Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Isolement du fibroblaste primaire adulte à ultrasons

doi: 10.3791/59858 Published: July 29, 2019

Summary

Nous présentons un protocole pour isoler les fibroblastes adultes primaires d'une manière facile, rapide et fiable, performable par les débutants (p. ex., les étudiants). La procédure combine la digestion des tissus enzymatiques et l'agitation mécanique avec des ondes ultrasoniques pour obtenir des fibroblastes primaires. Le protocole peut facilement être adapté à des exigences expérimentales spécifiques (p. ex., tissus humains).

Abstract

Les fibroblastes adultes primaires sont devenus un outil important pour étudier la fibrose, les interactions de fibroblaste et l'inflammation dans tous les tissus du corps. Puisque les fibroblastes primaires ne peuvent pas se diviser indéfiniment en raison de la différenciation ou de l'induction de la sénescence myofibroblaste, de nouvelles cultures doivent être établies régulièrement. Cependant, il y a plusieurs obstacles à surmonter au cours des processus de développement d'un protocole d'isolement fiable et d'isolement primaire du fibroblaste lui-même : le degré de difficulté de la méthode (surtout pour les débutants), le risque de contamination bactérienne, le temps nécessaire jusqu'à ce que les fibroblastes primaires puissent être utilisés pour des expériences, et la qualité et la viabilité cellulaires subséquentes. Dans cette étude, un protocole rapide, fiable et facile à apprendre pour isoler et culture les fibroblastes adultes primaires du cœur de souris, du poumon, du foie et du rein combinant digestion enzymatique et agitation ultrasonique est fourni.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Les fibroblastes sont des cellules plates en forme de fuseau avec de multiples processus stellate et un vaste réticulum approximatif brut1,2. Un fibroblaste moyen mesure 30 à 100 m et a une durée de vie de 57 à 3 jours1,3. La durée moyenne du cycle cellulaire des fibroblastes humains varie de 16 à 48 h selon les conditions de culture4. Il est prouvé que la capacité réplicative et la qualité fonctionnelle des fibroblastes primaires cultivés sont en corrélation négative avec l'âge du donneur, ce qui suggère que les donneurs plus jeunes (animaux ou patients) devraient être préférés si possible5,6 .

Les fibroblastes constituent un type cellulaire prédominant de la plupart des tissus du corps des mammifères. Malgré leur présence omniprésente, l'identification moléculaire des fibroblastes reste un défi7. Les fibroblastes migrent vers des tissus et des organes en développement provenant de différentes sources au cours du développement embryonnaire8. Pour cette raison, il existe une pléthore de protéines marqueurs que l'on peut trouver dans les fibroblastes alors que les protéines marqueurs uniques, qui sont présentes dans toutes les populations de fibroblastes et exclusives pour les fibroblastes, sont toujours manquantes. Ainsi, les modèles d'expression de plusieurs marqueurs reconnus sont habituellement utilisés pour identifier les fibroblastes. Parmi les marqueurs les plus reconnus sont la vimentine, la protéine de surface du fibroblaste humain (hFSP), le récepteur du domaine discoidin 2 (DDR2) et l'actine musculaire alpha lisse (SMA).

Les fibroblastes sont le type de cellule productrice de cellules productrices de matrice extracellulaire (ECM). Par conséquent, les fibroblastes maintiennent une architecture detissu ordonnée et fournissent le soutien mécanique pour les cellules voisines 1. L'équilibre entre la synthèse et la dégradation de l'ECM est un processus bien réglementé. Les changements vers la synthèse marquent le début d'un dépôt excessif d'ECM qui, s'il n'est pas terminé, conduit à la fibrose. La fibrose est médiée par les myofibroblastes, qui proviennent de fibroblastes activés subissant des changements moléculaires et phénotypiques. Une caractéristique des myofibroblastes est la sécrétion améliorée de l'ECM et des cytokines et l'expression de microfilaments arrangés par ordre9.

