Summary
Мы представляем протокол для изолировать первичные фибробласты для взрослых простым, быстрым и надежным способом, выполняемым новичками (например, студентами). Процедура сочетает в себе ферментативное пищеварение тканей и механическое возбуждение с ультразвуковыми волнами для получения первичных фибробластов. Протокол можно легко адаптировать к конкретным экспериментальным требованиям (например, к тканям человека).
Abstract
Первичные фибробласты для взрослых стали важным инструментом для изучения фиброза, взаимодействия фибробластов и воспаления во всех тканях организма. Поскольку первичные фибробласты не могут делиться бесконечно из-за дифференциации миофибробластов или индукции сенесценции, необходимо регулярно устанавливать новые культуры. Однако в ходе процессов разработки надежного протокола изоляции и первичной изоляции фибробластов существует несколько препятствий: степень сложности метода (особенно для начинающих), риск бактериального загрязнения, требуется время, пока первичные фибробласты могут быть использованы для экспериментов, и последующее качество клеток и жизнеспособность. В этом исследовании, быстрый, надежный и простой в освоении протокол для изоляции и культуры первичных взрослых фибробластов от мыши сердца, легких, печени и почек сочетания ферментативного пищеварения и ультразвукового возбуждения предоставляется.
Introduction
Фибробласты плоские, шпиндель-образные клетки с несколькими процессами стеллатаи обширным грубым эндоплазмическим ретикулумом 1,2. Средний фибробласт измеряет 30 - 100 мкм и имеет продолжительность жизни 57 и 3 дня1,3. Средняя продолжительность клеточного цикла фибробластов человека колеблется от 16до 48 ч в зависимости от условий культуры 4. Имеются данные, свидетельствующие о том, что репликационные возможности и функциональное качество культивируемых первичных фибробластов негативно коррелирует с возрастом донора, что позволяет по возможности предпочесть более молодых доноров (животных или пациентов) по возможности5,6 .
Фибробласты представляют собой преобладающий клеточный тип большинства тканей тела млекопитающих. Несмотря на их повсеместное присутствие, молекулярная идентификация фибробластов по-прежнему является проблемой7. Фибробласты мигрируют к развивающимся тканями органам из разных источников во время эмбрионального развития 8. По этой причине, есть множество маркерных белков, которые могут быть найдены в фибробластах, в то время как уникальные маркерные белки, которые присутствуют в каждой популяции фибробластов и эксклюзивные для фибробластов, по-прежнему отсутствуют. Таким образом, для идентификации фибробластов обычно используются шаблоны выражения нескольких распознаваемых маркеров. Среди наиболее узнаваемых маркеров – виментин, белок поверхности фибробласта человека (hFSP), рецептор домена дискоидин 2 (DDR2) и альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА).
Фибробласты являются основным внеклеточным матричным (ECM)- производящим тип клетки. Таким образом, фибробласты поддерживают упорядоченную архитектуру тканей и обеспечивают механическую поддержку соседних клеток1. Баланс между синтезом ECM и деградацией является хорошо регулируемым процессом. Сдвиги в сторону синтеза знаменуют собой начало чрезмерного осаждения ECM, которое, если не прекращается, приводит к фиброзу. Фиброз опосредовано миофибробластами, которые происходят из активированных фибробластов, претерпеваемых молекулярными и фенотипическими изменениями. Одной из отличительных черт миофибробластов является усиленная секреция ЭКМ и цитокинов и выражение упорядоченных микрофиламентов9.
