Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

doi: 10.3791/59858 Published: July 29, 2019

Summary

We presenteren een protocol om primaire volwassen fibroblasten op een eenvoudige, snelle en betrouwbare manier te isoleren, die door beginners kunnen worden perforeerbaar (bijv. studenten). De procedure combineert enzymatische weefsel spijsvertering en mechanische opwinding met ultrasone golven om primaire fibroblasten te verkrijgen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke experimentele eisen (bijv. menselijk weefsel).

Abstract

Primaire volwassen fibroblasten zijn uitgegroeid tot een belangrijk instrument om fibrose te bestuderen, fibroblast interacties en ontsteking in alle lichaamsweefsels. Omdat primaire fibroblasten niet voor onbepaalde tijd kunnen delen door myofibroblast-differentiatie of senescentie-inductie, moeten er regelmatig nieuwe culturen worden vastgesteld. Echter, er zijn verschillende obstakels te overwinnen tijdens de processen van de ontwikkeling van een betrouwbare isolatie protocol en primaire fibroblast isolatie zelf: de moeilijkheidsgraad van de methode (vooral voor beginners), het risico van bacteriële besmetting, de vereiste tijd tot primaire fibroblasten kunnen worden gebruikt voor experimenten, en de daaropvolgende celkwaliteit en levensvatbaarheid. In deze studie, een snelle, betrouwbare en gemakkelijk te leren protocol om primaire volwassen fibroblasten te isoleren en te cultuur van muis hart, longen, lever en nieren combineren enzymatische spijsvertering en ultrasone agitatie is voorzien.

Introduction

Fibroblasten zijn vlakke, spindle-vormige cellen met meerdere ecoagriturismo late processen en een uitgebreid ruw endoplasmisch reticulum1,2. Een gemiddelde fibroblast meet 30-100 μm en heeft een levensduur van 57 ± 3 dagen1,3. De gemiddelde celcyclus duur van menselijke fibroblasten varieert van 16-48 h, afhankelijk van de cultuuromstandigheden4. Er zijn aanwijzingen dat de replicatieve capaciteit en de functionele kwaliteit van gekweekte primaire fibroblasten negatief correleerden met de leeftijd van de donor, wat suggereert dat jongere donoren (dieren of patiënten) de voorkeur moeten krijgen indien mogelijk5,6 .

Fibroblasten vormen een overheersend celtype van de meeste lichaamsweefsels van zoogdieren. Ondanks hun alomtegenwoordige aanwezigheid is de moleculaire identificatie van fibroblasten nog steeds een uitdaging7. Fibroblasten migreren naar de ontwikkeling van weefsels en organen uit verschillende bronnen tijdens de embryonale ontwikkeling8. Om deze reden is er een overvloed aan marker eiwitten die kan worden gevonden in fibroblasten, terwijl unieke marker eiwitten, die aanwezig zijn in elke fibroblast populatie en exclusief voor fibroblasten, nog steeds ontbreken. Zo worden expressie patronen van verschillende herkende markers meestal gebruikt om fibroblasten te identificeren. Onder de meest erkende markers zijn vimentin, menselijk fibroblast oppervlak eiwit (hFSP), discoidin domein receptor 2 (DDR2) en alpha glad spier actine (αsma).

Fibroblasten zijn de belangrijkste extracellulaire matrix (ECM)-producerende celtype. Daardoor behouden fibroblasten een geordende weefsel architectuur en bieden ze mechanische ondersteuning voor naburige cellen1. De balans tussen ECM-synthese en afbraak is een goed gereguleerd proces. Verschuivingen in de richting van synthese markeren het begin van overmatige ECM-depositie die, indien niet beëindigd, leidt tot fibrose. Fibrose wordt gemedieerd door myofibroblasten, die afkomstig zijn van geactiveerde fibroblasten die moleculaire en fenotypische veranderingen ondergaan. Een kenmerk van myofibroblasten is verbeterde secretie van ECM en cytokinen en de uitdrukking van ordelijke gearrangeerde αSMA Microfilamenten9.

Primaire fibroblasten zijn in de schijnwerpers van recent onderzoek gericht op fibrose, weefsel ontsteking en fibroblast-kanker-celinteracties10,11. Echter, om effectief te bestuderen fibroblast eigenschappen in gezondheid en ziekte, het is noodzakelijk om te isoleren van levensvatbare primaire volwassen fibroblasten op een regelmatige basis. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het isoleren van fibroblasten12,13,14. De drie belangrijkste methoden van fibroblast isolatie zijn uitgroei uit weefsel chunks12, enzymatische weefsel spijsvertering15, en enzymatische perfusie van holleorganen 9,13,16. Het voordeel van uitgroei is een zacht isolatie proces zonder enzymatische celdegradatie. Aan de andere kant vereisen de groei culturen meestal langdurige cultuur perioden totdat cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten. Veelvoorkomende enzymatische spijsvertering is snel, maar draagt een risico van besmetting met andere celtypen (bijv. endotheel cellen) of bacteriën in het roer proces, die nodig zijn om het weefsel mechanisch te ontbinden. Bovendien, deze methoden zijn vaak uitgebreid en vereisen tijd en vaardigheid om te leren.

Wat betreft het belang van primaire fibroblasten in het onderzoek, is er nog steeds behoefte aan het optimaliseren van bestaande celisolatiebenaderingen in termen van snelheid, eenvoud en betrouwbaarheid. Hier wordt een nieuwe Ultrasone-gebaseerde enzymatische fibroblast-isolatiemethode geleverd die hoge kwaliteit cellen levert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het volgende protocol volgt de richtlijnen voor de institutionele dierenverzorging van de Technische Universität Dresden, Duitsland (dossiernummer: T 2014/4) en internationaal aanvaarde richtlijnen inzake dierenverzorging (FELASA)17. Figuur 1 visualiseert het celisolatieproces.

1. voorbereiden van de installatie, materiaal en media

  1. Bereid celkweekmedium, PBS-oplossing, Collagenase Blend Stock Solution (reconstitueer 50 mg gelyofiliseerd Collagenase mengsel in 12 mL steriel ultrapuur water), en 0,25% trypsine oplossing.
  2. Verwarm het medium, de PBS en de trypsine-oplossing tot 37 °C.
  3. Verwarm het ultrasone waterbad voor op 37 °C.
  4. Desinfecteer de Tang, een spatel van roestvrijstaal, Scalpels (2x scalpels per orgel) en 2 glazen bekers met 70% ethanol en plaats deze materialen onder de celcultuurkap.
  5. Vul één bekerglas met 70% ethanol en de andere met steriel water of PBS-oplossing. Deze bekers zijn nodig om het instrument te ontsmetten en te wassen na elke orgaanprocessie.
  6. Plaats steriele 15 mL plastic buizen met koude PBS op nat ijs. Het aantal buisjes is afhankelijk van het aantal organen waarvan u de fibroblasten wilt isoleren.

2. muis dissectie en orgaanverwijdering

  1. Draag twee paar handschoenen boven elkaar, zodat het eerste paar kan worden verwijderd zodra het dier is ontleed.
    Opmerking: deze procedure voorkomt dat bacteriën uit de vacht en de huid van het dier zich over de organen verspreiden.
  2. Euthaniseer de muis (bijv. cervicale dislocatie) en speld het karkas met naalden aan elke ledemaat tot een piepschuim pad.
  3. Desinfecteer het karkas van de muis met behulp van 70% ethanol spray. Zorg ervoor dat de vacht wordt geweekt in ethanol zodat het haar niet zal opzwenken.
  4. Snijd de vacht recht boven het urogenitale tractus met behulp van chirurgische Tang en atraumatische schaar. Snijd de huid langs de middelste lijn vanaf het punt van de initiële incisie naar de nek (3-4 cm) en voeg reliëf sneden toe aan de ledematen.
    Let op: de gespierde laag niet perforeren bij deze stap om bacteriële besmetting te voorkomen!
  5. Speld de huid aan het piepschuim pad om een optimale toegang tot de spier massa die de buikholte bedekt.
  6. Desinfecteer de buikspieren tweemaal met 70% ethanol. Laat de ethanol drogen voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  7. Verwijder het eerste paar handschoenen. Gebruik een nieuwe, steriele set Tang en schaar.
  8. Open de buikholte en de thorax door gebeuren van de gespierde laag met chirurgische schaar om voorzichtig te verwijderen van de organen van de keuze. Houd daarom het orgel zachtjes vast met een chirurgische Tang (niet doorboren van het orgel, gebruik minimale druk) en snijd de leverende bloedvaten bij het ingangspunt op het orgel met een schaar.
  9. Leg de organen in de steriele buisjes die koude PBS bevatten. Sluit de buizen strak. Plaats de buisjes op nat ijs totdat u doorgaat met stap 3,1.

3. weefsel gehakt, spijsvertering en celextractie

  1. Breng de buisjes onder de steriele celcultuurkap over.
    VOORZICHTIG: Draag een nieuw paar handschoenen en Desinfecteer de buizen met 70% ethanol voordat u ze onder de motorkap overbrengt!
  2. Neem het orgel uit de 15 mL buis met behulp van steriele Tang. Plaats het orgel op de helft van een steriele 6 cm Petri schaal en was het orgel kort met PBS om overtollig bloed te verwijderen. Breng het orgel over naar de tweede helft van de Petri schaal, Verwijder overtollige PBS.
  3. Het weefsel met behulp van twee steriele scalpels gehakt. De overblijvende weefsel fragmenten mogen niet groter zijn dan 1-2 mm.
  4. Breng het fijngehakte weefsel in een nieuwe steriele 15 mL buis met behulp van de steriele spatel en voeg 2 mL 0,25% trypsine oplossing toe. Plaats de buis in een cel cultuur incubator bij 37 °C gedurende 5 minuten.
  5. Vortex de buis zachtjes (circa 1400/min) voor 10 s.
  6. Stop de trypsine-reactie onder de celcultuurkap door toevoeging van 4 mL FCS-bevattende celkweekmedium (Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium (DMEM), bijv.).
  7. Voeg 250 μL Collagenase-Meng oplossing toe aan elke buis met hart-of longweefsel en 100 μL voor nier-of lever, respectievelijk.
  8. Plaats de buizen in een ultrasoon waterbad (37 °C) en activeer de ultrasone sonicator gedurende 10 minuten.
    Opmerking: het ultrasone waterbad dat in dit protocol wordt gebruikt, heeft een bedrijfsfrequentie van 35 kHz en een maximaal vermogen van 320 W.
  9. Vortex de buizen zachtjes (circa 1400/min) gedurende 10 sec.
  10. Plaats de buizen opnieuw in het ultrasone waterbad gedurende 10 minuten.
  11. Vortex zachtjes (circa 1400/min) voor 10 sec.
  12. Desinfecteer de buisjes met 70% ethanol en breng ze over in de steriele celkweek.
  13. Filter de oplossing met een 40 μm gaas in een nieuwe steriele 15 mL buis.
  14. Centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 5 minuten.
  15. Verwijder de supernatant en rebreng de pellet in 1 mL vers medium.
  16. Breng de cellen in een geschikt celcultuurvat (bijv. 6-goed plaat) en plaats het vat in de celkweek incubator 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.
  17. De volgende dag, verwijder het medium, was 3 keer met PBS en voeg vervolgens vers medium toe (het toegevoegde volume is afhankelijk van het celkweek vaartuig naar keuze, 2 mL per put van een 6-well plaat enz.).
  18. Verander het medium om de andere dag.
    Opmerking: fibroblasten kunnen worden gesplitst na het bereiken van optische samenvloeiing van 90% (meestal na 5-7 dagen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het vermogen van dit protocol om volwassen fibroblasten uit massief muriene weefsel te isoleren werd aangetoond. Levensvatbare fibroblasten werden verkregen die kunnen worden gebruikt voor latere experimenten zoals immunofluorescentie kleuring of proliferatie experimenten (Figuur 2D-F, Figuur 5A).

Volwassen fibroblasten zijn platte spindel vormige cellen met meerdere cellulaire processen die meestal groeien in monolagen12,18. De verkregen resultaten weerspiegelen deze morfologische kenmerken en duiden op afzonderlijke morfologische verschillen in fibroblast populaties van verschillende organen (Figuur 2). Renale fibroblasten waren bijzonder kleiner en groeiden bij hogere dichtheden dan cardiale, pulmonale of hepatische fibroblasten (Figuur 2).

Het bovenste paneel van Figuur 3 toont het proces van celrijping en proliferatie via het voorbeeld van cardiale fibroblasten na de isolatie. De cellen weergegeven hoge proliferatie percentages bereiken optische samenvloeiing van > 90% na 6 ± 1 dagen. Op dit niveau van samenvloeiing fibroblasten stoppen om te prolifereren18 en de cellen kunnen worden gesplitst, met behulp van 0,25% trypsine, en overgebracht naar grotere cel cultuur kolven voor latere cultuur of experimenten.

Onder de basale celkweek omstandigheden bestaan fibroblast culturen uit fibroblasten en een kleiner deel van de myofibroblasten19,20. Er zijn verschillende geaccepteerde markers om fibroblasten te identificeren. DDR2 en vimentin expressie zijn gemeenschappelijke fibroblast markers en de uitdrukking van de georganiseerde αsma Microfilamenten geeft myofibroblast differentiatie7,9. Een representatief beeld van een gedifferentieerde myofibroblast met kenmerkende αSMA Microfilamenten en representatieve overzichts beelden voor de overvloed aan αSMA-filament in hart, nieren, lever en longen worden weergegeven in Figuur 4. Terwijl slechts ongeveer 20-30% van de geïsoleerde en vervolgens gekweekte cellen uitgedrukt ordelijk gerangschikt αSMA Microfilamenten (die duiden op myofibroblast differentiatie), alle cellen (≈ 99%) waren positief voor vimentin en DDR2 (Figuur 3, onderste paneel).

Figure 1
Figuur 1 . Overzicht van de Fibroblast-isolatie procedure. Nadat de aanwezige organen van de muis zijn verwijderd, worden ze met steriele scalpels fijngemalen onder een celcultuurkap. Vervolgens wordt het fijngehakte weefsel gedurende 5 minuten overgebracht naar een 0,25% trypsine-oplossing. Na de eerste spijsvertering wordt Collagenase-Meng oplossing toegevoegd en worden de buizen gedurende 20 minuten naar een ultrasoon bad overgebracht bij 37 °C. Na filtratie en centrifugeren kan de celpellet in een geschikte celkweek schaal worden overgebracht. Na ten minste 8 uur om te hechten, worden de culturen drie keer gewassen met PBS om erytrocyten en puin te verwijderen. Ten slotte wordt vers medium (DMEM, 15% FCS, 1% Penicillair/streptomycine) toegevoegd en kunnen de cellen worden gekweekt. Afbeeldingen van Servier Smart Medical Art zijn gebruikt voor het maken van de figuur (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 . Primaire Murine fibroblasten geïsoleerd van vaste organen na 7 dagen van de primaire cultuur. A) cardiale fibroblasten. B) pulmonale fibroblasten. C) nierfibroblasten. D) hepatische fibroblasten. De cellen werden gekweekt in DMEM (15% FCS, 1% penicilline/streptomycine (PS)) bij 37 °C en 5% CO2. 10x vergroting en 5.6 x optische camera zoom werden gebruikt om deze beelden te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 . Identificatie van fibroblasten in de cultuur. A-C) gehechtheid en groei van hart fibroblasten gedurende 4 dagen. Na het wassen en de gemiddelde verandering ontwikkelen de bijgevoegde fibroblasten hun onderscheidende vorm en vermenigvuldigen ze. De cellen werden gekweekt in DMEM (15% FCS, 1% PS). D-F) Immunofluorescentie kleurings beelden van primaire fibroblasten na 7 dagen cultuur voor fibroblast-markers αSMA (D), DDR2 (E) en Vimentin (F). De kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Primaire antilichamen (sigma-Aldrich) werden verdund 1:200 in 1% BSA-oplossing (αSMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-Fluor 488 werd gebruikt als secundair antilichaam. De schaalbalken zijn gelijk aan de hierboven aangegeven lengtes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 . Representatieve immunocytochemische beelden voor de abundantie van αSMA micro filament. A) een typische myofibroblast wordt weergegeven (vergroting: 20x). B – E) Representative αSMA overzicht beelden voor hart (B), nier (C), lever (D) en Long (E) (vergroting: 10x). De witte cirkels duiden representatieve cellen aan die als myofibroblasten werden beschouwd. De kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Het primaire antilichaam werd verdund 1:200 in 1% BSA oplossing (αSMA: A5228). Alexa-Fluor 488 werd gebruikt als secundair antilichaam. De schaalbalken zijn gelijk aan de hierboven aangegeven lengtes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5 . Proliferatie van lymfklier fibroblasten en in-vitro senescentie ontwikkeling. A) proliferatie van lymfklier fibroblasten bepaald na 7 en 14 dagen van de cultuur. Cellen werden geoogst en geteld met een Buerker kamer op de respectievelijke tijdspunten. De resultaten vertegenwoordigen het aantal cellen in 1 mL medium. B) senescentie wordt bepaald door de aanwezigheid van β-galactosidase (gekleurd groen). Senescentie cellen worden aangeduid met witte cirkels. De schaalbalk is gelijk aan 50 μm. resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vergelijking met vereeuwigd fibroblast cellijnen bieden primaire fibroblasten verschillende voordelen. Ze kunnen worden geïsoleerd kosteneffectief in hoge kwaliteit en kwantiteit. Bovendien bieden primaire culturen de mogelijkheid om cellen van meerdere individuen te bestuderen, wat de betrouwbaarheid van de verkregen resultaten verhoogt en de kans verkleint dat alleen celcultuurartefacten worden bestudeerd. Continue generatie van nieuwe primaire culturen voorkomt genetische veranderingen die vaak optreden na herhaalde passage van21. Bovendien komen cellulaire senescentie22,23 of verhoogde myofibroblast differentiatie vaker voor in culturen met hoge passages20. Bij lage passages (2-3) was de basale myofibroblast telling ongeveer 20-30% (gegevens niet weergegeven) en slechts 2,89% van de cellen werd als senescentie beschouwd op basis van β-galactosidase expressie (Figuur 5B). Om deze reden, het is aanbevolen om de passage van de culturen tot maximaal 5 keer en ter vervanging van hen hierna. Dit garandeert betrouwbare en replicabele resultaten gedurende de experimenten. Optimale fibroblast groei en proliferatie werden verkregen met celkweekmedium met 15% FCS in plaats van 10%. Dit zorgde voor een robuuste fibroblast-opbrengst en een goede levensvatbaarheid van de cellen na de eerste passage.

Dit protocol vult bestaande technieken aan in termen van snelheid en moeilijkheidsgraad. Uitgroei technieken vereisen tussen 10-21 dagen, afhankelijk van de soort en het weefsel, totdat voldoende hoeveelheden fibroblasten kunnen worden geoogst12,24. Langendorff-perfusie aan de andere kant is snel (< 5 h) maar vereist meer handmatige vaardigheid en training. Vergeleken met uitgroei-methoden12,24 of fibroblast-isolatie van de supernatant van Langendorff-Perfusion16, biedt dit protocol vooral beginners de mogelijkheid om met primaire cellen te werken na een zeer korte opleidingsperiode (2-3 isolaties) zonder de eis van hoge mechanische vaardigheid of technische inspanning. Besmetting met niet-fibroblast cellen (bijv. endotheel cellen) was verwaarloosbaar omdat gekweekte fibroblasten snel andere celtypen in culturen overgroeien vanwege hun hogere proliferatie percentages25. Bovendien geeft dit protocol duidelijke instructies die helpen om bacteriële besmetting te voorkomen, wat een groot probleem is bij het werken met primaire muriene cellen. Hier werden twee kritieke stappen geïdentificeerd om besmetting te voorkomen. De eerste is het verwijderen van het orgel. Knaagdieren bont bacteriën kunnen gemakkelijk worden overgebracht naar de organen als de handschoenen en chirurgische instrumenten niet worden gewijzigd na het verwijderen van de vacht en de huid. De tweede kritieke stap is het isolatie proces zelf. De cellen moeten mechanisch uit hun weefsel niche worden verwijderd. In de context van Langendorff-perfusie wordt dit gerealiseerd door een continue stroom van vloeistof. Andere technieken gebruiken magnetische roerstaven of schud methoden. Met name de vervanging van magnetische roerstaven door ultrasone golven vermindert het risico van bacteriële besmetting door fysiek contact tussen de roerder en het weefsel lysaat te vermijden. Een bijkomend voordeel van het ultrasone waterbad is de gelijkmatige verdeling van warmte naar de buizen, waardoor optimale werktemperaturen voor de enzymen worden geboden.

Concluderend, dit protocol biedt een snelle, betrouwbare en repliceerbaar methode om primaire fibroblasten te isoleren die ideaal is voor zowel gevorderde als vroeg-fase onderzoekers. Deze methode is een nuttige aanvulling op het bestaande spectrum van technieken die kunnen bijdragen tot een beter begrip van fibroblast functie in gezondheid en ziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er zijn geen belangenconflicten om te verklaren.

Acknowledgments

Wij danken mevrouw Romy Kempe en Mrs. Annett Opitz voor deskundige technische ondersteuning. Wij danken ook de heer Bjoern Binnewerg voor haar steun. Dit werk werd gesteund door subsidies van a) de Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Faculteit Geneeskunde Carl Gustav Carus Dresden en c) else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) faculteit geneeskunde Carl Gustav Carus Dresden. Wij zijn dankbaar voor de financiering en de steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 mL
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 376-379 (2011).
  2. Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14, (8), 484-491 (2017).
  3. Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4, (2), 159-166 (1975).
  4. Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62, (1), 1-12 (1992).
  5. Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516, (1), 71-74 (2002).
  6. Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38, (4), 1063-1074 (2016).
  7. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  8. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  9. Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. 445098 (2018).
  10. Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102, (2), 258-269 (2014).
  11. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16, (9), 582-598 (2016).
  12. Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4, (2), (2016).
  13. Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
  14. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96, (5), 535-539 (2018).
  15. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40, (8-9), 268-277 (2004).
  16. El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80, (3), 396-406 (2008).
  17. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51, (3), 311-321 (2012).
  18. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
  19. Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (9), 4219-4223 (1996).
  20. Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 389-399 (2011).
  21. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
  22. Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6, (12), 2853-2868 (2008).
  23. Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21, (12), 1424-1435 (2015).
  24. Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47, (2), 83-88 (2011).
  25. Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185, (2), 519-528 (1989).
Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).More

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter