Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

بالموجات فوق الصوتية زيادة الابتدائية الكبار العزلة الليفية

doi: 10.3791/59858 Published: July 29, 2019

Summary

نقدم بروتوكولًا لعزل الخلايا الليفية للبالغين في المرحلة الابتدائية بطريقة سهلة وسريعة وموثوق بها، يمكن تنفيذها من قبل المبتدئين (على سبيل المثال، الطلاب). يجمع الإجراء بين هضم الأنسجة الأنزيمية والهياج الميكانيكي مع الموجات فوق الصوتية للحصول على الخلايا الليفية الأولية. ويمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع متطلبات تجريبية محددة (مثل الأنسجة البشرية).

Abstract

أصبحت الخلايا الليفية الأولية للبالغين أداة هامة لدراسة التليف والتفاعلات الليفية والالتهاب في جميع أنسجة الجسم. وبما أن الخلايا الليفية الأولية لا يمكن أن تقسم إلى أجل غير مسمى بسبب تمايز myofibroblast أو تحريض الحساسية، يجب إنشاء ثقافات جديدة بانتظام. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات التي يجب التغلب عليها خلال عمليات وضع بروتوكول عزل موثوق بها والعزلة الليفية الأولية نفسها: درجة صعوبة الأسلوب (وخاصة للمبتدئين)، وخطر التلوث البكتيري، و الوقت المطلوب حتى يمكن استخدام الخلايا الليفية الأولية للتجارب، ونوعية الخلايا اللاحقة وصلاحيتها. في هذه الدراسة، يتم توفير بروتوكول سريع وموثوق به وسهل التعلم لعزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية للبالغين من قلب الماوس والرئة والكبد والكلى التي تجمع بين الهضم الأنزيمي والهياج بالموجات فوق الصوتية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخلايا الليفية هي خلايا مسطحة على شكل مغزل مع عمليات ستيلات متعددة وreticulum endoplasmic واسعة النطاق1،2. متوسط قياس الليفية 30 - 100 ميكرومتر ولها مدىالحياة من 57 ± 3 أيام 1،3. متوسط مدة دورة الخلية من الخلايا الليفية البشرية تتراوح بين 16 - 48 ساعة اعتمادا على ظروف الثقافة4. هناك أدلة على أن القدرة المستنسخة والجودة الوظيفية للفليائيات الأولية المستزرعة ترتبط سلبا مع سن المانحين، مما يشير إلى أنه ينبغي تفضيل المانحين الأصغر سنا (الحيوانات أو المرضى) إذا كان ذلك ممكنا5و6 .

تشكل الخلايا الليفية نوع الخلية السائد لمعظم أنسجة الجسم الثدييات. على الرغم من وجودها في كل مكان، وتحديد الجزيئية من الخلايا الليفية لا يزال تحديا7. تنتقل الخلايا الليفية إلى تطوير الأنسجة والأعضاء من مصادر مختلفة أثناء النمو الجنيني8. لهذا السبب، هناك عدد كبير من البروتينات علامة التي يمكن العثور عليها في الخلايا الليفية في حين أن البروتينات علامة فريدة من نوعها، والتي هي موجودة في كل السكان الأورام الليفية والحصرية للفليّة، لا تزال مفقودة. وهكذا، عادة ما تستخدم أنماط التعبير من عدة علامات معترف بها لتحديد الخلايا الليفية. من بين العلامات الأكثر شهرة هي فيمنتين، بروتين سطح الليفية البشرية (hFSP)، مستقبلات المجال المديسكوين 2 (DDR2) وألفا الأكتين العضلات الملساء (αSMA).

الخلايا الليفية هي المصفوفة الرئيسية خارج الخلية (ECM) المنتجة لنوع الخلية. وبالتالي، فإن الخلايا الليفية تحافظ علىبنية الأنسجة المنظمة وتوفر الدعم الميكانيكي للخلايا المجاورة 1. التوازن بين توليف إدارة المحتوى في المؤسسة والتدهور هو عملية منظمة تنظيماجيدا. التحولات نحو التوليف علامة على بداية الترسيب ECM المفرطالذي، إذا لم يتم إنهاؤه، يؤدي إلى التليف. يتم التوسط في التليف من قبل myofibroblasts، والتي تنشأ من الخلايا الليفية المنشطة التي تمر التغيرات الجزيئية والفيلونمطية. إحدى السمات المميزة للمقلبين هو تعزيز إفراز ECM والسيتوكينات والتعبير عن خيوط αSMA الدقيقة مرتبة بشكل منظم9.