Первичные фибробласты были в центре внимания последних исследований упором на фиброз, воспаление тканей и фибробласт-рак-клеток взаимодействий10,11. Однако, чтобы эффективно изучать фибробластные свойства в здоровье и болезни, необходимо изолировать жизнеспособные первичные фибробласты взрослого на регулярной основе. Есть несколько методов, доступных для изоляции фибробластов12,13,14. Три основных метода фибробластной изоляции являются выращение из тканей куски12,ферментативное пищеварение ткани15, и ферментативной перфузии полых органов9,13,16. Преимуществом роста является мягкий процесс изоляции без ферментативной деградации клеток. С другой стороны, культуры роста обычно требуют длительных периодов культуры, пока клетки могут быть использованы для экспериментов. Общее ферментативное пищеварение быстро, но несет риск заражения другими типами клеток (например, эндотелиальными клетками) или бактериями в процессе агитации, что необходимо для механического растворения ткани. Кроме того, эти методы часто являются сложными и требуют времени и навыков, чтобы узнать.
Что касается важности первичных фибробластов в исследованиях, то по-прежнему существует необходимость оптимизации существующих подходов к изоляции клеток с точки зрения быстроты, простоты и надежности. Здесь предоставляется новый ультразвуковой метод ферментатической изоляции фибробластов, обеспечивающий высокое качество клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол следует институциональным руководящим принципам по уходу за животными ВДШТовского университета, Германия (Номер файла: T 2014/4), а также международно признанным руководящим принципам по уходу за животными (FELASA)17. Рисунок 1 визуализирует процесс изоляции клеток.
1. Подготовка установки, материалов и средств массовой информации
- Подготовка среды клеточной культуры, раствор PBS, коллагенеза смесь бульона решение (восстановить 50 мг лиофилизированной коллагеназе смесь в 12 мл стерильной ультрачистой воды), и 0,25% трипсина раствора.
- Разогрейте среду, PBS и раствор трипсина до 37 градусов по Цельсию.
- Разогреть ультразвуковую водяную ванну до 37 градусов по Цельсию.
- Дезинфицирующие щипцы, шпатель из нержавеющей стали, скальпели (2x скальпеля на орган) и 2 стеклянных стакана с 70% этанола и поместите эти материалы под капот клеточной культуры.
- Заполните один стакан с 70% этанола, а другой стерильной водой или РАСТВОРом PBS. Эти клювы необходимы для дезинфекции и мыть прибор после каждого органа процессии.
- Поместите стерильные пластиковые трубки 15 мл, содержащие холодные PBS, на мокрый лед. Количество труб зависит от количества органов, от которых вы хотите изолировать фибробласты.
2. Рассечение мышей и удаление органов
- Носите две пары перчаток один над другой, так что первая пара может быть удалена, как только животное было вскрыто.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура предотвращает распространение бактерий из меха и кожи животного по органам. - Эвтанизировать мышь (например, вывих шейки матки) и прикрепить тушу с помощью иглки к каждой конечности к полистироловой площадке.
- Дезинфекция туши мыши с помощью 70% этанола спрей. Убедитесь, что мех пропитан этанолом, чтобы волосы не закружились.
- Вырежьте мех прямо над урогенитальным трактом с помощью хирургических щипц и травматических ножниц. Вырежьте кожу рядом со средней линией от точки первоначального разреза до шеи (3 - 4 см) и добавьте рельефные порезы на конечностях.
ВНИМАНИЕ: Не перфорировать мышечный слой на этом этапе, чтобы избежать бактериального загрязнения! - Прикрепите кожу к прокладке пены полистирола, чтобы иметь оптимальный доступ к мускулатуре, покрывающей брюшную полость.
- Дезинфекция мускулатуры брюшной полости дважды с помощью 70% этанола. Пусть этанол высохнет, прежде чем перейти к следующему шагу.
- Снимите первую пару перчаток. Используйте новый стерильный набор щипц и ножниц.
- Откройте брюшную полость и грудную клетку, разрезая мышечный слой хирургическими ножницами, чтобы аккуратно удалить органы по выбору. Поэтому держите орган осторожно хирургическими щипками (не прокалывайте орган, используйте минимальное давление) и разрезайте поставляя кровеносные сосуды возле точки входа в орган ножницами.
- Положите органы в стерильные трубки, содержащие холодные PBS. Закройте трубки плотно. Поместите трубки на мокрый лед до тех пор, пока не продолжитес шаг 3.1.
3. Тканевая обмокание, пищеварение и извлечение клеток
- Перенесите трубки под стерильный капюшон культуры клеток.
ВНИМАНИЕ: Носите новую пару перчаток и дезинфицировать трубки с 70% этанола перед передачей их под капотом! - Вынизуйте орган из трубки 15 мл с помощью стерильных щиптов. Поместите орган на половину стерильной 6 см Петри блюдо и мыть орган кратко с PBS, чтобы удалить избыток крови. Перенесите орган во вторую половину чашки Петри, удалите избыток PBS.
- Фарш ткани с помощью двух стерильных скальпелей. Остальные фрагменты ткани не должны быть больше 1 - 2 мм.
- Перенесите измельченную ткань в новую стерильную трубку 15 мл с помощью стерильного шпателя и добавьте 2 мл раствора трипсина 0,25%. Поместите трубку в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
- Вихрь трубки мягко (около 1400/мин) в течение 10 с.
- Остановите реакцию трипсина под капотом клеточной культуры, добавив 4 мЛ FCS-содержащей среды клеточной культуры (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), например).
- Добавьте 250 зЛ раствора смеси коллагеназа к каждой трубке, содержащей ткани сердца или легких, и 100 Л л для почек или печени, соответственно.
- Поместите трубки в ультразвуковую водяную ванну (37 градусов по Цельсию) и активируйте ультразвуковой звуковой элемент в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковая водяная ванна, используемая в этом протоколе, имеет операционную частоту 35 кГц и максимальную мощность 320 Вт. - Вихрь трубки мягко (около 1400/мин) в течение 10 с.
- Поместите трубки снова в ультразвуковой водяной бане в течение 10 минут.
- Вихрь мягко (около 1400/мин) на 10 с.
- Дезинфекция труб с 70% этанола и передать их под стерильным капюшоном культуры клеток.
- Фильтр раствора с 40 мкм сетки в новую стерильную трубку 15 мл.
- Центрифуга трубки на 500 х г в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и resuspend гранулы в 1 мл свежей среде.
- Перенесите клетки в подходящий сосуд клеточной культуры (например, 6-ну хорошо пластины) и поместите сосуд в инкубатор клеточной культуры на ночь при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
- На следующий день удалите среду, промойте 3 раза PBS, затем добавьте свежую среду (добавленный объем зависит от сосуда клеточной культуры выбора, 2 мл на колодец 6-хорошей пластины и т.д.).
- Изменение среды через день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты могут быть разделены после достижения оптического слияния 90% (обычно через 5-7 дней).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Была продемонстрирована способность этого протокола изолировать взрослые фибробласты из твердой ткани мурин. Были получены жизнеспособные фибробласты, которые могут быть использованы для последующих экспериментов, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание или эксперименты по распространению(рисунок 2D-F, Рисунок 5A).
Взрослые фибробласты являются плоскими шпиндель-образными клетками с несколькими клеточными процессами, которые обычно растут в монослойах12,18. Полученные результаты отражают эти морфологические признаки и указывают на явные морфологические различия в популяциях фибробластов из разных органов(рисунок 2). Почечные фибробласты были особенно малы и росли при более высокой плотности, чем сердечные, легочные или печеночные фибробласты(рисунок 2).
Верхняя панель рисунка 3 изображает процесс созревания и пролиферации клеток на примере сердечных фибробластов после изоляции. Клетки отображаются высокие темпы распространения, достигающие оптического слияния в размере 90% после 6 и 1 дней. На этом уровне слияния фибробластов остановить размножаться18 и клетки могут быть разделены, используя 0,25% трипсин, и переданы в больших колб культуры клеток для последующей культуры или экспериментов.
В условиях базальной клеточной культуры фибробластные культуры состоят из фибробластов и меньшей доли миофибробластов19,20. Есть несколько принятых маркеров для выявления фибробластов. DDR2 и vimentin выражение являются общими фибробластными маркерами и выражение организованных микрофиламентов ЗСМА указывает на дифференциацию миофибробластов7,9. Репрезентативное изображение дифференцированного миофибробласта с отличительными микрофиламентами SMA и репрезентативными обзорными изображениями для изобилия нитей SMA в сердце, почках, печени и легких представлены на рисунке 4. В то время как только около 20 - 30% изолированных и впоследствии культивированных клеток выразили упорядоченно расположенные микрофилеты (с указанием дифференциации миофибробластов), все клетки (99%) были положительными для vimentin и DDR2(Рисунок 3, нижняя панель).
Рисунок 1 . Обзор процедуры изоляции фибробластов. После того, как органы интереса были удалены из мыши, они рубленые под капюшоном клеточной культуры с помощью стерильных скальпелей. Впоследствии, фарш ткани передается на 0,25% трипсина раствор в течение 5 мин. После первого пищеварения добавляется раствор смеси коллагеназа и трубки переносятся в ультразвуковую ванну на 20 мин при 37 градусах Цельсия. После фильтрации и центрифугации клеточные гранулы могут быть перенесены в подходящее блюдо клеточной культуры. После по крайней мере 8 ч, чтобы прикрепить, культуры промывают три раза с PBS для удаления эритроцитов и мусора. Наконец, добавляется свежая среда (DMEM, 15% FCS, 1% пенициллин/стрептомицин) и клетки могут быть культивированы. Изображения Сервье смарт-медицинского искусства были использованы для создания фигуры (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 . Первичные фибробласты морин, изолированные от твердых органов после 7 дней первичной культуры. A) Сердечные фибробласты. B) Легочные фибробласты. C) Почечные фибробласты. D) фибробласты печенок. Клетки были культивированы в DMEM (15% FCS, 1% пенициллин / streptomycin (PS)) при 37 КС и 5% CO2. 10x увеличение и 5.6x оптическая камера зум были использованы для получения этих изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 . Идентификация фибробластов в культуре. A - C) Присоединение и рост сердечных фибробластов в течение 4 дней. После мытья и среднего изменения прикрепленные фибробласты развивают свою отличительную форму и размножаются. Клетки культивировались в DMEM (15% FCS, 1% PS). D - F) Иммунофлуоресцентные изображения первичных фибробластов после 7 дней культуры для фибробластных маркеров ЗСМА (D), DDR2 (E) и Vimentin (F). Ядра были окрашены DAPI (синий). Первичные антитела (Сигма-Олдрич) были разбавлены 1:200 в 1% растворе BSA (ЗСМА: A5228; DDR2: HPA070112; Виментин: V5255). Alexa-Fluor 488 использовался в качестве вторичного антитела. Шкала баров равна указанной длины выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 . Представитель иммуноцитохимических изображений для изобилия микрофилементов SMA. A) Отображается типичный миофибробласт (увеличение: 20x). B - E) Представитель обзоризображения SMA для сердца (B), почек (C), печени (D) и легких (E) (увеличение: 10x). Белые круги указывают на репрезентативные клетки, которые считались миофибробластами. Ядра были окрашены DAPI (синий). Первичное антитело было разбавлено 1:200 в 1% растворе BSA (ЗСМА: A5228). Alexa-Fluor 488 использовался в качестве вторичного антитела. Шкала баров равна указанной длины выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 . Показатели распространения мурин фибробластов и развития сенесценции in vitro. A) Скорость распространения фибробластов мурин определяется после 7 и 14 дней культуры. Клетки были собраны и подсчитаны с камерой Buerker на соответственно пунктах времени. Результаты представляют количество клеток в 1 мл среды. B) Чувствительность определяется наличием к-галактозидазе (окрашенный зеленый). Чувствительные клетки показаны белыми кругами. Шкала бар равен 50 мкм. Результаты представлены как средние SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По сравнению с увековеченными фибробластными клеточными линиями, первичные фибробласты предлагают несколько преимуществ. Они могут быть изолированы экономически эффективно в высоком качестве и количестве. Кроме того, первичные культуры предлагают возможность изучения клеток у нескольких людей, что повышает надежность полученных результатов и снижает вероятность простого изучения артефактов клеточной культуры. Непрерывное генерация новых первичных культур предотвращает генетические изменения, которые обычно происходят после повторного прохождения21. Кроме того, клеточное сенесценция22,23 или увеличение дифференциации миофибробластов встречаются чаще в культурах при высоких проходах20. При низких проходах (2-3) базальная миофибробластная величина составляла примерно 20 - 30% (данные не показаны) и только 2,89% клеток считались старческими на основе экспрессии з-галактозидазе(рисунок 5B). По этой причине рекомендуется пройти культуры до максимума в 5 раз и заменить их в дальнейшем. Это гарантирует надежные и воспроизводимые результаты на протяжении всех экспериментов. Оптимальный рост и пролиферация фибробластов были получены с помощью среды клеточной культуры, содержащей 15% FCS вместо 10%. Это обеспечило надежную урожайность фибробластов и хорошую жизнеспособность клеток после первого прохода.
Этот протокол дополняет существующие методы с точки зрения скорости и степени сложности. Методы роста требуют от 10 до 21 дней, в зависимости от вида и ткани, пока достаточное количество фибробластов может быть собрано12,24. Langendorff-перфузия, с другой стороны, быстро (Злт;5 ч), но требует более ручного мастерства и подготовки. По сравнению с методами роста12,24 или фибробластизоляции от супернатанта Langendorff-перфузии16, этот протокол предлагает особенно новичкам возможность работать с первичными клетками после очень короткого тренировочный период (2 - 3 изоляции) без требования высокого механического мастерства или технических усилий. Загрязнение нефибробластными клетками (например, эндотелиальными клетками) было незначительным, поскольку культивированные фибробласты быстро перерастают другие типы клеток в культурах из-за их более высоких показателей пролиферации25. Кроме того, этот протокол дает четкие инструкции, которые помогают избежать бактериального загрязнения, которое является одной из основных проблем, работающих с первичными клетками мурин. Здесь были выявлены два важных шага, чтобы избежать загрязнения. Первый - удаление органов. Бактерии меха грызунов могут быть легко переданы в органы, если перчатки и хирургические инструменты не изменены после удаления меха и кожи. Вторым важным шагом является сам процесс изоляции. Клетки должны быть удалены механически из их ниши ткани. В контексте Лангендорф-перфузии это реализуется непрерывным током жидкости. Другие методы используют магнитные перемешивания баров или встряхивания методы. В частности, замена магнитных перемешивания баров ультразвуковыми волнами снижает риск бактериального загрязнения, избегая физического контакта между мешалкой и тканевым лизатом. Дополнительным преимуществом ультразвуковой водяной ванны является равномерное распределение тепла в трубках, обеспечивая тем самым оптимальную рабочую температуру ферментов.
В заключение, этот протокол обеспечивает быстрый, надежный и реплицируемый метод изоляции первичных фибробластов, который идеально подходит как для продвинутых, так и для исследователей на ранних стадиях. Этот метод является полезным дополнением к существующему спектру методов, которые могут способствовать лучшему пониманию функции фибробластов в области здравоохранения и болезней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликта интересов объявлять не существует.
Acknowledgments
Мы благодарим г-жу Роми Кемпе и г-жу Аннетта Опица за экспертную техническую поддержку. Мы также благодарим г-на Бьорна Бинневерга за ИТ-поддержку. Эта работа была поддержана грантами от а) Фюрдеркрейс Дрезднер Херц-Крейслауф-Таге е.В., б) "Хабилитацииффдердерпрограмма фюр Фрауэн", Медицинский факультет Карл Густав Карус Дрезден и с) Эльза Крюнер-Форшунгсколлег (EKFK) Факультет медицины КарлА Гюрюна Карус Дрезден. Мы признательны за финансирование и поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
References
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
