Summary
Vi præsenterer en protokol for at isolere primære voksne fibroblaster på en nem, hurtig og pålidelig måde, performable af begyndere (f. eks. studerende). Proceduren kombinerer enzymatisk vævs nedbrydning og mekanisk agitation med ultralydbølger for at opnå primære fibroblaster. Protokollen kan let tilpasses specifikke eksperimentelle krav (f. eks. humant væv).
Abstract
Primære voksne fibroblaster er blevet et vigtigt redskab til at studere fibrose, fibroblast interaktioner og inflammation i alle kropsvæv. Da primære fibroblaster ikke kan opdeles på ubestemt tid på grund af myofibroblast differentiering eller senescens induktion, skal nye kulturer etableres regelmæssigt. Men der er flere forhindringer at overvinde i løbet af processerne med at udvikle en pålidelig isolations protokol og primær fibroblast isolation selv: metodens sværhedsgrad (især for begyndere), risikoen for bakteriel kontaminering, nødvendig tid, indtil primære fibroblaster kan bruges til eksperimenter, og efterfølgende celle kvalitet og levedygtighed. I denne undersøgelse, en hurtig, pålidelig og nem at lære protokol til at isolere og kultur primære voksne fibroblaster fra mus hjerte, lunge, lever og nyrer, der kombinerer enzymatisk fordøjelse og ultralyd agitation.
Introduction
Fibroblaster er flade, spindel formede celler med flere stellat processer og en omfattende ru endoplasmatiske reticulum1,2. En gennemsnitlig fibroblast måler 30-100 μm og har en levetid på 57 ± 3 dage1,3. Den gennemsnitlige celle cyklus varighed af humane fibroblaster spænder fra 16-48 h afhængigt af dyrkningsbetingelserne4. Der er tegn på, at den replikerende kapacitet og funktionelle kvalitet af dyrkede primære fibroblaster negativt korrelerer med donor alderen, hvilket tyder på, at yngre donorer (dyr eller patienter) bør foretrækkes, hvis det er muligt,5,6 .
Fibroblaster udgør en fremherskende celletype af de fleste pattedyr kropsvæv. På trods af deres allestedsnærværende tilstedeværelse, er den molekylære identifikation af fibroblaster stadig en udfordring7. Fibroblaster migrerer til udvikling af væv og organer fra forskellige kilder under fosterudvikling8. Af denne grund er der en overflod af markør proteiner, der kan findes i fibroblaster, mens unikke markør proteiner, som er til stede i hver fibroblast befolkning og eksklusiv for fibroblaster, stadig mangler. Således udtryk mønstre af flere anerkendte markører er normalt bruges til at identificere fibroblaster. Blandt de mest anerkendte markører er vimentin, humant fibroblast overflade protein (hFSP), diskoidin domæne receptor 2 (DDR2) og alpha glat muskel actin (αSMA).
Fibroblaster er den vigtigste ekstracellulære matrix (ECM)-producerende celletype. Derved opretholder fibroblaster en velordnet vævs arkitektur og yder mekanisk støtte til tilstødende celler1. Balancen mellem ECM syntese og nedbrydning er en velreguleret proces. Forskydninger mod syntese markere begyndelsen af overdreven ECM deposition, som, hvis ikke afsluttet, fører til fibrose. Fibrose medieres af myofibroblaster, som stammer fra aktiverede fibroblaster, der gennemgår molekylære og fænotypiske forandringer. Et kendetegn for myofibroblaster er øget sekretion af ECM og cytokiner og udtrykket af ordnede arrangeret αSMA Micro filamenter9.
Primære fibroblaster har været i rampelyset for nylig forskning med fokus på fibrose, vævs betændelse og fibroblast-cancer-celle interaktioner10,11. Men for effektivt at studere fibroblast egenskaber i sundhed og sygdom, er det nødvendigt at isolere levedygtige primære voksne fibroblaster på en regelmæssig basis. Der er flere metoder til rådighed til at isolere fibroblaster12,13,14. De tre vigtigste metoder til fibroblast isolation er udvækst fra væv bidder12, enzymatisk væv fordøjelse15, og enzymatisk perfusion af hule organer9,13,16. Fordelen ved udvækst er en blid isolations proces uden enzymatisk cellenedbrydning. På den anden side, udvækst kulturer normalt kræver langvarig kultur perioder, indtil cellerne kan bruges til eksperimenter. Almindelig enzymatisk fordøjelse er hurtig, men bærer en risiko for kontaminering med andre celletyper (f. eks. endotelceller) eller bakterier i agitations processen, hvilket er nødvendigt for mekanisk at opløse vævet. Desuden er disse metoder ofte udførlige og kræver tid og dygtighed til at lære.
Med hensyn til vigtigheden af primære fibroblaster i forskning, er der stadig behov for at optimere eksisterende celle isolation tilgange i form af hurtighed, enkelhed og pålidelighed. Her leveres en roman ultralyds baseret enzymatisk fibroblast isolationsmetode, der leverer højkvalitets celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol følger de institutionelle retningslinjer for dyrepasning i Technische Universität Dresden, Tyskland (sagsnummer: T 2014/4) samt internationalt accepterede retningslinjer for dyrepasning (FELASA)17. Figur 1 visualiserer celle isolations processen.
1. klargøring af setup, materiale og medier
- Forbered cellekulturmedium, PBS opløsning, kollagenase blanding stamopløsning (rekonstruere 50 mg lyofiliseret kollagenase blanding i 12 ml sterilt ultrarent vand), og 0,25% trypsin opløsning.
- Opvarmer mediet, PBS og trypsin-opløsningen til 37 °C.
- Forvarm ultralydvandbadet til 37 °C.
- Desinficer pincet, en spatel af rustfrit stål, skalpeller (2x skalpeller pr. organ) og 2 glas bægre med 70% ethanol, og Placer disse materialer under celle kulturens hætte.
- Fyld et bægerglas med 70% ethanol og det andet med steril vand-eller PBS-opløsning. Disse bægre er forpligtet til at desinficere og vaske instrumentet efter hver orgel procession.
- Anbring sterile 15 mL plastslanger med kold PBS på våd is. Antallet af rør afhænger af antallet af organer, du ønsker at isolere fibroblaster fra.
2. mus dissektion og organ fjernelse
- Bær to par handsker over hinanden, så det første par kan fjernes, så snart dyret er blevet dissekeret.
Bemærk: denne procedure forhindrer bakterier fra dyrets pels og hud i at sprede sig over organerne. - Euthanize musen (f. eks, livmoderhalsen dislokation) og fastgør slagtekroppen med nåle til hver lemmer til en polystyren pad.
- Desinficer musens slagtekrop med 70% ethanol spray. Sørg for, at pels er gennemblødt i ethanol, så håret ikke vil hvirvle op.
- Skær pels lige over den urogenitale kanal ved hjælp af kirurgiske pincet og atraumatisk saks. Skær huden sammen med midterlinjen fra punktet af det indledende snit til halsen (3-4 cm) og tilsæt relief nedskæringer ved lemmerne.
Forsigtig: perforer ikke muskellag på dette trin for at undgå bakteriel kontaminering! - Fastgør huden til polystyren skumpuden for at få optimal adgang til muskulaturen, der dækker bughulen.
- Desinficer den abdominale muskulatur to gange med 70% ethanol. Lad ethanol tørre, før du fortsætter til næste trin.
- Fjern det første par handsker. Brug et nyt, sterilt sæt pincet og en saks.
- Åbn bughulen og brystkassen ved at indsnit muskulatur lag med kirurgisk saks til forsigtigt at fjerne organer valg. Hold derfor orgelet forsigtigt med kirurgiske pincet (Undlad at gennembore orglet, brug minimal tryk) og skær de forsyner blodkar i nærheden af Indgangspunktet på orgel med en saks.
- Sæt organerne i de sterile rør, der indeholder kold PBS. Luk rørene tæt. Anbring rørene på våd is, indtil du fortsætter med trin 3,1.
3. vævs hakning, fordøjelse og celle ekstraktion
- Overfør rørene under den sterile cellekultur hætte.
Forsigtig: bær et par friske handsker og Desinficer rørene med 70% ethanol, før du overfører dem underkøler hjelmen! - Tag orgelet ud af 15 mL-røret med sterile pincet. Placer orgelet på halvdelen af en steril 6 cm Petri skål og vask orglet kortvarigt med PBS for at fjerne overskydende blod. Overføre orgel til anden halvdel af Petri skålen, fjerne overskydende PBS.
- Mince vævet ved hjælp af to sterile Scalpels. De resterende vævs fragmenter bør ikke være større end 1-2 mm.
- Det hakkede væv overføres til et nyt sterilt 15 mL rør med den sterile spatel, og der tilsættes 2 mL 0,25% trypsin-opløsning. Anbring røret i en celle kulturinkubator ved 37 °C i 5 minutter.
- Vortex røret forsigtigt (ca. 1400/min.) i 10 s.
- Stop trypsin-reaktionen under cellekultur hætten ved at tilføje 4 mL FCS-indeholdende cellekulturmedium (Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM), f. eks.).
- Tilsæt 250 μL kollagenaseblandings opløsning til hvert rør, der indeholder hjerte-eller lungevævet og 100 μL til henholdsvis nyrer og lever.
- Placer rørene i et ultralydvandbad (37 °C) og Aktivér ultralydsonikator i 10 minutter.
Bemærk: ultralydvandbadet, der anvendes i denne protokol, har en driftsfrekvens på 35 kHz og en maksimal effekt på 320 W. - Vortex rørene forsigtigt (ca. 1400/min.) i 10 s.
- Placer rørene igen i ultralydvandbadet i 10 minutter.
- Vortex forsigtigt (ca. 1400/min.) i 10 s.
- Desinficer rørene med 70% ethanol og overfør dem under den sterile cellekultur hætte.
- Opløsningen filtreres med et 40 μm-net i et nyt sterilt 15 mL-rør.
- Centrifuger røret ved 500 x g i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og pelleten opslæmmes i 1 mL frisk medium.
- Cellerne overføres til et egnet cellekultur fartøj (f. eks. 6-brønd plader), og beholderen placeres i cellekultur inkubator natten over ved 37 °C og 5% CO2.
- Den næste dag, fjerne mediet, vask 3 gange med PBS, derefter tilsættes frisk medium (den ekstra volumen afhænger af cellen kultur fartøj valg, 2 mL per brønd af en 6-brønd plade osv.).
- Skift mellem mediet hver anden dag.
Bemærk: fibroblaster kan opdeles efter at have nået optisk sammenløbet på 90% (normalt efter 5-7 dage).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokols evne til at isolere voksne fibroblaster fra solidt murinvæv blev påvist. Der blev opnået levedygtige fibroblaster, som kunne anvendes til efterfølgende eksperimenter såsom immunofluorescens farvning eller sprednings forsøg (figur 2D-F, figur 5A).
Voksne fibroblaster er flade spindel formede celler med flere cellulære processer, der typisk vokser i monolag12,18. De opnåede resultater afspejler disse morfologiske kendetegn og indikerer distinkte morfologiske forskelle i fibroblast populationer fra forskellige organer (figur 2). Nyre fibroblaster var især mindre og voksede ved højere tætheder end hjerte-, lunge-eller lever fibroblaster (figur 2).
Det øverste panel af figur 3 skildrer processen med celle modning og spredning via eksemplet med kardielle fibroblaster efter isolationen. Cellerne viste høje sprednings hastigheder når optisk sammenløbet af > 90% efter 6 ± 1 dage. På dette niveau af Confluence fibroblaster stop at formere18 og cellerne kan opdeles, ved hjælp af 0,25% trypsin, og overføres til større cellekultur kolber til efterfølgende kultur eller eksperimenter.
Under basal celle dyrkningsbetingelser består fibroblast kulturer af fibroblaster og en mindre del af myofibroblaster19,20. Der er flere accepterede markører til at identificere fibroblaster. DDR2 og vimentin udtryk er almindeligt fibroblast markører og ekspression af organiserede αsma mikrofilamenter indikerer myofibroblast differentiering7,9. Et repræsentativt billede af en differentieret myofibroblast med karakteristiske αSMA-mikrofilamenter og repræsentative overblik billeder for αSMA filament tæthed i hjerte, nyrer, lever og lunge er præsenteret i figur 4. Mens kun ca. 20-30% af de isolerede og efterfølgende dyrkede celler udtrykte ordnede arrangerede αSMA-mikrofilamenter (hvilket indikerede myofibroblast-differentiering), var alle cellerne (≈ 99%) var positive for vimentin og DDR2 (figur 3, lavere panel).
Figur 1 . Oversigt over fibroblast isolations proceduren. Efter at de organer af interesse er blevet fjernet fra musen, de er hakket under en cellekultur hætte ved hjælp af sterile Scalpels. Efterfølgende overføres det hakkede væv til 0,25% trypsin-opløsning i 5 min. Efter den første fordøjelse tilsættes kollagenase Blend opløsning, og rørene overføres til et ultralydbad i 20 minutter ved 37 °c. Efter filtrering og centrifugering kan celle pellet overføres til en egnet cellekultur skål. Efter mindst 8 h at vedhæfte, kulturerne vaskes tre gange med PBS at fjerne erythrocytter og snavs. Endelig tilsættes frisk medium (DMEM, 15% FCS, 1% penicillin/streptomycin), og cellerne kan dyrkes. Billeder af Servier Smart Medical art er blevet brugt til at skabe figuren (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Primære murine fibroblaster isoleret fra solide organer efter 7 dage af primær kultur. A) kardielle fibroblaster. B) pulmonale fibroblaster. C) nyre fibroblaster. D) lever fibroblaster. Cellerne blev dyrket i DMEM (15% FCS, 1% penicillin/streptomycin (PS)) ved 37 °C og 5% CO2. 10x forstørrelse og 5.6 x optisk kamera zoom blev brugt til at få disse billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Identifikation af fibroblaster i kulturen. A-C) fastgørelse og vækst af kardiale fibroblaster i 4 dage. Efter vask og medium ændre de vedlagte fibroblaster udvikle deres karakteristiske form og formere sig. Cellerne blev dyrket i DMEM (15% FCS, 1% PS). D-F) Immunofluorescens farvning billeder af primære fibroblaster efter 7 dages kultur for fibroblast markører αSMA (D), DDR2 (E) og Vimentin (F). Kerner blev plettet med DAPI (blå). Primære antistoffer (Sigma-Aldrich) blev fortyndet 1:200 i 1% BSA opløsning (αSMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-fluor 488 blev brugt som sekundært antistof. Skala bjælkerne svarer til de angivne længder ovenfor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Repræsentative immunocytoemiske billeder til overflod af αSMA-mikrofilament. A) der vises en typisk myofibroblast (forstørrelse: 20x). B – E) Repræsentative αSMA-oversigt billeder for hjerte (B), nyre (C), lever (D) og lunge (E) (forstørrelse: 10x). De hvide cirkler indikerer repræsentative celler, som blev betragtet som myofibroblaster. Kerner blev plettet med DAPI (blå). Det primære antistof blev fortyndet 1:200 i 1% BSA-opløsning (αSMA: A5228). Alexa-fluor 488 blev brugt som sekundært antistof. Skala bjælkerne svarer til de angivne længder ovenfor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Spredning af murine fibroblaster og udvikling af in vitro-senescens. A) sprednings hastigheden af murine fibroblaster bestemt efter 7 og 14 dages kultur. Celler blev høstet og tælles med et Buerker kammer på de respektive tidspunkter. Resultaterne repræsenterer celletal i 1 mL medium. B) senescens bestemmes af tilstedeværelsen af β-galactosidase (farvet grøn). Senescent celler er indikeret med hvide cirkler. Skalalinjen er lig med 50 μm. Resultaterne præsenteres som Mean ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med udødeliggjort fibroblast cellelinjer, primære fibroblaster giver flere fordele. De kan være isolerede omkostninger effektivt i høj kvalitet og kvantitet. Endvidere, primære kulturer giver mulighed for at studere celler fra flere individer, hvilket øger pålideligheden af de opnåede resultater og mindsker sandsynligheden for blot at studere cellekultur artefakter. Kontinuerlig generation af nye primære kulturer forhindrer genetiske ændringer, som almindeligvis opstår efter gentagen passaging21. Derudover forekommer cellulær gulne året22,23 eller øget myofibroblast differentiering hyppigere i kulturer ved høje passager20. Ved lave passager (2-3) var basal myofibroblast tallet ca. 20-30% (data ikke vist), og kun 2,89% af cellerne blev betragtet som senescerende baseret på β-galactosidase-ekspression (figur 5B). Af denne grund anbefales det at passere kulturerne op til maksimal 5 gange og at erstatte dem herefter. Dette garanterer pålidelige og reprodustillelige resultater gennem hele eksperimenterne. Optimal fibroblast vækst og spredning blev opnået med cellekulturmedium indeholdende 15% FCS i stedet for 10%. Dette sikrede en robust fibroblast udbytte og god cellelevedygtighed efter den første passage.
Denne protokol supplerer de eksisterende teknikker med hensyn til hastighed og sværhedsgrad. Outgrowth teknikker kræver mellem 10-21 dage, afhængigt af art og væv, indtil tilstrækkelige mængder af fibroblaster kan høstes12,24. Langendorff-perfusion på den anden side er hurtig (< 5 h), men kræver mere manuel færdighed og træning. Sammenlignet med udvækst metoder12,24 eller fibroblast isolation fra supernatanten af Langendorff-perfusion16, denne protokol giver især begyndere mulighed for at arbejde med primære celler efter en meget kort uddannelsesperiode (2-3 isoleringer) uden krav om høj mekanisk dygtighed eller teknisk indsats. Kontaminering med ikke-fibroblast celler (f. eks. endotelceller) var ubetydelig, fordi dyrkede fibroblaster hurtigt over vokser andre celletyper i kulturer på grund af deres højere sprednings hastigheder25. Desuden, denne protokol giver klare instruktioner, der hjælper med at undgå bakteriel kontaminering, som er et stort problem at arbejde med primære murine celler. Her blev der identificeret to kritiske trin for at undgå kontaminering. Den første er organ fjernelse. Gnaver pels bakterier kan let overføres til organerne, hvis handskerne og kirurgiske instrumenter ikke ændres efter fjernelse af pels og hud. Det andet kritiske skridt er selve isolations processen. Cellerne skal fjernes mekanisk fra deres væv niche. I forbindelse med Langendorff-perfusion er dette realiseret ved en kontinuerlig strøm af væske. Andre teknikker bruger magnetiske omrørings stænger eller ryste metoder. Især udskiftning af magnetiske omrørings stænger ved ultralydsbølger reducerer risikoen for bakteriel kontaminering ved at undgå fysisk kontakt mellem omrører og vævs lysat. En yderligere fordel ved ultralydvandbadet er den jævn fordeling af varme til rørene, hvilket giver optimale arbejdstemperaturer for enzymerne.
Afslutningsvis, denne protokol giver en hurtig, pålidelig og replikere metode til at isolere primære fibroblaster, der er ideel til både avancerede og tidlige stadier forskere. Denne metode er en nyttig tilføjelse til det eksisterende spektrum af teknikker, der kan bidrage til en bedre forståelse af fibroblast funktion i sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi takker fru Romy Kempe og fru Annett Opitz for ekspert teknisk support. Vi takker også hr. Bjoern Binnewerg for IT-støtte. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra a) Förderkreis Dresdner Herz-kreislauf-tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", det medicinske fakultet Carl Gustav Carus Dresden og c) Else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Faculty of Medicine Carl Gustav Carus Dresden. Vi er taknemmelige for finansieringen og støtten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
References
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