وقد تم الخلايا الليفية الأولية في دائرة الضوء على البحوث الأخيرة التي تركز على التليف, التهاب الأنسجة والتفاعلات الليفية السرطان الخلية10,11. ومع ذلك، لدراسة فعالة خصائص الخلايا الليفية في الصحة والمرض، فمن الضروري لعزل الخلايا الليفية الأولية القابلة للحياة الكبار على أساس منتظم. هناك العديد من الطرق المتاحة لعزل الخلايا الليفية12،13،14. الطرق الرئيسية الثلاثة لعزل الليفية هي النمو من قطع الأنسجة12، هضم الأنسجة الأنزيمية15، والتسريب الأنزيمي للأعضاء جوفاء9،13،16. ميزة النمو هو عملية عزل لطيف دون تدهور الخلايا الأنزيمية. ومن ناحية أخرى، عادة ما تتطلب ثقافات النمو فترات ثقافية مطولة حتى يمكن استخدام الخلايا للتجارب. الهضم الأنزيمي الشائع سريع ولكنه يحمل خطر التلوث مع أنواع الخلايا الأخرى (على سبيل المثال، الخلايا البطانية) أو البكتيريا في عملية التحريض، وهو أمر ضروري لحل الأنسجة ميكانيكيا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون مفصلة وتتطلب وقتا ومهارة للتعلم.

وفيما يتعلق بأهمية الخلايا الليفية الأولية في البحوث، لا تزال هناك حاجة إلى تحسين نُهج عزل الخلايا القائمة من حيث السرعة والبساطة والموثوقية. هنا، يتم توفير طريقة جديدة العزل الأورام الليفية الأنزيمية المستندة إلى الموجات فوق الصوتية تقديم خلايا عالية الجودة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتبع البروتوكول التالي المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات من جامعة دريسدن التقنية، ألمانيا (رقم الملف: T 2014/4) وكذلك المبادئ التوجيهية المقبولة دوليا لرعاية الحيوانات (FELASA)17. يصور الشكل 1 عملية عزل الخلية.

1. إعداد الإعداد والمواد ووسائل الإعلام

  1. إعداد ثقافة الخلية المتوسطة، حل PBS، كولاجيناز مزيج الأوراق المالية الحل (إعادة تشكيل 50 ملغ من مزيج الكولاجين الليوفيل في 12 مل من المياه المعقمة فائقة النقية)، و 0.25٪ تريبسين الحل.
  2. الاحماء المتوسطة، وPBS والحل التربسين إلى 37 درجة مئوية.
  3. سخن حمام الماء بالموجات فوق الصوتية إلى 37 درجة مئوية.
  4. تطهير ملقط، ملعقة الفولاذ المقاوم للصدأ، مشرط (2X مشرط لكل جهاز) و2 أكواب زجاجية مع الإيثانول 70٪ ووضع هذه المواد تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية.
  5. ملء كوب واحد مع الإيثانول 70٪ والآخر مع الماء المعقمة أو حل PBS. هذه الأكواب مطلوبة لتطهير وغسل الصك بعد كل موكب الجهاز.
  6. وضع أنابيب بلاستيكية معقمة 15 مل تحتوي على PBS الباردة على الجليد الرطب. يعتمد عدد الأنابيب على عدد الأعضاء التي تريد عزل الخلايا الليفية منها.

2. تشريح الماوس وإزالة الأعضاء

  1. ارتداء اثنين من أزواج من القفازات واحدة فوق الأخرى، لذلك يمكن إزالة الزوج الأول بمجرد تشريح الحيوان.
    ملاحظة: يمنع هذا الإجراء البكتيريا من فرو الحيوان وجلده من الانتشار على الأعضاء.
  2. قتل الفأر (على سبيل المثال، خلع عنق الرحم) ودبوس الذبيحة مع الإبر إلى كل طرف إلى وسادة البوليسترين.
  3. تطهير الذبيحة الماوس باستخدام رذاذ الإيثانول 70٪. تأكد من أن الفراء غارقة في الإيثانول حتى الشعر لن دوامة.
  4. قطع الفراء الحق فوق الجهاز البولي التناسلي باستخدام ملقط الجراحية ومقص الصادم. قطع الجلد جنبا إلى جنب مع خط الوسط من نقطة الشق الأولي إلى الرقبة (3 - 4 سم) وإضافة قطع الإغاثة في الأطراف.
    تحذير: لا تثقب الطبقة العضلية في هذه الخطوة لتجنب التلوث البكتيري!
  5. دبوس الجلد إلى وسادة رغوة البوليسترين للوصول الأمثل إلى العضلات التي تغطي تجويف البطن.
  6. تطهير عضلات البطن مرتين باستخدام الإيثانول 70٪. دع الإيثانول يجف قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
  7. إزالة الزوج الأول من القفازات. استخدام مجموعة جديدة، معقمة من ملقط ومقص.
  8. فتح تجويف البطن والصدر عن طريق قطع الطبقة العضلية مع مقص الجراحية لإزالة بلطف الأعضاء المختارة. لذلك، عقد الجهاز بلطف مع ملقط الجراحية (لا تخترق الجهاز، واستخدام الحد الأدنى من الضغط) وقطع الأوعية الدموية توريد بالقرب من نقطة الدخول في الجهاز مع مقص.
  9. وضع الأعضاء في أنابيب معقمة تحتوي على PBS الباردة. أغلق الأنابيب بإحكام. ضع الأنابيب على الجليد الرطب حتى تستمر مع الخطوة 3.1.

3. الأنسجة الفرم والهضم واستخراج الخلايا

  1. نقل الأنابيب تحت غطاء السيارة ثقافة الخلية المعقمة.
    تحذير: ارتداء زوج جديد من القفازات وتطهير الأنابيب مع الإيثانول 70٪ قبل نقلها تحت غطاء محرك السيارة!
  2. إخراج الجهاز من أنبوب 15 مل باستخدام ملقط معقمة. ضع الجهاز على نصف طبق بيتري معقم 6 سم واغسل الجهاز لفترة وجيزة مع PBS لإزالة الدم الزائد. نقل الجهاز إلى النصف الثاني من طبق بيتري، وإزالة PBS الزائدة.
  3. يُمْكِنُ أَنْ يَكُونَ يَستعملَ مشرطان معقمة. يجب ألا تكون شظايا الأنسجة المتبقية أكبر من 1 - 2 مم.
  4. نقل الأنسجة المفرومة في أنبوب جديد معقم 15 مل باستخدام ملعقة معقمة وإضافة 2 مل من 0.25٪ محلول التربسين. ضع الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. دوامة الأنبوب بلطف (حوالي 1400/min) لمدة 10 ق.
  6. وقف رد فعل التربسين تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية عن طريق إضافة 4 مل FCS التي تحتوي على خلية الثقافة المتوسطة (دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM)، على سبيل المثال).
  7. إضافة 250 ميكرولتر من محلول مزيج الكولاجين إلى كل أنبوب يحتوي على أنسجة القلب أو الرئة و 100 ميكرولتر للكلى أو الكبد، على التوالي.
  8. وضع الأنابيب في حمام المياه بالموجات فوق الصوتية (37 درجة مئوية) وتفعيل sonicator بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: حمام المياه بالموجات فوق الصوتية المستخدمة في هذا البروتوكول لديه تردد التشغيل من 35 كيلوهرتز وقوة قصوى من 320 W.
  9. دوامة الأنابيب بلطف (حوالي 1400/min) لمدة 10 ق.
  10. وضع الأنابيب مرة أخرى في حمام المياه بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقيقة.
  11. دوامة بلطف (حوالي 1400/min) لمدة 10 ق.
  12. تطهير الأنابيب مع الإيثانول 70٪ ونقلها تحت غطاء السيارة ثقافة الخلية المعقمة.
  13. قم بتصفية الحل باستخدام شبكة بـ 40 درجة في أنبوب جديد معقم بـ 15 مل.
  14. الطرد المركزي الأنبوب في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
  15. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من المتوسطة الطازجة.
  16. نقل الخلايا إلى وعاء ثقافة الخلية مناسبة (على سبيل المثال، لوحة 6 جيدا) ووضع السفينة في حاضنة ثقافةالخلية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  17. في اليوم التالي، وإزالة المتوسطة، وغسل 3 مرات مع PBS، ثم إضافة المتوسطة الطازجة (حجم المضافة يعتمد على السفينة ثقافة الخلية من الاختيار، 2 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا الخ).
  18. تغيير المتوسط كل يومين.
    ملاحظة: يمكن تقسيم الخلايا الليفية بعد الوصول إلى التقاء بصري من 90٪ (عادة بعد 5-7 أيام).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد ثبت قدرة هذا البروتوكول على عزل الخلايا الليفية للبالغين من أنسجة المورين الصلبة. تم الحصول على الخلايا الليفية القابلة للحياة التي يمكن استخدامها للتجارب اللاحقة مثل تلطيخ المناعة أو تجارب الانتشار (الشكل2D-F، الشكل 5A).

الخلايا الليفية الكبار هي خلايا مسطحة على شكل المغزل مع عمليات خلوية متعددة التي تنمو عادة في أحادية الطبقات12،18. وتعكس النتائج التي تم الحصول عليها هذه السمات المورفولوجية وتشيرإلى اختلافات مورفولوجية متميزة في مجموعات الخلايا الليفية من أجهزة مختلفة (الشكل 2). وكانت الخلايا الليفية الكلوية أصغر بشكل خاص ونمت في كثافات أعلىمن الأورام الليفية القلبية أو الرئوية أو الكبدية (الشكل 2).

يصور الجزء العلوي من الشكل 3 عملية نضج الخلايا وانتشارها من خلال مثال الخلايا الليفية القلبية بعد العزلة. أظهرت الخلايا معدلات انتشار عالية تصل إلى التقاء بصري من > 90٪ بعد 6 ± 1 أيام. في هذا المستوى من التقاء الخلايا الليفية وقف لتكاثر18 ويمكن تقسيم الخلايا، وذلك باستخدام 0.25٪ التربسين، ونقلها إلى قوارير ثقافة الخلية أكبر للثقافة اللاحقة أو التجارب.

في ظل ظروف ثقافة الخلايا القاعدية، تتكون الثقافات الليفية من الخلايا الليفية ونسبة أصغر من myofibroblasts19،20. هناك العديد من العلامات المقبولة لتحديد الخلايا الليفية. DDR2 والتعبير vimentin هي علامات الأورام الليفية الشائعة والتعبير عن خيوط αSMA الدقيقة المنظمة يشير إلى التمايز myofibroblast7،9. يتم عرض صورة تمثيلية لـ myofibroblast المتمايزة مع خيوط microfilaments وصورة عامة تمثيلية لوفرة خيوط αSMA في القلب والكلى والكبد والرئة في الشكل 4. في حين أن حوالي 20 - 30٪ فقط من الخلايا المعزولة والمستزرعة في وقت لاحق أعرب عن ترتيب منظم αSMA microfilaments (مما يدل على تمايز myofibroblast)، وجميع الخلايا (99٪) كانت إيجابية لvimentin وDDR2 (الشكللوحة أقل).

Figure 1
الشكل 1 . نظرة عامة على إجراء العزل الليفي. بعد إزالة أعضاء الاهتمام من الماوس ، يتم فرمها تحت غطاء محرك السيارة باستخدام مشرط معقمة. في وقت لاحق، يتم نقل الأنسجة المفرومة إلى 0.25٪ محلول التربسين لمدة 5 دقائق. بعد الهضم الأول، يتم إضافة محلول مزيج الكولاجين ويتم نقل الأنابيب إلى حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الترشيح والطرد المركزي، يمكن نقل بيليه الخلية إلى طبق ثقافة الخلية مناسبة. بعد ما لا يقل عن 8 ساعة لنعلق، يتم غسل الثقافات ثلاث مرات مع PBS لإزالة كريات الدم الحمراء والحطام. وأخيرا، يتم إضافة المتوسطة الطازجة (DMEM، 15٪ FCS، 1٪ البنسلين / العقدية) ويمكن أن تكون المستزرعة الخلايا. وقد استخدمت صور الفن الطبي الذكي Servier لخلق هذا الرقم (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 . الخلايا الليفية الأولية المورين معزولة عن الأعضاء الصلبة بعد 7 أيام من الثقافة الأولية. أ) الخلايا الليفية القلبية. ب) الخلايا الليفية الرئوية. ج) الخلايا الليفية الكلوية. د) الخلايا الليفية الكبدية. تم زراعة الخلايا في DMEM (15٪ FCS، 1٪ البنسلين / العقدية (PS)) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تم استخدام التكبير 10x والتكبير الكاميرا البصرية 5.6x للحصول على هذه الصور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 . تحديد الخلايا الليفية في الثقافة. A - C) مرفق ونمو الخلايا الليفية القلبية لمدة 4 أيام. بعد الغسيل والتغيير المتوسط الليفية المرفقة تطوير شكلها المميز وتنتشر. تم زراعة الخلايا في DMEM (15٪ FCS، 1٪ PS). D - F) صورة تلطيخ الفلورة المناعية للفليّات الأولية بعد 7 أيام من الثقافة لعلامات الخلايا الليفية αSMA (D) و DDR2 (E) وفيمنتين (F). كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). تم تخفيف الأجسام المضادة الأولية (سيغما ألدريتش) 1:200 في 1٪ محلول BSA (αSMA: A5228; DDR2: HPA070112; [فيمنتين]: [ف5255]). تم استخدام أليكسا فلور 488 كجسم مضاد ثانوي. أشرطة مقياس يساوي أطوال المشار إليها أعلاه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 . الصور المناعية الكيميائية التمثيلية لوفرة الخيوط الدقيقة αSMA. أ) يتم عرض myofibroblast نموذجي (التكبير: 20X). باء - هاء) الصور نظرة عامة αSMA التمثيلية للقلب (B) والكلى (C) والكبد (D) والرئة (E) (التكبير: 10x). تشير الدوائر البيضاء إلى الخلايا التمثيلية التي كانت تعتبر مبيفيبروبلاستس. كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). تم تخفيف الأجسام المضادة الأولية 1:200 في 1٪ محلول BSA (αSMA: A5228). تم استخدام أليكسا فلور 488 كجسم مضاد ثانوي. أشرطة مقياس يساوي أطوال المشار إليها أعلاه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 . معدلات انتشار الخلايا الليفية المورين والتنمية في المختبر الحساسية. أ) معدل انتشار الخلايا الليفية المورين التي تحدد بعد 7 و 14 يوما من الثقافة. حصدت خلايا كان وعدّت مع [بويركر] غرفة في ال [تيم بوينت] شخصيّة. تمثل النتائج عدد الخلايا في 1 مل من المتوسط. ب) يتم تحديد الحساسية من خلال وجود β-galactosidase (الأخضر الملون). يشار إلى الخلايا السينسنت مع الدوائر البيضاء. شريط المقياس يساوي 50 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بالمقارنة مع خطوط الخلايا الليفية الخالدة، تقدم الخلايا الليفية الأولية العديد من المزايا. ويمكن عزلها من حيث التكلفة بشكل فعال في نوعية عالية وكمية. وعلاوة على ذلك، توفر الثقافات الأولية إمكانية دراسة الخلايا من أفراد متعددين، مما يزيد من موثوقية النتائج التي تم الحصول عليها ويقلل من احتمال مجرد دراسة التحف ثقافة الخلايا. توليد مستمر من الثقافات الأولية الجديدة يمنع التغيرات الوراثية التي تحدث عادة بعد تمرير المتكررة21. بالإضافة إلى ذلك، الحساسية الخلوية22،23 أو زيادة التمايز myofibroblast تحدث أكثر تواترا في الثقافات في الممرات العالية20. في الممرات المنخفضة (2-3)، كان عدد myofibroblast القاعدية حوالي 20-30٪ (البيانات غير المعروضة) وفقط 2.89٪ من الخلايا كانت تعتبر مبسات على أساس التعبير بيتا-galactosidase (الشكل5B). ولهذا السبب، يوصى بالمرور على الثقافات حتى 5 مرات قصوى واستبدالها في الآخرة. وهذا يضمن نتائج موثوقة وقابلة للتكرار طوال التجارب. تم الحصول على النمو الأمثل للفليبلاف وانتشار مع خلية الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 15٪ FCS بدلا من 10٪. وقد ضمن ذلك وجود عائد قوي للفليوبلاف وجدوى جيدة للخلايا بعد المرور الأول.

ويكمل هذا البروتوكول التقنيات القائمة من حيث السرعة ودرجة الصعوبة. تقنيات النمو تتطلب ما بين 10-21 يوما، اعتمادا على الأنواع والأنسجة، حتى يمكن حصاد كميات كافية من الخلايا الليفية12،24. Langendorff-perfusion من ناحية أخرى سريع (<5 h) ولكن يتطلب المزيد من المهارة اليدوية والتدريب. بالمقارنة مع طرق النمو12،24 أو العزلة الليفية من supernatant من Langendorff-التسريب16، وهذا البروتوكول يوفر المبتدئين خاصة فرصة للعمل مع الخلايا الأولية بعد قصيرة جدا فترة التدريب (2-3 العزلة) دون الحاجة إلى مهارة ميكانيكية عالية أو الجهد التقني. كان التلوث بالخلايا غير الليفية (مثل الخلايا البطانية) لا يكاد يذكر لأن الخلايا الليفية المستزرعة تنمو بسرعة فوق أنواع الخلايا الأخرى في الثقافات بسبب ارتفاع معدلات انتشارها25. بالإضافة إلى ذلك، يعطي هذا البروتوكول تعليمات واضحة تساعد على تجنب التلوث البكتيري، وهي مشكلة رئيسية واحدة تعمل مع خلايا المورين الأولية. وهنا، تم تحديد خطوتين حاسمتين لتجنب التلوث. الأول هو إزالة الأعضاء. يمكن نقل بكتيريا الفراء القوارض بسهولة إلى الأعضاء إذا لم يتم تغيير القفازات والأدوات الجراحية بعد إزالة الفراء والجلد. والخطوة الحاسمة الثانية هي عملية العزل نفسها. الخلايا يجب إزالتها ميكانيكيا من محراب الأنسجة الخاصة بهم. في السياق من [لنغندورفّ-برفيوجن] حقّقت هذا بتيار مستمرّة سائلة. تقنيات أخرى استخدام أشرطة التحريك المغناطيسي أو أساليب الهز. وعلى وجه الخصوص، فإن استبدال قضبان التحريك المغناطيسي بالموجات فوق الصوتية يقلل من خطر التلوث البكتيري عن طريق تجنب الاتصال الجسدي بين النمام والأنسجة. ميزة إضافية من حمام المياه بالموجات فوق الصوتية هو توزيع حتى الدفء إلى الأنابيب، وبالتالي توفير درجات حرارة العمل الأمثل للإنزيمات.

وفي الختام، يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وموثوقة وقابلة للتكرار لعزل الخلايا الليفية الأولية التي تعتبر مثالية للباحثين المتقدمين والباحثين في المراحل المبكرة على حد سواء. هذه الطريقة هي إضافة مفيدة إلى الطيف الحالي من التقنيات التي يمكن أن تسهم في فهم أفضل لوظيفة الخلايا الليفية في الصحة والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

ونشكر السيدة رومي كيمب والسيدة أنيت أوبيتز على الدعم التقني الخبير. كما نشكر السيد بيورن بينينغ على دعمه في تكنولوجيا المعلومات. تم دعم هذا العمل بمنح من (أ) كلية الطب كارل غوستاف غوستاف (كاروس دريسدن) ونحن ممتنون للتمويل والدعم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 mL
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 376-379 (2011).
  2. Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14, (8), 484-491 (2017).
  3. Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4, (2), 159-166 (1975).
  4. Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62, (1), 1-12 (1992).
  5. Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516, (1), 71-74 (2002).
  6. Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38, (4), 1063-1074 (2016).
  7. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  8. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  9. Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. 445098 (2018).
  10. Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102, (2), 258-269 (2014).
  11. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16, (9), 582-598 (2016).
  12. Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4, (2), (2016).
  13. Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
  14. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96, (5), 535-539 (2018).
  15. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40, (8-9), 268-277 (2004).
  16. El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80, (3), 396-406 (2008).
  17. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51, (3), 311-321 (2012).
  18. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
  19. Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (9), 4219-4223 (1996).
  20. Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 389-399 (2011).
  21. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
  22. Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6, (12), 2853-2868 (2008).
  23. Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21, (12), 1424-1435 (2015).
  24. Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47, (2), 83-88 (2011).
  25. Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185, (2), 519-528 (1989).
بالموجات فوق الصوتية زيادة الابتدائية الكبار العزلة الليفية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).More

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter