Summary
Vi presenterer en protokoll for å isolere primær voksen fibroblaster på en enkel, rask og pålitelig måte, performable av nybegynnere (f. eks, studenter). Prosedyren kombinerer enzymatisk vev fordøyelse og mekanisk agitasjon med ultralydbølger for å få primær fibroblaster. Protokollen kan enkelt tilpasses spesifikke eksperimentelle krav (f.eks. menneskelig vev).
Abstract
Primær voksen fibroblaster har blitt et viktig verktøy for å studere fibrose, Fibroblast interaksjoner og betennelser i alle kroppens vev. Siden primære fibroblaster ikke kan dele på ubestemt tid på grunn av myofibroblast differensiering eller senescence induksjon, nye kulturer må etableres regelmessig. Det er imidlertid flere hindringer å overvinne under prosessene med å utvikle en pålitelig isolasjons protokoll og primær Fibroblast isolasjon seg selv: metoden vanskelighetsgrad (spesielt for nybegynnere), risikoen for bakteriell forurensning, nødvendig tid før primære fibroblaster kan brukes til eksperimenter, og påfølgende celle kvalitet og levedyktighet. I denne studien, en rask, pålitelig og lett å lære protokollen for å isolere og kultur primære voksen fibroblaster fra mus hjerte, lunge, lever og nyre kombinere enzymatisk fordøyelse og ultralyd omrøring er gitt.
Introduction
Fibroblaster er flate, spindel-formede celler med flere Stel prosesser og en omfattende grov endoplasmatiske retikulum1,2. En gjennomsnittlig Fibroblast måler 30-100 μm og har en levetid på 57 ± 3 dager1,3. Den gjennomsnittlige celle syklus varigheten av menneskelig fibroblaster varierer fra 16-48 h avhengig av kulturen forhold4. Det er dokumentert at replicative kapasitet og funksjonell kvalitet på kulturperler primære fibroblaster negativt samsvarer med donor alder, noe som tyder på at yngre donorer (dyr eller pasienter) bør foretrekkes hvis mulig5,6 .
Fibroblaster utgjør en dominerende celle type mest pattedyr kroppens vev. Til tross for deres allestedsnærværende tilstedeværelse, den molekylære identifisering av fibroblaster er fortsatt en utfordring7. Fibroblaster migrere til å utvikle vev og organer fra ulike kilder under embryonale utviklingen8. Av denne grunn er det en overflod av markør proteiner som finnes i fibroblaster mens unike markør proteiner, som er til stede i hver Fibroblast befolkning og eksklusivt for fibroblaster, er fortsatt mangler. Uttrykks mønstre for flere gjenkjente markører brukes derfor vanligvis til å identifisere fibroblaster. Blant de mest anerkjente markører er vimentin, humant Fibroblast overflate protein (hFSP), discoidin domene reseptor 2 (DDR2) og Alpha glatt muskel utgangen (αSMA).
Fibroblaster er de viktigste ekstracellulære matrise (ECM)-produserende celle type. Derved, fibroblaster opprettholde en ryddig vev arkitektur og gi mekanisk støtte for nærliggende celler1. Balansen mellom ECM-syntese og-degradering er en godt regulert prosess. Skifter mot syntese markere begynnelsen av overdreven ECM deponering som, hvis ikke avsluttet, fører til fibrose. Fibrose er formidlet av myofibroblasts, som stammer fra aktivert fibroblaster gjennomgår molekylær og phenotypical endringer. Et kjennetegn på myofibroblasts er forbedret sekresjon av ECM og cytokiner og uttrykk for ryddig arrangert αSMA microfilaments9.
Primære fibroblaster har vært i søkelyset av nyere forskning med fokus på fibrose, vevs betennelse og Fibroblast-kreft-celle interaksjoner10,11. Men for å effektivt studere Fibroblast egenskaper i helse og sykdom, er det nødvendig å isolere levedyktig primær voksen fibroblaster på jevnlig basis. Det finnes flere metoder for å isolere fibroblaster12,13,14. De tre store metoder for Fibroblast isolasjon er utvekst fra vev biter12, enzymatisk vev fordøyelse15, og enzymatisk av hul organer9,13,16. Fordelen med utvekst er en skånsom isolasjons prosess uten enzymatisk celle degradering. På den annen side, utvekst kulturer krever vanligvis forlenget kultur perioder inntil cellene kan brukes til eksperimenter. Vanlig enzymatisk fordøyelsen er rask, men bærer en risiko for forurensning med andre celletyper (f. eks, endothelial celler) eller bakterier i agitasjon prosessen, som er nødvendig for å mekanisk oppløse vevet. Videre disse metodene er ofte forseggjort og krever tid og dyktighet til å lære.
Når det gjelder viktigheten av primære fibroblaster i forskning, er det fortsatt behov for å optimalisere eksisterende celle isolasjon tilnærminger i form av hurtighet, enkelhet og pålitelighet. Her, en roman ultralyd-basert enzymatisk Fibroblast isolasjon metode levere høy kvalitet celler er gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll følger de institusjonelle dyre omsorgen retningslinjer for Technische Universität Dresden, Tyskland (filnummer: T 2014/4) samt internasjonalt aksepterte dyre omsorg retningslinjer (FELASA)17. Figur 1 visualiserer celle isolasjons prosessen.
1. klargjøre oppsett, materiale og Media
- Forbered cellekultur medium, PBS løsning, kollagenase blanding lagerløsning (Rekonstituer 50 mg lyofilisert kollagenase blanding i 12 mL sterilt ultrarent vann), og 0,25% Trypsin løsning.
- Varm opp mediet, PBS og den Trypsin løsningen til 37 ° c.
- Varm opp ultralyd vannbadet til 37 ° c.
- Desinfisering tang, en rustfritt stål spatel, skalpeller (2x skalpeller per organ) og 2 glass kanner med 70% etanol og plassere disse materialene under cellen kultur panseret.
- Fyll ett beger med 70% etanol og det andre med sterilt vann eller PBS-løsning. Disse kanner er nødvendig for å desinfisere og vaske instrumentet etter hvert organ prosesjon.
- Plasser sterile 15 mL plast rør som inneholder kald PBS på våt is. Antall rør avhenger av hvor mange organer du ønsker å isolere fibroblaster fra.
2. mus disseksjon og orgel fjerning
- Bruk to par hansker over hverandre, slik at det første paret kan fjernes så snart dyret har blitt dissekert.
Merk: denne prosedyren hindrer bakterier fra dyrets pels og hud fra å spre seg over organene. - Euthanize musen (f. eks, cervical forvridning) og PIN stammen med nåler til hvert lem til en polystyren pad.
- Desinfisere mus stammen med 70% etanol spray. Pass på at pelsen er dynket i etanol, slik at håret ikke vil virvel opp.
- Skjær pelsen rett over urogenitale tarmkanalen ved hjelp av kirurgisk tang og atraumatiske saks. Skjær huden langs den midterste linjen fra det punktet av den innledende snitt til halsen (3-4 cm) og legge lettelse kutt på lemmer.
FORSIKTIG: ikke perforere muskellaget på dette trinnet for å unngå bakteriell forurensning! - PIN huden til polystyren skumputen å ha optimal tilgang til muskulaturen dekker bukhulen.
- Desinfisere abdominal muskulaturen to ganger med 70% etanol. La etanol tørke før du fortsetter til neste trinn.
- Fjern det første paret med hansker. Bruk et nytt, sterilt sett med tang og saks.
- Åpne bukhulen og thorax ved incising muskuløse laget med kirurgisk saks for å forsiktig fjerne organene av valget. Derfor holder orgelet forsiktig med kirurgisk tang (ikke Pierce orgelet, bruk minimalt trykk) og kutt forsyne blodkar i nærheten av inngangspunktet på orgelet med saks.
- Sett organene inn i sterile rør som inneholder kald PBS. Lukk rørene tett. Plasser rørene på våt is til du fortsetter med trinn 3,1.
3. tissue hakking, fordøyelse og celle utvinning
- Overfør rørene under den sterile cellekultur panseret.
FORSIKTIG: Bruk et nytt par hansker og desinfisere rørene med 70% etanol før du overfører dem under panseret! - Ta orgelet ut av 15 mL røret ved hjelp av steril tang. Plasser orgelet på en halv av en steril 6 cm Petri parabol og vask orgelet kort med PBS å fjerne overflødig blod. Overfør orgelet til andre halvdel av Petri parabolen, fjerne overflødig PBS.
- Hakke vevet ved hjelp av to sterile skalpeller. De resterende vev fragmenter bør ikke være større enn 1-2 mm.
- Overfør hakket vev til en ny steril 15 mL rør med steril slikkepott og tilsett 2 mL 0,25% Trypsin oppløsning. Plasser røret inn i en cellekultur inkubator ved 37 ° c i 5 min.
- Vortex røret forsiktig (circa 1400/min) for 10 s.
- Opphøre det Trypsin reaksjonen under cellen kulturen Hood av tilføyer 4 mL FCS-inneholder cellen kulturen medium (Dulbecco ' modifisert ørn medium (DMEM), e.g.).
- Tilsett 250 μL av kollagenase blande løsning på hvert rør som inneholder hjerte-eller lunge vev og 100 μL for nyre eller lever, henholdsvis.
- Plasser rørene i et ultralyd vannbad (37 ° c) og Aktiver ultralyds sonicator i 10 min.
Merk: den ultrasoniske vannbad som brukes i denne protokollen har en driftsfrekvens på 35 kHz og en maksimal effekt på 320 W. - Vortex rørene forsiktig (circa 1400/min) for 10 s.
- Plasser rørene igjen i den ultrasoniske vannbad i 10 min.
- Vortex forsiktig (circa 1400/min) for 10 s.
- Desinfisere rørene med 70% etanol og overføre dem under den sterile cellekultur panseret.
- Filtrer løsningen med et 40 μm-netting inn i et nytt sterilt 15 mL rør.
- Sentrifuger røret ved 500 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspend pellet i 1 mL friskt medium.
- Overfør cellene til et egnet cellekultur fartøy (f.eks. 6-brønn plate) og plasser fartøyet i cellekultur inkubator over natten ved 37 ° c og 5% CO2.
- Neste dag, fjerne mediet, vaske 3 ganger med PBS, deretter legge friskt medium (den ekstra volum avhenger av celle kulturen fartøyet av valget, 2 mL per brønn av en 6-brønn plate etc.).
- Endre mediet annenhver dag.
Merk: fibroblaster kan deles etter å ha nådd optiske samløpet av 90% (vanligvis etter 5-7 dager).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til denne protokollen til å isolere voksne fibroblaster fra solid murine vev ble demonstrert. Levedyktige fibroblaster ble innhentet som kan brukes til senere eksperimenter som immunofluorescence farging eller spredning eksperimenter (figur 2D-F, figur 5A).
Voksen fibroblaster er flate spindel-formede celler med flere cellulære prosesser som vanligvis vokser i monolagere12,18. De oppnådde resultatene reflekterer disse morfologiske kjennetegnene og indikerer distinkte morfologiske forskjeller i Fibroblast populasjoner fra ulike organer (figur 2). Renal fibroblaster var spesielt mindre og vokste ved høyere tetthet enn hjerte-, lunge-eller lever fibroblaster (figur 2).
Den øvre panel av Figur 3 skildrer prosessen med celle modning og spredning via eksempel på CARDIAC fibroblaster etter isolasjon. Cellene viste høy spredning priser nådde optiske samløpet av > 90% etter 6 ± 1 dager. På dette nivået av samløpet fibroblaster stoppe å spre18 og cellene kan deles, ved hjelp 0,25% Trypsin, og overføres til større cellekulturflasker for påfølgende kultur eller eksperimenter.
Under basalcelle kultur forhold, Fibroblast kulturer består av fibroblaster og en mindre andel av myofibroblasts19,20. Det er flere aksepterte markører for å identifisere fibroblaster. DDR2 og vimentin uttrykk er vanlige Fibroblast markører og uttrykk for organisert αSMA microfilaments indikerer myofibroblast differensiering7,9. En representativ bilde av en differensiert myofibroblast med karakteristiske αSMA microfilaments og representative oversikt bilder for αSMA filament overflod av hjerte, nyre, lever og lunge er presentert i Figur 4. Mens bare ca 20-30% av de isolerte og senere kultivert celler uttrykt ryddig arrangert αSMA microfilaments (indikerer myofibroblast differensiering), alle cellene (≈ 99%) var positive for vimentin og DDR2 (Figur 3, nedre panel).
Figur 1 . Oversikt over Fibroblast isolasjons prosedyre. Etter at organer av interesse har blitt fjernet fra musa, de er hakket under en cellekultur hette ved hjelp av sterile skalpeller. Deretter blir hakket vev overført til 0,25% Trypsin løsning for 5 min. Etter den første fordøyelsen, kollagenase blanding løsning tilsettes og rørene er overført til et ultralydbad i 20 min ved 37 ° c. Etter filtrering og sentrifugering, kan cellen pellet overføres til en passende cellekultur parabolen. Etter minst 8 h å feste, blir kulturene vasket tre ganger med PBS å fjerne erytrocytter og rusk. Endelig, friskt medium (DMEM, 15% FCS, 1% penicillin/Streptomycin) er lagt til, og cellene kan være kultivert. Bilder av SERVIER smart medisinsk kunst har blitt brukt til å lage figuren (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Primær murine fibroblaster isolert fra solide organer etter 7 dager med primær kultur. A) CARDIAC fibroblaster. B) lunge fibroblaster. C) renal fibroblaster. D) lever fibroblaster. Cellene ble kultivert i DMEM (15% FCS, 1% penicillin/Streptomycin (PS)) ved 37 ° c og 5% CO2. 10x forstørrelse og 5.6 x optisk kamera zoom ble brukt til å få disse bildene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Identifikasjon av fibroblaster i kultur. A-C) vedlegg og vekst av CARDIAC fibroblaster for 4 dager. Etter vask og medium endre vedlagte fibroblaster utvikle sin karakteristiske form og sprer seg. Cellene ble kultivert i DMEM (15% FCS, 1% PS). D-F) Immunofluorescence farging bilder av primære fibroblaster etter 7 dager med kultur for Fibroblast markører αSMA (D), DDR2 (E) og vimentin (F). Kjernene ble farget med DAPI (blå). Primære antistoffer (Sigma-Aldrich) ble fortynnet 1:200 i 1% BSA-løsning (αSMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-fluor 488 ble brukt som sekundær antistoff. Skalaen barer lik angitt lengder ovenfor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Representative immunocytochemical bilder for αSMA microfilament overflod. A) en typisk myofibroblast vises (forstørrelse: 20x). B – E) Representative αSMA Oversiktsbilder for hjerte (B), nyre (C), leveren (D) og lunge (E) (forstørrelse: 10x). De hvite sirklene indikerer representative celler som ble betraktet som myofibroblasts. Kjernene ble farget med DAPI (blå). Primær antistoff ble fortynnet 1:200 i 1% BSA-oppløsning (αSMA: A5228). Alexa-fluor 488 ble brukt som sekundær antistoff. Skalaen barer lik angitt lengder ovenfor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Spredning utbredelsen av murine fibroblaster og in vitro senescence utvikling. A) sprednings raten for murine fibroblaster fastsettes etter 7 og 14 dager med kultur. Celler ble høstet og telles med en Buerker kammer på de respektive tidspunkt poeng. Resultatene representerer celle tellingen i 1 mL medium. B) senescence bestemmes av tilstedeværelsen av β-galaktosidase (beiset grønn). Senescent celler indikeres med hvite sirkler. Skalaen bar tilsvarer 50 μm. resultatene er presentert som gjennomsnittet ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med udødeliggjort Fibroblast cellelinjer, har primære fibroblaster flere fordeler. De kan isoleres kostnadseffektivt i høy kvalitet og kvantitet. Videre primære kulturer tilbyr muligheten til å studere celler fra flere individer, noe som øker påliteligheten av oppnådde resultater og reduserer sannsynligheten for bare å studere cellekultur gjenstander. Kontinuerlig generering av nye primære kulturer forhindrer genetiske forandringer som ofte oppstår etter gjentatt passaging21. I tillegg, cellular senescence22,23 eller økt myofibroblast differensiering forekommer oftere i kulturer ved høye passasjer20. Ved lave passasjer (2-3), var basal myofibroblast telle ca 20-30% (data ikke vist) og bare 2,89% av cellene ble betraktet som senescent basert på β-galaktosidase uttrykk (figur 5B). Av denne grunn er det anbefalt å passasje kulturene opp til maksimalt 5 ganger og erstatte dem heretter. Dette garanterer pålitelige og repliserbar resultater gjennom eksperimentene. Optimal Fibroblast vekst og spredning ble oppnådd med cellekultur medium som inneholder 15% FCS i stedet for 10%. Dette sikret en robust Fibroblast yield og god celle levedyktighet etter den første passasjen.
Denne protokollen utfyller eksisterende teknikker i form av fart og vanskelighetsgrad. Utvekst teknikker krever mellom 10-21 dager, avhengig av arten og vev, inntil tilstrekkelige mengder av fibroblaster kan høstes12,24. Langendorff på den annen side er rask (< 5 h), men krever mer manuell dyktighet og trening. Sammenlignet med utvekst metoder12,24 eller Fibroblast isolering fra supernatanten av Langendorff-16, tilbyr denne protokollen spesielt nybegynnere muligheten til å arbeide med primær celler etter en svært kort treningsperiode (2-3 isolasjoner) uten behov for høy mekanisk dyktighet eller teknisk innsats. Forurensning med ikke-Fibroblast celler (f. eks, endothelial celler) var ubetydelig fordi kultivert fibroblaster raskt overgrow andre celletyper i kulturer på grunn av deres høyere spredning priser25. I tillegg gir denne protokollen klare instruksjoner som bidrar til å unngå bakteriell forurensning, som er et stort problem å arbeide med primære murine celler. Her ble det identifisert to kritiske trinn for å unngå forurensning. Den første er organ fjerning. Gnager pels bakterier kan enkelt overføres til organene hvis hanskene og Kirurgiske instrumenter ikke endres etter å ha fjernet pelsen og huden. Det andre kritiske trinnet er selve isolasjons prosessen. Cellene må fjernes mekanisk fra deres vev nisje. I forbindelse med Langendorff er dette realisert ved en kontinuerlig strøm av væske. Andre teknikker bruker magnetiske røring barer eller risting metoder. Spesielt utskifting av magnetiske røring barer ved ultralydbølger reduserer risikoen for bakteriell forurensning ved å unngå fysisk kontakt mellom stirrer og vevet lysat. En ekstra fordel med ultralyd vannbad er jevn fordeling av varme til rørene, og dermed gir optimal arbeidstemperatur for enzymer.
I konklusjonen, gir denne protokollen en rask, pålitelig og repliserbar metode for å isolere primære fibroblaster som er ideell for både avanserte og tidlig stadium forskere. Denne metoden er et nyttig tillegg til det eksisterende spekteret av teknikker som kan bidra til en bedre forståelse av Fibroblast funksjon i helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Vi takker MS Romy Kempe og fru Annett Opitz for ekspert teknisk støtte. Vi takker også Mr. Bjoern Binnewerg for IT-støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra a) den Förderkreis Dresdner Herz-kreislauf-tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für frauen", det medisinske fakultet Carl Gustav Carus Dresden og c) else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) det medisinske fakultet Carl Gustav Carus Dresden. Vi er takknemlige for finansiering og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
References
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
