitten av snittet, mellan de tidigare suturer i det underliggande peritoneum.
    Anmärkning: Det är viktigt att bara externalisera det område som ska avbildas; Detta kommer att minska ovidkommande rörelse under bild tagning. Var noga med att undvika att binda av mesenteriska artärer.
  7. Använd en elektrocautery att göra en linje av perforering längs anti-mesenteric gränsen. Omedelbart efter cauterization, tillämpa några droppar vatten till ytan av tarmen för att förhindra ytterligare värmeinducerade vävnads skada. Blot med en Kimwipe för att avlägsna kvarvarande vatten.
  8. Skär en liten horisontell slits vid distala kanten av den flamberats vävnaden med hjälp Vannas sax och fortsätt att skära längs längden på den flamberats linjen mot den proximala änden av externalized vävnad segmentet (cirka 1,5 cm i längd) för att exponera slem hinnor Ytan.
    Anmärkning: Om det behövs, Använd pincett för att försiktigt ta bort överflödigt fekal innehåll kvar på den exponerade slem hinnor ytan.
  9. Täck musens mage med en fuktig Kimwipe för att förhindra att vävnaden blir uttorkad. Transportera musen till Mikroskop i ett täckt fartyg.

3. bild förvärv genom spinning disk Konfokal Microscopy

  1. Pipettera 150 μL av 1 μM AlexaFluor 633 i HBSS på den glastäckade botten av en 35 mm fat. Placera musen så att den öppnade slem hinnor ytan direkt kontakter täckglasen.
  2. Luta huvudet på mikroskopet tillbaka och placera musen på den coverhalkade skålen på Imaging scenen i en pre-värmda inkubator. Alternativt, täck musen med en värmefilt för att bibehålla kropps temperaturen.
  3. Starta avbildnings program. Exciteringsintensiteten och exponerings tiden för varje laser bör inte överstiga 10 – 15 mW respektive 120 – 150 ms för att undvika fotoblekning och för att minimera intervallet mellan tidpunkter. Justera bild Rute medelvärdet till "2" och slå på EM-förstärknings funktionen för att minska bakgrunds ljudet. Välj 63x objektiv kalibrering för att säkerställa korrekt mätning av pixel storlek.
    Anmärkning: De inställningar som beskrivs ovan är avsedda att ge en inledande referens, men kommer att variera beroende på enskilda Mikroskop konfigurationer.
  4. Med hjälp av 405 nm Laser och 20x luft mål, visualisera Atom kärnor att lokalisera ett fält av Villi som saknar märkbar rörelse eller drift med ögat. Undvik områden med artifaktuella rörelser på grund av andning, peristaltiken eller hjärt slagen.
  5. Med hjälp av XY-skanningen, registrera XY-koordinaten för intresse fältet och växla till målet glycerol Immersion 63X.
  6. Kontrol lera att Villi i det valda fältet är stabilt genom att skaffa en livebild på 405 nm-kanalen i upp till 1 min.
  7. Samtidigt förvärva en levande bild på 405 nm kanal, justera fokus för att hitta den ortogonala plan precis under villösa spetsen. Förvärva Z-staplar från strax under villösa spetsen epitel ner moderkaks tills det är svårt att lösa kärnor, ca 15-20 μm, med hjälp av en 1,5 μm steg.
    Anmärkning: Vid avbildning med tre kanaler (405, 488, 640 Nm) med de exponerings tider som beskrivs ovan, är det möjligt att förvärva alla tre kanalerna sekventiellt med ca 20 s intervaller.
  8. Öppna program varan i analys läge, 3 – 5 minuter efter att förvärvet har börjat, för att bekräfta bild stabiliteten och γδ IEL-motiliteten. Fortsätt att förvärva bilder för 30-60 min för varje fält av Villi. Spela in 2 – 3 fält för varje mus. Under bild tagning övervakar du musen var 5: de minut.
    Anmärkning: Om anestesi börjar avta, Använd pincett att försiktigt skruvning halsen på musen för att administrera 50 μL Ketamin/xylazin i taget. Fortsätt att övervaka anestesi nivåer och återadministrera vid behov.
  9. Det är inte tillrådligt att bilden en enda mus för längre än 4 h. När bilden förvärv är klar, offra möss genom cervikal dislokativ följt av bilaterala pneumothorax.

4.4D analys av bilder

  1. Direkt importera bildfiler till 4D rendering program vara.
  2. Skapa individuella ytor för iels och lumen och spåra sedan ytorna över tid med hjälp av parametrarna som beskrivs i tabell 1 som en första referens. För IELs, aktivera Split vidröra objekt med den angivna frö punkten diametern.
  3. Använd den autoregressiv spårningsalgoritmen för att bestämma IEL motilitet. Även om spårningsalgoritmen är relativt exakt, är det viktigt att visuellt inspektera spår för varje enskild IEL. Om ett spår är felaktigt korrigerar du det med hjälp av funktionerna koppla från och Anslut under fliken Redigera spår .
  4. För att bestämma avståndet från varje IEL till lumen, Välj lumen yta och utföra avstånd Transformation funktion under verktygs menyn. När du uppmanas till det väljer du utanför Surface. När den har beräknats visas avstånds omvandlingen som den fjärde kanalen.
  5. Filtrera intensiteten min av den 4: e kanalen för att välja γδ iels som är inom den laterala intercellulära rymden (LIS). Detta värde bör vara nära 15 μm, baserat på höjden av en kolumner epitelcell. Procent av totala γδ IELs inom detta intervall rapporteras som frekvensen av γδ IELs i LIS.
  6. För ytterligare analys, exportera statistiska data inklusive: IEL spår hastighet, spår förskjutning, spår rakhet och spår längd. Du kan också analysera data med Vantage-modulen. Beroende på experimentet, få ytterligare mått från förvärvade data, inklusive uppehålls tid inom LIS eller IEL/epithelial interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med hjälp av intravital avbildning av TcrdEGFP reporter möss, har vi tidigare visat att γδ IELs uppvisar en dynamisk övervakning beteende, där de patrullerar epitelet genom att migrera längs källaren membranet och i sidled intercellulära rymden (LIS) vid Steady (bild 2, film 1).

Detta tillvägagångs sätt kan också användas för att utvärdera hur hämning av specifika cellsignalering vägar och/eller receptorer påverkar γδ IEL flyttande beteende. Till exempel är interleukin (Il)-15 en pleiotropiska cytokin som är nödvändig för γδ IEL homeostas23,24. För att avgöra om IL-15-signalering genom IL-2Rβ-receptorn bidrar till kinetiken av γδ IEL-motiliteten vid Steady State, var TcrdEGFP-mössen i åldern 2 timmar efter administrering av anti-IL-2Rβ-antikropp (TM-β1) eller isotyp IgG2b-kontroll. De färgade spåren anger migrations vägarna för enskilda γδ-IELs under loppet av 30 min (figur 3a). Även om frekvensen av γδ IELs i LIS ökades hos möss som behandlades med TM-β1 (figur 3a,B) uppvisade mer än 30% av dessa γδ-iels ett tomgång (figur 3a,C). Inaktiva γδ IELs definierades genom att införa övre gränser för spår rakhet och spår förskjutning längd. Denna tomgång fenotyp bekräftades av en signifikant minskning av både moment Ana hastighet och förlossning förhållandet γδ IELs efter IL-2Rβ blockad i förhållande till kontroll (figur 3D,E). Dessutom har inaktiva γδ IELs längre uppehålls tider och var mer frekvent lokaliserade inom LIS jämfört med motila γδ IELs (figur 3F).

Figure 1
Figur 1: använda pincett för att skapa ett hål i mesenteri. Placera pincett på vardera sidan om membranet för att skapa ett hål för suturer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativ 3D-bild av γδ IELs i jejunum. En enda tidpunkt valdes från en time-lapse video av tagna av jejunal slem hinnan i en TcrdEGFP reporter mus vid Steady-State. γδ IELs visas i grönt, kärnor i vitt och lumen i rött. Skalbar = 30 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: hämning av Il-2Rβ inducerar γδ IEL-tomgång i det laterala intercellulära utrymmet. Denna siffra har anpassats från "epithelial IL-15 är en kritisk regulator av γδ intraepitelial Lymfocytmotilitet inom tarm slem hinnan." av hu, M. D. et al. 2018, J immunol, 201 (2), s. 747-756. 15 Copyright 2018 av American Association of Immunologer, Inc. (a) time-lapse bilder som visar migrera GFP γδ iels inom jejunal villösa epitel efter 2 h behandling med 0,45 mg IgG2b eller TM-β1. Motiliteten i enskilda γδ IELs (grön) under loppet av 30 min visas med färgade spår. Kärnor visas i vitt och lumen visas i rött. Skal streck = 20 μm. (B) frekvens av γδ iels i Lis (n = 3 möss per behandling, n = 6-7 videor). (C) procent av γδ iels som var inaktiva i IgG2b-eller TM-β1-behandlade möss. (D) momentan hastighet (n = 13 299 och 9 600 tids punkter). (E) spår i procent andelar (n = 350 och 278 spår) visas. (F) avstånd för tomgång och motila γδ iels från lumen. Medelvärde + SEM visas (+). * p < 0,05, * * p < 0,01, #p < 0,0001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

IEL lumen
Ytdetalj (μm) 1,2 1,5
Subtraktion i bakgrunden (μm) 1,67 2
Frö punkter diameter (μm) 7,5 EJ TILLÄMPLIGT
Filter: antal voxlar 250 6 500
Spårning: Max avstånd (μm) 10 10
Spårning: Max gap 2 2

Tabell 1: representativa inställningar för generering γδ IEL och Luminal "ytor" i Imaris. Dessa inställningar kan användas som utgångs punkt vid generering och spårning av ytor på 488 nm (IEL) och 640 Nm-kanal (lumen). Beroende på experimentella förhållanden kan dessa inställningar behöva ändras.

Film 1: Intravital avbildning av GFP γδ IEL flyttande beteende i mus jejunum. Tidsfördröjd intravital mikroskopi av γδ IEL motilitet i jejunum från en TcrdEGFP-mus behandlad med 0,45 mg IgG2b. γδ IELs visas i grönt, kärnor i blått och lumen i rött. Skalbar, 20 μm. Ramar samlades in var 30: or för ca 30 min. filmen är anpassad från HU, M. D . et al. 201815. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utvecklingen av intravital mikroskopi tekniker har gett en oöverträffad möjlighet att observera om organisation av subcellulära strukturer8,9,22, cell-cell interaktioner12, 25 och cell flytt beteende13,14,15,16,26 i annars otillgängliga vävnader. Det har funnits en generell brist på verktyg för att studera reglering och funktion av γδ iels in vivo18,27, och som ett resultat, användning av intravital Imaging har öppnat nya vägar för utredning om den molekyl ära regleringen och funktionella egenskaper hos IEL-populationerna13,14,15,16,20. γδ IELs har tidigare förmodats vara stillastående i tarm slem hinnan28. Emellertid, ytterligare analys visat att dessa celler är mycket dynamisk, men migrera långsammare än lymfocyter i sekundära lymfoida organ på grund av den snäva gränserna för epitelial kupé13. Dessutom har användningen av in vivo Imaging gett ytterligare insikt i spatiotemporal dynamiken i γδ IEL övervakning beteende, inklusive överhörning mellan IELs och epitelceller som driver γδ IEL motilitet och funktion13, 14 (på) , 15 , 16. analys av detta migrations beteende har definierat nya mät värden för IEL cellulära svar som inte skulle ha varit exakt kvantifierbara med hjälp av ex vivo eller in vitro-experiment.

Under hela proceduren, är det viktigt att kontinuerligt övervaka sedering nivå av musen. Kontinuerlig administrering av gas anestesi (isofluran) kan användas som ett alternativ till Ketamin/xylazin. När du utför laparotomy, är det viktigt att hålla den neurovaskulära utbudet intakt för att ge en noggrann utvärdering av biologi. Binda av mesenteriska blod kärl kan leda till hypoxi och gradvis nekros i vävnaden. Att bryta blod kärlen kommer däremot att resultera i blödning i den exponerade slem hinnan, vilket kan minska fluorescensintensiteten i vissa kanaler under bild tagning. Om IELs utvecklar en rundad morfologi och slutar röra sig under bild förvärvet, kan detta bero på en liten minskning av kropps temperaturen på musen. Vid placering av temperatur givare nära Mikroskop stadiet säkerställs att temperaturen vid den exponerade slem hinnan hålls vid 37 ° c. Det kan vara nödvändigt att höja temperaturen till 38 – 39 ° c beroende på inkubations kammarens temperatur stabilitet.

När musen har placerats på Mikroskop stadiet, kan det vara svårt att identifiera områden av Villi som saknar överdriven rörlighet på grund av peristaltiken eller sammandragning av intilliggande blod kärl. Om detta inträffar, flytta musen i skålen eller manipulera musens flanker externt i ett försök att tätt packa Villi mot täckglasen. Alternativt kan imaging fältet bli stabilare några minuter efter att placera musen på scenen. Om det finns gradvis XY drift under förvärvet, kan detta korrigeras med hjälp avdrift korrigering i 4D rendering program vara genom att välja 4-5 kärnor som finns på olika platser i bilden under hela tiden kurs och spåra en plats för varje Kärnan. När fläckarna har genererats väljer du korrekt drift under menyn Redigera spår för att korrigera translationell drift. Det är viktigt att avdrift korrigeringen görs innan någon annan analys, eftersom detta kommer att ändra de koordinater som används för att spåra andra objekt i bilden.

Fastän två-Photon lasern avsökningen Mikroskop tillåt för en vid djup av tänkbar den där er nyttig för genomträngande djupt in i vävnad29, spinning bricka lasern konfokal Mikroskop har dess äga unik forellerna för intravital tänkbar ansökan. Två-Photon laserscanning mikroskopi förlitar sig på foto multiplikator rör (PMT) som kan upptäcka endast en pixel i taget med en kvantmekaniska verknings grad på 40-50%. I kontrast, spinning disk konfokalmikroskopi lasermikroskopi använder en elektron multiplikation (EM) CCD-kamera för att direkt upptäcka upp till en miljon pixlar samtidigt, vilket ökar kvantmekaniska effektivitet till 95%. Som ett resultat, potentialen för foto blekning och foto skador reduceras avsevärt, medan den ökade förvärvs hastighet maximerar temporal upplösning när Imaging cell migration i mer ytliga vävnader. Oavsett Imaging modalitet, detta kirurgiska ingrepp är idealiskt för att exponera tarm slem hinnan för avbildning på ett inverterat Mikroskop.

Med den ökande tillgängligheten av mus stammar som uttrycker fluorescerande reportrar, fluorescently-märkta prober eller fluorescerande stammar av mikroorganismer som har genererats i en mängd våg längder, kombinationerna för att utvärdera in vivo intestinal svar i real tid är oändliga. Inte bara kan intravital Imaging ge ny inblick i cell-cell och Host-Microbe interaktioner, men det kan också belysa dynamiska molekyl ära och cellulära processer i både epitelial och immun celler under homeostatiska eller sjukdoms tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch biomedicinska Grant (KLE). Vi tackar Madeleine hu för hennes hjälp med att redigera manuskriptet och tillhandahålla de uppgifter som visas i de representativa resultaten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm dish, No. 1.5 Coverslip MatTek P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide Invitrogen A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G Thermo Fisher Scientific 14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Tuberculin Syringe Thermo Fisher Scientific 14-829-9
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 08-940
Electrocautery Thermo Fisher Scientific 50822501
Enclosed incubation chamber OKOLAB Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length Roboz RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich 55037C
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules Bitplane Software
Inverted DMi8 Leica Microscope
IQ3 (v. 3.6.3) Andor Software
Ketamine Putney Anesthesia
Kimwipes VWR 21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp Roboz RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided Fisher Scientific NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip Roboz RS-5228
Puralube Vet Ointment Dechra Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser Andor Confocal system
Xylazine Akorn Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11, (7), 445-456 (2011).
  2. Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3, (6), 321-334 (2017).
  3. Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99, (22), 14338-14343 (2002).
  4. Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
  5. Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131, (3), 818-829 (2006).
  6. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, (2), 274-282 (1993).
  7. Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20, (2), 121-128 (2019).
  8. Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140, (4), e1201-e1202 (2011).
  9. Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189, (1), 111-126 (2010).
  10. Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107, (18), 8237-8241 (2010).
  11. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203, (13), 2841-2852 (2006).
  12. McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483, (7389), 345-349 (2012).
  13. Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109, (18), 7097-7102 (2012).
  14. Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148, (7), 1417-1426 (2015).
  15. Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201, (2), 747-756 (2018).
  16. Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171, (4), 783-794 (2017).
  17. Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7, (9), 995-1003 (2006).
  18. Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215, (12), 3006-3018 (2018).
  19. Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211, (12), 2351-2359 (2014).
  20. Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2, (18), (2017).
  21. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2, (2), (2011).
  22. Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129, (3), 902-912 (2005).
  23. Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9, (5), 669-676 (1998).
  24. Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183, (2), 1044-1054 (2009).
  25. Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8, (4), 400-411 (2017).
  26. Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352, (6293), 1581-1586 (2016).
  27. Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195, (9), 4282-4291 (2015).
  28. Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185, (9), 5160-5168 (2010).
  29. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
Intravital Imaging av intraepitelial lymfocyter i murina tunn tarmen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).More

Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter