Summary
我们提出了一种方案,以简单、快速和可靠的方式分离主要成人成纤维细胞,由初学者(例如学生)执行。该程序结合酶组织消化和机械搅拌与超声波获得原成纤维细胞。该协议可以很容易地适应特定的实验要求(例如,人体组织)。
Abstract
原发性成人成纤维细胞已成为研究所有身体组织纤维化、成纤维细胞相互作用和炎症的重要工具。由于原纤维细胞不能由于肌纤维细胞分化或衰老诱导而无限期分裂,因此必须定期建立新的培养物。然而,在制定可靠的隔离协议和初级成纤维细胞隔离过程中,有几个障碍需要克服:该方法的难度程度(尤其是初学者),细菌污染的风险,所需时间,直到原纤维细胞可用于实验,以及随后的细胞质量和生存能力。在这项研究中,提供了一种快速、可靠和易于学习的协议,从小鼠心脏、肺、肝脏和肾脏中分离和培养原发性成人成纤维细胞,结合酶消化和超声波搅拌。
Introduction
纤维细胞是扁平的,主轴状细胞,具有多个硬质处理和广泛的粗糙内质视网膜1,2。平均成纤维细胞测量30-100μm,寿命为57~3天1,3。人类成纤维细胞的平均细胞周期持续时间范围为16-48小时,取决于培养条件4。有证据表明,培养的原纤维细胞的复制能力和功能质量与捐赠年龄呈负相关,这表明,如果可能的话,应优先考虑较年轻的捐赠者(动物或患者).
纤维细胞是大多数哺乳动物身体组织的主要细胞类型。尽管成纤维细胞无处不在,但成纤维细胞的分子识别仍然是一个挑战。在胚胎发育期间,纤维细胞从不同来源迁移到发育中的组织和器官8。因此,在成纤维细胞中可以找到过多的标记蛋白,而独特的标记蛋白,存在于每个成纤维细胞种群中,并且独有成纤维细胞,仍然缺失。因此,几个识别标记的表达模式通常用于识别成纤维细胞。其中最知名的标记物包括维他命素、人纤维细胞表面蛋白(hFSP)、迪斯科丁域受体2(DDR2)和α平滑肌活动素(αSMA)。
纤维细胞是主要的细胞外基质(ECM)产生细胞类型。因此,成纤维细胞维持有序的组织结构,并为邻近细胞1提供机械支持。ECM 合成和降解之间的平衡是一个调节良好的过程。转向合成标志着过度ECM沉积的开始,如果不终止,会导致纤维化。纤维化由肌纤维细胞介导,肌纤维细胞起源于经过分子和表型变化的活化成纤维细胞。肌纤维细胞的一个标志是增强ECM和细胞因子的分泌和有序排列的表达[SMA微丝9。
原纤维细胞一直是最近研究的焦点,重点是纤维化,组织炎症和成纤维细胞-癌症细胞相互作用10,11。然而,为了有效地研究成纤维细胞在健康和疾病的特性,有必要定期分离可行的原发成人成纤维细胞。有几种方法可以分离成纤维细胞12,13,14。成纤维细胞分离的三种主要方法是从组织块12、酶组织消化15和中空器官的酶灌注9、13、16中生长。生长的优点是温和的隔离过程,没有酶细胞降解。另一方面,生长外培养物通常需要较长的培养期,直到细胞可用于实验。常见的酶消化是快速的,但承担与其他细胞类型(例如,内皮细胞)或细菌在搅拌过程中的污染风险,这是机械溶解组织所必需的。此外,这些方法往往是复杂的,需要时间和技能来学习。
关于原成纤维细胞在研究中的重要性,仍然需要在快速性、简单性和可靠性方面优化现有的细胞隔离方法。这里提供了一种提供高质量细胞的新型超声波酶成纤维细胞分离方法。
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Protocol
以下协议遵循德国德累斯顿理工大学的机构动物护理指南(文件号:T 2014/4)以及国际公认的动物护理指南(FELASA)17。图 1可视化细胞分离过程。
1. 准备设置、材料和介质
- 制备细胞培养基、PBS溶液、胶原酶混合库存溶液(在12 mL无菌超纯水中重组50mg冻胶酶混合物)和0.25%胰蛋白酶溶液。
- 将介质、PBS 和胰蛋白酶溶液预热至 37°C。
- 将超声波水浴预热至37°C。
- 消毒钳子、不锈钢铲、手术刀(每个器官 2x 手术刀)和 2 个玻璃烧杯,70% 乙醇,并将这些材料置于细胞培养罩下。
- 将一个烧杯装满 70% 乙醇,另一个用无菌水或 PBS 溶液填充。这些烧杯需要消毒和清洗仪器后,每个器官游行。
- 将含有冷PBS的无菌15 mL塑料管放在湿冰上。管的数量取决于你想从中分离成纤维细胞的器官数量。
2. 小鼠解剖和器官切除
- 戴两副手套,一双手套,一旦动物被解剖,就可以取出第一副手套。
注:此程序可防止动物毛皮和皮肤的细菌扩散到器官上。 - 将小鼠安乐死(例如,宫颈脱位),用针头将尸体固定在聚苯乙烯垫上。
- 使用 70% 乙醇喷雾对小鼠尸体进行消毒。确保毛皮浸泡在乙醇中,这样头发就不会旋转。
- 使用手术钳和创伤性剪刀将皮毛切到泌尿生殖道上方。从最初切口到颈部(3 - 4 厘米)的中线处切皮肤,并在四肢上添加松流。
注意:不要穿孔肌肉层在此步骤,以避免细菌污染! - 将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫垫上,以最佳地接触覆盖腹腔的肌肉。
- 使用70%乙醇对腹部肌肉消毒两次。在继续下一步之前,先让乙醇干燥。
- 取下第一副手套。使用一套新的无菌钳子和剪刀。
- 用手术剪刀切开肌肉层,轻轻去除选择的器官,打开腹腔和胸腔。因此,用手术钳轻轻握住器官(不要刺穿器官,使用最小压力),用剪刀在器官进入点附近切开供供血管。
- 将器官放入含有冷PBS的无菌管中。紧闭管子。将管子放在湿冰上,直到继续执行步骤 3.1。
3. 组织切碎、消化和细胞提取
- 将管子转移到无菌细胞培养罩下。
注意:戴上一双新鲜的手套,用70%乙醇对管子进行消毒,然后再将其转移到引擎盖下! - 使用无菌钳子将器官从 15 mL 管中取下。将器官放在无菌 6 厘米培养皿的一半上,用 PBS 短暂清洗器官以去除多余的血液。将器官转移到培养皿的后半部分,去除多余的PBS。
- 使用两个无菌手术刀切碎组织。剩余的组织碎片不应大于 1 - 2 mm.
- 使用无菌铲将切碎的组织转移到新的无菌 15 mL 管中,并加入 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶溶液。将管子放入37°C的细胞培养箱中5分钟。
- 轻轻旋转管(约 1400/分钟)10 秒。
- 通过添加4mL FCS含有细胞培养基(Dulbecco的改性鹰培养基(DMEM),停止细胞培养罩下的胰蛋白酶反应。
- 在每个含有心脏或肺组织的管中加入250μL胶原酶混合溶液,分别为肾脏或肝脏添加100μL。
- 将管子放入超声波水浴(37°C)中,激活超声波声波器10分钟。
注:本协议中使用的超声波水浴工作频率为35 kHz,最大功率为320 W。 - 轻轻旋转管子(约 1400/分钟)10 秒。
- 将管子再次放入超声波水浴中 10 分钟。
- 涡旋轻轻(约1400/分钟)为10秒。
- 用70%乙醇消毒管子,并将其转移到无菌细胞培养罩下。
- 用40μm网格过滤溶液,放入新的无菌15 mL管中。
- 将管在 500 x g下离心 5 分钟。
- 去除上清液,在1mL的新鲜介质中重新悬浮颗粒。
- 将细胞转移到合适的细胞培养容器(例如6孔板),并在37°C和5%CO2下将细胞培养箱置于细胞培养箱中过夜。
- 第二天,取出介质,用PBS洗涤3次,然后添加新鲜的介质(添加的体积取决于选择的细胞培养容器,6孔板每孔2mL等)。
- 每隔一天更改一次媒体。
注:纤维细胞在达到90%的光学汇合后(通常在5-7天后)可以分裂。
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Representative Results
证明了该方案从固体鼠组织中分离成人成纤维细胞的能力。获得了可行的成纤维细胞,可用于后续实验,如免疫荧光染色或增殖实验(图2D-F,图5A)。
成人成纤维细胞是扁平主轴状细胞,具有多个细胞过程,通常在单层12、18中生长。所得结果反映了这些形态特征,表明不同器官的成纤维细胞种群存在明显的形态差异(图2)。肾成纤维细胞特别小,生长密度高于心脏、肺或肝成纤维细胞(图2)。
图3的上部面板通过隔离后心脏成纤维细胞的例子描述了细胞成熟和增殖的过程。6~1天后,细胞的增殖率达到光汇合率>90%。在这个水平的汇合成纤维细胞停止增殖18和细胞可以分裂,使用0.25%胰蛋白酶,并转移到更大的细胞培养瓶为后续培养或实验。
在基底细胞培养条件下,成纤维细胞培养由成纤维细胞和较小比例的肌纤维细胞组成19,20。有几个公认的标记来识别成纤维细胞。DDR2和维他命表达是常见的成纤维细胞标记物,有组织βSMA微丝的表达表明肌纤维细胞分化7,9。图4给出了一个差异化肌纤维细胞的代表性图像,具有独特的βSMA微丝和具有代表性的对心脏、肾脏、肝脏和肺αSMA灯丝丰度的概述图像。虽然只有约20-30%的分离和随后培养的细胞表达有序排列βSMA微丝(表示肌纤维细胞分化),所有细胞(= 99%)对维他丁和DDR2呈阳性(图3,下面板)。
图 1.成纤维细胞隔离程序概述。从小鼠中取出感兴趣的器官后,使用无菌手术刀将其切碎在细胞培养罩下。随后,切碎的组织被转移到0.25%胰蛋白酶溶液5分钟。第一次消化后,加入胶原酶混合溶液,在37°C下将管子转移到超声波浴中20分钟。过滤和离心后,细胞颗粒可以转移到合适的细胞培养皿中。附加至少8小时后,用PBS清洗培养物三次,以去除红细胞和碎屑。最后,加入新鲜培养基(DMEM,15%FCS,1%青霉素/链霉素),培养细胞。Servier 智能医学艺术的图像已用于创建图形 (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.原发性鼠纤维细胞在初级培养7天后从固体器官分离。A)心脏成纤维细胞。B)肺成纤维细胞。C)肾纤维细胞。D)肝成纤维细胞。细胞在DMEM(15%FCS,1%青霉素/链霉素(PS))中培养,温度为37°C,CO2为5%。10倍放大倍率和5.6倍光学相机变焦用于获取这些图像。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.文化中成纤维细胞的识别。A - C)心脏成纤维细胞的附着和生长4天。洗涤和介质变化后,附着的成纤维细胞会形成其独特的形状并增殖。细胞在DMEM中培养(15%FCS,1%PS)。D - F)成纤维细胞标记物 [SMA (D)、DDR2 (E) 和维门他质 (F) 培养 7 天后原纤维细胞的免疫荧光染色图像。核上沾满了DAPI(蓝色)。原抗体(西格玛-阿尔德里希)在1%BSA溶液中稀释1:200(μSMA:A5228;DDR2: HPA070112;维门丁:V5255)。亚历克萨-弗鲁488被用作二级抗体。刻度条等于上述指示长度。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.具有代表性的免疫细胞化学图像,用于βSMA微丝丰度。A)显示典型的肌纤维瘤(放大倍数:20倍)。B = E)代表 _SMA 心脏 (B)、肾脏 (C)、肝脏 (D) 和肺 (E) 的概述图像(放大倍数:10 倍)。白色圆圈表示被认为是肌纤维细胞的代表性细胞。核上沾满了DAPI(蓝色)。原抗体在1%BSA溶液中稀释1:200(μSMA:A5228)。亚历克萨-弗鲁488被用作二级抗体。刻度条等于上述指示长度。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.鼠纤维细胞和体外衰老发育的增殖率。A)在培养7天和14天后确定的鼠纤维细胞增殖率。细胞在各自的时间点被收获,用Buerker室计数。结果表示1mL的介质中的细胞计数。B)衰老是由β-乳糖酶(染色绿色)的存在决定的。致敏细胞用白色圆圈表示。刻度柱等于50μm。结果以平均值=SEM显示。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
与不朽的成纤维细胞系相比,原纤维细胞具有几个优点。它们可以以高质量和数量经济高效地隔离。此外,初级培养物提供了研究来自多个个体的细胞的可能性,从而提高了获得的结果的可靠性,并降低了仅仅研究细胞培养物的可能性。持续产生新的初级文化可以防止基因改变,这通常发生在反复传递21之后。此外,细胞衰老22,23或增加的肌纤维细胞分化在高通道20的培养中发生更频繁。在低通道(2-3),基底肌纤维细胞计数约为20-30%(数据未显示),只有2.89%的细胞被认为衰老基于β-乳糖酶表达(图5B)。因此,建议将文化传递至最多 5 次,并在此之后替换它们。这保证了在整个实验中可靠和可复制的结果。在含有15%FCS的细胞培养基中,而不是10%的细胞培养基获得最佳成纤维细胞生长和增殖。这确保了第一次通过后强大的成纤维细胞产量和良好的细胞活力。
该协议在速度和难度方面对现有技术进行补充。生长技术需要10-21天,取决于物种和组织,直到足够的成纤维细胞可以收获12,24。另一方面,兰根多夫灌注速度很快(<5 h),但需要更多的手工技能和培训。与生长方法12、24或成纤维细胞从兰根多夫灌注16的上清分离相比,该协议为初学者提供了在极短的短时间后与原细胞一起工作的机会训练期(2 - 3隔离),无需高机械技能或技术努力。非纤维细胞(例如内皮细胞)的污染可以忽略不计,因为培养的成纤维细胞由于其增殖率较高,在培养中迅速过度生长。此外,该协议给出了明确的说明,有助于避免细菌污染,这是使用原生鼠细胞的一个主要问题。在这里,确定了避免污染的两个关键步骤。第一个是器官切除。如果在去除毛皮和皮肤后不更换手套和手术器械,啮齿类毛皮细菌可以很容易地转移到器官。第二个关键步骤是隔离过程本身。细胞必须机械地从他们的组织利基去除。在兰根多夫灌注的情况下,这是通过液体的连续电流实现的。其他技术使用磁性搅拌棒或摇动方法。特别是,用超声波取代磁性搅拌棒,通过避免搅拌器和组织赖沙事双方之间的物理接触,降低了细菌污染的风险。超声波水浴的另一个优点是均匀地将热量分布到管中,从而为酶提供最佳的工作温度。
总之,该协议提供了一种快速、可靠和可复制的方法来分离原发性成纤维细胞,是高级和早期研究人员的理想选择。这种方法是对现有技术范围的有益补充,有助于更好地了解成纤维细胞在健康和疾病中的功能。
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Disclosures
没有要声明的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢罗米·肯佩女士和安妮特·奥皮茨夫人提供专家技术支持。我们还感谢比约恩·宾诺格先生的 IT 支持。这项工作得到了Fürerkreis Dresdner Erz-Kreislauf-Tage e.V.的赠款支持,b) "哈比利特费德·弗劳恩",卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯·德累斯顿医学院,以及科尔塞·克鲁纳-福森斯科莱格(EKFK)医学院卡尔·古斯塔夫卡鲁斯德累斯顿我们感谢资金和支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
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