Summary
Vi presenterar ett protokoll för att isolera primära vuxna fibroblaster på ett enkelt, snabbt och tillförlitligt sätt, framföras av nybörjare (t. ex. studenter). Förfarandet kombinerar enzymatisk vävnad nedbrytning och mekanisk agitation med ultraljud vågor för att få primära fibroblaster. Protokollet kan enkelt anpassas till specifika experimentella krav (t. ex. mänsklig vävnad).
Abstract
Primära vuxna fibroblaster har blivit ett viktigt verktyg för att studera fibros, fibroblast interaktioner och inflammation i alla kroppens vävnader. Eftersom primära fibroblaster inte kan dela på obestämd tid på grund av myofibroblast differentiering eller åldras induktion, nya kulturer måste fastställas regelbundet. Det finns dock flera hinder att övervinna under processerna för att utveckla ett tillförlitligt isolerings protokoll och primär fibroblast isolering själv: metodens svårighetsgrad (särskilt för nybörjare), risken för bakteriell kontaminering, nödvändig tid tills primära fibroblaster kan användas för experiment, och efterföljande cell kvalitet och lönsamhet. I denna studie, en snabb, tillförlitlig och lätt att lära sig protokoll för att isolera och odla primära vuxna fibroblaster från mus hjärta, lungor, lever och njure som kombinerar enzymatisk matsmältning och ultraljud agitation tillhandahålls.
Introduction
Fibroblaster är platta, Spindelformade celler med flera stellate processer och en omfattande grov endoplasmatiska nätmagen1,2. En genomsnittlig fibroblast åtgärder 30-100 μm och har en livslängd på 57 ± 3 dagar1,3. Den genomsnittliga cell cykel varaktigheten av humana fibroblaster varierar från 16-48 h beroende på kulturen villkor4. Det finns belägg för att den replikativa kapaciteten och funktionella kvaliteten hos odlade primära fibroblaster negativt korrelerar med givar åldern, vilket tyder på att yngre donatorer (djur eller patienter) bör föredra om möjligt5,6 .
Fibroblaster utgör en dominerande celltyp av de flesta däggdjurs organ vävnader. Trots sin allestäde närvarande närvaro, molekylära identifiering av fibroblaster är fortfarande en utmaning7. Fibroblaster migrera till att utveckla vävnader och organ från olika källor under embryonal utveckling8. Av denna anledning, det finns en uppsjö av markör proteiner som kan hittas i fibroblaster medan unika markör proteiner, som finns i varje fibroblast population och exklusivt för fibroblaster, saknas fortfarande. Sålunda, uttrycksmönster av flera erkända markörer används vanligtvis för att identifiera fibroblaster. Bland de mest erkända markörer är vimentin, humant fibroblast yta protein (HFSP), discoidin domän receptor 2 (DDR2) och alfa glatt muskel aktin (αsma).
Fibroblaster är den största extracellulära matrix (ECM)-producerande celltyp. Därmed upprätthåller fibroblaster en ordnad vävnads arkitektur och ger mekaniskt stöd för angränsande celler1. Balansen mellan ECM-syntes och nedbrytning är en välreglerad process. Förskjutningar mot syntes markerar början på överdriven ECM-deposition som, om den inte avslutas, leder till fibros. Fibros medieras av myofibroblaster, som härstammar från aktiverade fibroblaster som genomgår molekylära och fenotypiska förändringar. Ett kännetecken för myofibroblaster är förbättrad utsöndring av ECM och cytokiner och uttrycket av ordnad arrangerade αSMA Microfilaments9.
Primära fibroblaster har varit i fokus för ny forskning med fokus på fibros, vävnadsinflammation och fibroblast-cancer-cellinteraktioner10,11. Emellertid, att effektivt studera fibroblast egenskaper i hälsa och sjukdom, det är nödvändigt att isolera livskraftiga primära vuxna fibroblaster på regelbunden basis. Det finns flera metoder som är tillgängliga för att isolera fibroblaster12,13,14. De tre viktigaste metoderna för fibroblast isolering är utväxt från vävnad bitar12, enzymatisk vävnad nedbrytning15, och enzymatisk perfusion av ihåliga organ9,13,16. Fördelen med utväxt är en skonsam isolerings process utan enzymatisk cell nedbrytning. Å andra sidan, utväxt kulturer kräver vanligtvis långvariga odlings perioder tills cellerna kan användas för experiment. Vanlig enzymatisk matsmältning är snabb men bär en risk för kontaminering med andra celltyper (t. ex. endotelceller) eller bakterier i omrörningsprocessen, vilket är nödvändigt för att mekaniskt lösa upp vävnaden. Dessutom är dessa metoder ofta utarbeta och kräver tid och skicklighet att lära.
När det gäller vikten av primära fibroblaster i forskning, det finns fortfarande ett behov av att optimera befintliga cell isolering metoder i termer av snabbhet, enkelhet och tillförlitlighet. Här, en roman ultraljud-baserade enzymatisk fibroblast isoleringsmetod som levererar högkvalitativa celler tillhandahålls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll följer den institutionella djuromsorg riktlinjer Technische Universität Dresden, Tyskland (filnummer: T 2014/4) samt internationellt accepterade djuromsorg riktlinjer (FELASA)17. Figur 1 visualiserar cell isolerings processen.
1. förbereda installation, material och media
- Förbered cellkulturmedium, PBS lösning, kollagenase blandning stamlösning (Rekonstituera 50 mg frystorkat kollagenase blandning i 12 ml sterilt ultrarent vatten), och 0,25% trypsin lösning.
- Värm upp mediet, PBS och trypsin-lösningen till 37 ° c.
- Värm ultraljud vattenbadet till 37 ° c.
- Desinficera tång, en rostfrittstål spatel, skalpeller (2x skalpels per orgel) och 2 glasbägare med 70% etanol och placera dessa material under cell Culture Hood.
- Fyll en bägare med 70% etanol och den andra med sterilt vatten eller PBS-lösning. Dessa bägare är skyldiga att desinficera och tvätta instrumentet efter varje organ procession.
- Placera sterila 15 mL-plaströr som innehåller kall PBS på våt is. Antalet rör beror på antalet organ du vill isolera fibroblaster från.
2. mus dissektion och organ avlägsnande
- Bär två par handskar ovanpå varandra, så det första paret kan tas bort så snart djuret har dissekerats.
Anmärkning: denna procedur förhindrar bakterier från djurets päls och hud sprids över organen. - Euthanize musen (t. ex., cervikal dislokation) och stift kadaver med nålar till varje lem till en polystyren pad.
- Desinficera musens kadaver med hjälp av 70% etanol spray. Se till att pälsen är indränkt i etanol så att håret inte virvlar upp.
- Skär pälsen rakt över urogenitala tarmkanalen med hjälp av kirurgisk pinpett och atraumatisk sax. Skär huden vid sidan av mittlinjen från den punkt där den initiala snittet till halsen (3-4 cm) och tillsätt lättnad nedskärningar i armar och ben.
Varning: perforera inte muskellagret i detta steg för att undvika bakteriell kontaminering! - Stift huden till polystyren skum pad för att få optimal tillgång till muskulatur som täcker bukhålan.
- Desinficera bukmuskulaturen två gånger med 70% etanol. Låt etanol torka innan du fortsätter till nästa steg.
- Ta bort det första paret handskar. Använd en ny, steril uppsättning pinps och sax.
- Öppna bukhålan och bröstkorgen genom att uppmana muskellagret med kirurgisk sax för att försiktigt ta bort organ val. Därför, håll orgeln försiktigt med kirurgiska pinkoppar (inte punktera orgeln, Använd minimalt tryck) och skär de försörjer blodkärlen nära ingångspunkten på orgel med sax.
- Placera organen i de sterila rören som innehåller kallt PBS. Stäng rören tätt. Placera rören på våt is tills de fortsätter med steg 3,1.
3. vävnads mincing, matsmältning och cell utvinning
- Överför rören under den sterila cell Culture Hood.
FÖRSIKTIGHET: Använd en ny par handskar och desinficera rören med 70% etanol innan du överför dem under huven! - Ta ut orgeln ur 15 mL-röret med hjälp av sterila tång. Placera orgeln på ena halvan av en steril 6 cm petriskål och tvätta orgel kort med PBS för att avlägsna överflödigt blod. Överför orgeln till andra halvan av petriskål, ta bort överflödig PBS.
- Finhacka vävnaden med två sterila skalpeller. De kvarvarande vävnads fragmenten får inte vara större än 1-2 mm.
- Överför den malda vävnaden till ett nytt sterilt 15 mL-rör med den sterila spateln och tillsätt 2 mL 0,25% trypsinlösning. Placera röret i en cellkultur inkubator vid 37 ° c i 5 min.
- Vortexblanda röret försiktigt (ca 1400/min) i 10 s.
- Stoppa trypsin reaktionen under cell Culture Hood genom att tillsätta 4 mL FCS-innehållande cellodlingsmedium (Dulbecco ' s modifierade Eagle medium (DMEM), t. ex.).
- Tillsätt 250 μL av kollagenasblandningslösningen till varje tub som innehåller hjärt-eller lungvävnad och 100 μL för njurar respektive lever.
- Placera rören i ett ultraljud vattenbad (37 ° c) och aktivera ultraljud ultraljudsapparat för 10 min.
Obs: det ultraljuds vattenbad som används i detta protokoll har en operativ frekvens på 35 kHz och en maximal effekt på 320 W. - Vortexblanda rören försiktigt (ca 1400/min) i 10 s.
- Placera rören igen i ultraljud vattenbad för 10 min.
- Vortex försiktigt (ca 1400/min) i 10 s.
- Desinficera rören med 70% etanol och överför dem under den sterila cell Culture Hood.
- Filtrera lösningen med en mask på 40 μm i ett nytt sterilt 15 mL-rör.
- Centrifugera röret vid 500 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och Omsuspendera pelleten i 1 mL färskt medium.
- Överför cellerna till ett lämpligt cell odlingskärl (t. ex. 6-brunn-plåt) och placera kärlet i cellkulturens inkubator över natten vid 37 ° c och 5% CO2.
- Nästa dag, ta bort mediet, tvätta 3 gånger med PBS, tillsätt sedan färskt medium (den extra volymen beror på cell odlings kärlet val, 2 mL per brunn av en 6-brunn tallrik etc.).
- Ändra mediet varannan dag.
Anmärkning: fibroblaster kan delas efter att nå optiska sammanflödet av 90% (vanligtvis efter 5-7 dagar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Möjligheten för detta protokoll för att isolera vuxna fibroblaster från solid murin vävnad visades. Livskraftiga fibroblaster erhölls som kunde användas för efterföljande experiment som immunofluorescensfärgning eller proliferation experiment (figur 2D-F, figur 5A).
Vuxna fibroblaster är platt spindel-formade celler med flera cellulära processer som vanligtvis växer i enskiktslager12,18. De erhållna resultaten återspeglar dessa morfologiska kännetecken och visar tydliga morfologiska skillnader i fibroblastpopulationer från olika organ (figur 2). Renal fibroblaster var särskilt mindre och växte vid högre densitet än kardiella, pulmonella eller hepatiska fibroblaster (figur 2).
Den övre panelen i figur 3 skildrar processen för cell mognad och proliferation via exemplet av hjärt fibroblaster efter isoleringen. Cellerna visade höga spridnings hastigheter som nådde optiska sammanflödet av > 90% efter 6 ± 1 dagar. På denna nivå av sammanflödet fibroblaster sluta att förgöra18 och cellerna kan delas, med 0,25% trypsin, och överföras till större cell odlingsflaskor för efterföljande kultur eller experiment.
Under basalcells odling villkor, fibroblastkulturer består av fibroblaster och en mindre andel av myofibroblaster19,20. Det finns flera accepterade markörer för att identifiera fibroblaster. DDR2 och vimentin uttryck är vanliga fibroblast markörer och uttrycket av organiserade αsma Microfilaments indikerar myofibroblast differentiering7,9. En representativ bild av en differentierad myofibroblast med distinkta αSMA microfilament och representativa översiktsbilder för αSMA glödtrådens överflöd i hjärta, njure, lever och lungor presenteras i figur 4. Medan endast omkring 20-30% av de isolerade och därefter odlade celler uttryckt ordnad arrangerade αSMA mikrofilament (indikerar myofibroblast differentiering), alla celler (≈ 99%) var positiva för vimentin och DDR2 (figur 3, nedre panelen).
Figur 1 . Översikt av fibroblast isolerings proceduren. Efter de organ av intresse har tagits bort från musen, de mals under en cellkultur huva med hjälp av sterila skalpeller. Därefter, den malda vävnaden överförs till 0,25% trypsin lösning för 5 min. Efter den första matsmältningen, kollagenase Blend lösning tillsätts och rören överförs till ett ultraljudsbad för 20 min vid 37 ° c. Efter filtrering och centrifugering kan cellpelleten överföras till en lämplig cellkultur rätt. Efter minst 8 h att fästa, är kulturerna tvättas tre gånger med PBS att ta bort erytrocyter och skräp. Slutligen, färskt medium (DMEM, 15% FCS, 1% penicillin/streptomycin) tillsätts och cellerna kan odlas. Bilder av Servier Smart Medical art har använts för att skapa figuren (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Primär murina fibroblaster isolerade från solida organ efter 7 dagar av primärkulturen. A) hjärt fibroblaster. B) pulmonella fibroblaster. C) renal fibroblaster. D) hepatiska fibroblaster. Cellerna var odlade i DMEM (15% FCS, 1% penicillin/streptomycin (PS)) vid 37 ° c och 5% CO2. 10X förstoring och 5,6 x optisk Kamerazoom användes för att få dessa bilder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Identifiering av fibroblaster i kulturen. A-C) kvarstad och tillväxt av hjärt fibroblaster för 4 dagar. Efter tvättning och medium förändring bifogade fibroblaster utveckla sin distinkta form och förbygga. Cellerna var odlade i DMEM (15% FCS, 1% PS). D-F) Immunofluorescensfärgning bilder av primära fibroblaster efter 7 dagar av kultur för fibroblast markörer αSMA (D), DDR2 (E) och Vimentin (F). Kärvar färgas med DAPI (blått). Primära antikroppar (Sigma-Aldrich) späddes 1:200 i 1% BSA lösning (αSMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-fluor 488 användes som sekundär antikropp. Skalnings staplarna motsvarar de angivna längderna ovan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Representativa immunocytokemiska bilder för αSMA-mikrofilamentöverflöd. A) en typisk myofibroblast visas (förstoring: 20x). B – E) Representativa αSMA översiktsbilder för hjärta (B), njure (C), lever (D) och Lung (E) (förstoring: 10X). De vita cirklarna indikerar representativa celler som ansågs myofibroblaster. Kärvar färgas med DAPI (blått). Den primära antikroppen späddes 1:200 i 1% BSA-lösning (αSMA: A5228). Alexa-fluor 488 användes som sekundär antikropp. Skalnings staplarna motsvarar de angivna längderna ovan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Spridning av murina fibroblaster och in vitro-utveckling av senescens. A) spridning av murina fibroblaster bestäms efter 7 och 14 dagar av kultur. Celler skördades och räknades med en Buerkerkammare vid respektive tidpunkt. Resultaten representerar cell räkningen i 1 mL medium. B) senescens bestäms av närvaron av β-galaktosidas (målat grönt). Senescent celler indikeras med vit cirklar. Skalstapeln är lika med 50 μm. resultat presenteras som medelvärdet ± SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med förevigade fibroblast cellinjer, primära fibroblaster erbjuder flera fördelar. De kan vara isolerade kostnadseffektivt i hög kvalitet och kvantitet. Dessutom erbjuder primär kulturer möjligheten att studera celler från flera individer, vilket ökar tillförlitligheten hos de erhållna resultaten och minskar sannolikheten för att enbart studera cellkultur artefakter. Kontinuerlig generering av nya primär kulturer förhindrar genetiska förändringar som vanligtvis inträffar efter upprepad passaging21. Dessutom, cellulära åldras22,23 eller ökad myofibroblast differentiering förekommer oftare i kulturer vid höga passager20. Vid låga passager (2-3), den basala myofibroblast antalet var cirka 20-30% (data inte visas) och endast 2,89% av cellerna ansågs senescent baserat på β-galaktosidas uttryck (figur 5B). Av denna anledning, det rekommenderas att passage kulturerna upp till maximal 5 gånger och att ersätta dem nedan. Detta garanterar tillförlitliga och replikerbara resultat under experimenten. Optimal fibroblasttillväxt och proliferation erhölls med cell odlingssubstrat innehållande 15% FCS i stället för 10%. Detta säkerställde en robust fibroblast avkastning och god cell lönsamhet efter den första passagen.
Detta protokoll kompletterar de befintliga teknikerna i fråga om snabbhet och svårighetsgrad. Utväxt tekniker kräver mellan 10-21 dagar, beroende på art och vävnad, tills tillräckliga mängder fibroblaster kan skördas12,24. Langendorff-perfusion å andra sidan är snabb (< 5 h) men kräver mer manuell skicklighet och utbildning. Jämfört med utväxt metoder12,24 eller fibroblast isolering från supernatanten av langendorff-perfusion16, detta protokoll ger särskilt nybörjare möjlighet att arbeta med primära celler efter en mycket kort träningsperiod (2-3 isoleringar) utan krav på hög mekanisk skicklighet eller teknisk ansträngning. Kontaminering med icke-fibroblastceller (t. ex. endotelceller) var försumbar eftersom odlade fibroblaster snabbt överodla andra celltyper i kulturer på grund av deras högre spridnings frekvens25. Dessutom, detta protokoll ger tydliga instruktioner som hjälper till att undvika bakteriell kontaminering, vilket är ett stort problem att arbeta med primära murina celler. Här identifierades två kritiska steg för att undvika kontaminering. Den första är organ avlägsnande. Gnagare päls bakterier kan lätt överföras till organen om handskar och kirurgiska instrument inte ändras efter avlägsnande av päls och hud. Det andra kritiska steget är själva isolerings processen. Cellerna måste avlägsnas mekaniskt från sin vävnads nisch. I sammanhanget av Langendorff-perfusion realiserades detta av en fortlöpande ström av flytande. Andra tekniker använder magnetiska omrörnings stänger eller skakmetoder. Särskilt, utbyte av magnetiska omrörare av ultraljud vågor minskar risken för bakteriell kontaminering genom att undvika fysisk kontakt mellan omröraren och vävnaden lysate. En ytterligare fördel med ultraljud vattenbadet är jämn fördelning av värme till rören, vilket ger optimala arbetstemperaturer för enzymerna.
Sammanfattningsvis, detta protokoll ger en snabb, tillförlitlig och replikerbar metod för att isolera primära fibroblaster som är idealisk för både avancerade och tidigt stadium forskare. Denna metod är ett användbart komplement till den befintliga spektrum av tekniker som kan bidra till en bättre förståelse av fibroblast funktion i hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar MS Romy Kempe och Mrs. Annett Opitz för expert teknisk support. Vi tackar också Mr Bjoern Binnewerg för IT-stöd. Detta arbete stöddes av bidrag från a) Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", medicinska fakulteten Carl Gustav Carus Dresden och c) Else kröner-Forschungskolleg (EKFK) medicinska fakulteten Carl Gustav Carus Dresden. Vi är tacksamma för finansieringen och stödet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
References
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