Les fibroblastes primaires ont été à l'honneur lors de recherches récentes portant sur la fibrose, l'inflammation des tissus et les interactions fibroblaste-cancer-cellule10,11. Cependant, pour étudier efficacement les propriétés du fibroblaste dans la santé et la maladie, il est nécessaire d'isoler les fibroblastes adultes primaires viables sur une base régulière. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour isoler les fibroblastes12,13,14. Les trois principales méthodes d'isolement de fibroblaste sont la croissance des morceaux de tissu12,digestion de tissu enzymatique15,et perfusion enzymatique des organes creux9,13,16. L'avantage de la croissance est un processus d'isolement doux sans dégradation cellulaire enzymatique. D'autre part, les cultures de croissance exigent habituellement des périodes de culture prolongées jusqu'à ce que les cellules puissent être employées pour des expériences. La digestion enzymatique commune est rapide mais comporte un risque de contamination avec d'autres types de cellules (par exemple, cellules endothéliales) ou des bactéries dans le processus d'agitation, qui est nécessaire pour dissoudre mécaniquement le tissu. En outre, ces méthodes sont souvent élaborées et nécessitent du temps et des compétences pour apprendre.

En ce qui concerne l'importance des fibroblastes primaires dans la recherche, il est encore nécessaire d'optimiser les approches existantes d'isolement cellulaire en termes de rapidité, de simplicité et de fiabilité. Ici, une nouvelle méthode d'isolement enzymatique enzymatique de fibroblaste à base d'ultrasons fournissant des cellules de haute qualité est fournie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le protocole suivant suit les directives institutionnelles de soins aux animaux de Technische Universitàt Dresde, Allemagne (Numéro de dossier : T 2014/4) ainsi que les directives internationalement acceptées de soin animal (FELASA)17. La figure 1 visualise le processus d'isolement cellulaire.

1. Préparation de la configuration, du matériel et des médias

  1. Préparer le milieu de culture cellulaire, la solution PBS, la solution de stock de mélange de collagène (reconstituer 50 mg de mélange de collagène lyophilisé dans 12 ml d'eau ultrapure stérile), et la solution de trypsine de 0,25 %.
  2. Réchauffez le milieu, le PBS et la solution trypsine à 37 oC.
  3. Préchauffer le bain d'eau à ultrasons à 37 oC.
  4. Désinfecter les forceps, une spatule en acier inoxydable, des scalpels (2 x scalpels par organe) et 2 béchers en verre avec 70% d'éthanol et placent ces matériaux sous le capot de culture cellulaire.
  5. Remplissez un bécher avec 70% d'éthanol et l'autre avec de l'eau stérile ou une solution PBS. Ces béchers sont nécessaires pour désinfecter et laver l'instrument après chaque procession d'orgue.
  6. Placer les tubes en plastique stériles de 15 ml contenant du PBS froid sur de la glace humide. Le nombre de tubes dépend du nombre d'organes dont vous voulez isoler les fibroblastes.

2. Dissection de souris et enlèvement d'organe

  1. Portez deux paires de gants l'une au-dessus de l'autre, de sorte que la première paire peut être enlevée dès que l'animal a été disséqué.
    REMARQUE : Cette procédure empêche les bactéries de la fourrure et de la peau de l'animal de se propager sur les organes.
  2. Euthanasiez la souris (p. ex., dislocation cervicale) et épinglez la carcasse avec des aiguilles à chaque membre à un tampon en polystyrène.
  3. Désinfecter la carcasse de souris à l'aide d'un vaporisateur d'éthanol à 70 %. Assurez-vous que la fourrure est trempée dans l'éthanol afin que les cheveux ne tourbillonnent pas.
  4. Couper la fourrure juste au-dessus du tractus urogénital à l'aide de forceps chirurgicaux et de ciseaux atraumatic. Couper la peau le long de la ligne médiane du point de l'incision initiale au cou (3 - 4 cm) et ajouter des coupes de soulagement aux membres.
    CAUTION: Ne pas perforer la couche musculaire à cette étape pour éviter la contamination bactérienne!
  5. Épinglez la peau sur le coussinet en mousse de polystyrène pour avoir un accès optimal à la musculature couvrant la cavité abdominale.
  6. Désinfecter la musculature abdominale deux fois en utilisant 70% d'éthanol. Laissez sécher l'éthanol avant de passer à l'étape suivante.
  7. Retirer la première paire de gants. Utilisez un nouvel ensemble stérile de forceps et de ciseaux.
  8. Ouvrez la cavité abdominale et le thorax en incisant la couche musculaire avec des ciseaux chirurgicaux pour enlever délicatement les organes de choix. Par conséquent, maintenez l'organe doucement avec des forceps chirurgicaux (ne percez pas l'organe, utilisez une pression minimale) et coupez les vaisseaux sanguins approvisionnements près du point d'entrée à l'organe avec des ciseaux.
  9. Mettez les organes dans les tubes stériles contenant du PBS froid. Fermez les tubes hermétiquement. Placer les tubes sur la glace humide jusqu'à ce qu'ils continuent avec l'étape 3.1.

3. Le mincing de tissu, la digestion et l'extraction de cellules

  1. Transférer les tubes sous le capuchon de culture cellulaire stérile.
    CAUTION: Portez une paire de gants frais et désinfectez les tubes avec 70% d'éthanol avant de les transférer sous le capot!
  2. Sortir l'organe du tube de 15 ml à l'aide de forceps stériles. Placez l'organe sur la moitié d'un plat stérile de 6 cm Petri et lavez l'organe brièvement avec du PBS pour enlever l'excès de sang. Transférer l'organe dans la seconde moitié du plat Petri, retirer l'excès de PBS.
  3. Émincer le tissu à l'aide de deux scalpels stériles. Les fragments de tissu restants ne doivent pas être plus grands que 1 - 2 mm.
  4. Transférer le tissu haché dans un nouveau tube stérile de 15 ml à l'aide de la spatule stérile et ajouter 2 ml de solution trypsine de 0,25 %. Placer le tube dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC pendant 5 min.
  5. Vortex le tube doucement (environ 1400/min) pendant 10 s.
  6. Arrêtez la réaction de trypsine sous le capot de culture cellulaire en ajoutant 4 mL de milieu de culture cellulaire contenant du FCS (Le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM), par exemple).
  7. Ajouter 250 l de solution de mélange de collagène à chaque tube contenant du cœur ou du tissu pulmonaire et 100 l pour le rein ou le foie, respectivement.
  8. Placer les tubes dans un bain d'eau à ultrasons (37 oC) et activer le sonicateur à ultrasons pendant 10 min.
    REMARQUE: Le bain d'eau à ultrasons utilisé dans ce protocole a une fréquence de fonctionnement de 35 kHz et une puissance maximale de 320 W.
  9. Vortex les tubes doucement (vers 1400/min) pendant 10 s.
  10. Placer les tubes à nouveau dans le bain d'eau à ultrasons pendant 10 min.
  11. Vortex doucement (vers 1400/min) pour 10 s.
  12. Désinfectez les tubes avec 70 % d'éthanol et transférez-les sous le capuchon de culture de cellules stériles.
  13. Filtrer la solution avec un maillage de 40 m dans un nouveau tube stérile de 15 ml.
  14. Centrifuger le tube à 500 x g pendant 5 min.
  15. Retirer le supernatant et resuspendre la boulette dans 1 ml de milieu frais.
  16. Transférer les cellules dans un récipient de culture cellulaire approprié (p. ex., plaque de 6 puits) etplacer le vaisseau dans l'incubateur de culture cellulaire pendant la nuit à 37 oC et 5 % de CO 2.
  17. Le lendemain, retirez le milieu, lavez 3 fois avec du PBS, puis ajoutez du milieu frais (le volume ajouté dépend du récipient de culture cellulaire de choix, 2 ml par puits d'une plaque de 6 puits, etc.).
  18. Changez le médium tous les deux jours.
    REMARQUE : Les fibroblastes peuvent être divisés après avoir atteint la confluence optique de 90 % (généralement après 5 à 7 jours).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La capacité de ce protocole d'isoler les fibroblastes adultes du tissu murine plein a été démontrée. Des fibroblastes viables ont été obtenus qui pourraient être utilisés pour des expériences ultérieures telles que la coloration de l'immunofluorescence ou des expériences de prolifération (figure2D-F, Figure 5A).

Les fibroblastes adultes sont des cellules plates en forme de fuseau avec de multiples processus cellulaires qui se développent généralement en monocouches12,18. Les résultats obtenus reflètent ces caractéristiques morphologiques et indiquent des différences morphologiques distinctes dans les populations de fibroblastes de différents organes (figure 2). Les fibroblastes rénaux étaient particulièrement plus petits et se développaient à des densités plus élevées que les fibroblastes cardiaques, pulmonaires ou hépatiques (figure 2).

Le panneau supérieur de la figure 3 représente le processus de maturation et de prolifération cellulaires à l'aide de fibroblastes cardiaques après l'isolement. Les cellules ont montré des taux de prolifération élevés atteignant la confluence optique de 'gt;90% après 6 '1 jours. À ce niveau de fibroblastes de confluence arrêter de proliférer18 et les cellules peuvent être divisés, en utilisant 0,25% trypsine, et transférés à de plus grands flacons de culture cellulaire pour la culture ultérieure ou des expériences.

Dans des conditions de culture cellulaire basale, les cultures de fibroblastes se composent de fibroblastes et d'une plus faible proportion de myofibroblastes19,20. Il existe plusieurs marqueurs acceptés pour identifier les fibroblastes. L'expression d'DDR2 et de la vimentine sont des marqueurs communs de fibroblaste et l'expression des microfilaments organisés de SMA indique la différenciation de myofibroblaste7,9. Une image représentative d'un myofibroblaste différencié avec des microfilaments distinctifs de SMA et des images d'aperçu représentatives pour l'abondance de filament de SMA dans le coeur, le rein, le foie et le poumon sont présentées dans la figure4. Alors que seulement 20 à 30 % des cellules isolées et cultivées par la suite exprimaient des microfilaments arrangés par ordre (indiquant la différenciation de la myofibroblaste), toutes les cellules (99 %) étaient positifs pour la vimentine et le DDR2 (figure3, panneau inférieur).

Figure 1
Figure 1 . Aperçu de la procédure d'isolement du fibroblaste. Une fois que les organes d'intérêt ont été retirés de la souris, ils sont hachés sous une hotte de culture cellulaire à l'aide de scalpels stériles. Par la suite, le tissu haché est transféré à la solution de trypsine de 0.25% pendant 5 min. Après la première digestion, la solution de mélange de collagène est ajoutée et les tubes sont transférés dans un bain à ultrasons pendant 20 min à 37 oC. Après filtration et centrifugation, le granule cellulaire peut être transféré dans un plat de culture cellulaire approprié. Après au moins 8 h à attacher, les cultures sont lavées trois fois avec PBS pour enlever les érythrocytes et les débris. Enfin, le milieu frais (DMEM, 15% FCS, 1% pénicilline/Streptomycine) est ajouté et les cellules peuvent être cultivées. Des images de l'art médical intelligent Servier ont été utilisées pour créer la figure (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 . Fibroblastes murins primaires isolés des organes pleins après 7 jours de culture primaire. A) Fibroblastes cardiaques. B) Fibroblastes pulmonaires. C) Fibroblastes rénaux. D) Fibroblastes hépatiques. Les cellules ont été cultivées en DMEM (15% FCS, 1% pénicilline/Streptomycine (PS)) à 37 oC et 5% CO2. 10x grossissement et 5.6x zoom de caméra optique ont été utilisés pour obtenir ces images. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 . Identification des fibroblastes dans la culture. A - C) Attachement et croissance des fibroblastes cardiaques pendant 4 jours. Après le lavage et le changement moyen les fibroblastes attachés développent leur forme distinctive et prolifèrent. Les cellules ont été cultivées dans DMEM (15% FCS, 1% PS). D - F) Images de coloration d'immunofluorescence des fibroblastes primaires après 7 jours de culture pour des marqueurs de fibroblastes (D), DDR2 (E) et Vimentin (F). Les noyaux étaient tachés de DAPI (bleu). Les anticorps primaires (Sigma-Aldrich) ont été dilués 1:200 dans la solution BSA de 1 % (SMA : A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-Fluor 488 a été utilisé comme anticorps secondaire. Les barres d'échelle égalent les longueurs indiquées ci-dessus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 . Images immunocytochimiques représentatives pour l'abondance de microfilament de SMA. A) Un myofibroblaste typique est affiché (magnification : 20x). B et E) Représentation des images d'aperçu de la SMA pour le cœur (B), le rein (C), le foie (D) et le poumon (E) (grossissement : 10x). Les cercles blancs indiquent les cellules représentatives qui étaient considérées comme des myofibroblastes. Les noyaux étaient tachés de DAPI (bleu). L'anticorps primaire a été dilué 1:200 dans la solution BSA de 1 % (SMA : A5228). Alexa-Fluor 488 a été utilisé comme anticorps secondaire. Les barres d'échelle égalent les longueurs indiquées ci-dessus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 . Taux de prolifération des fibroblastes murins et développement in vitro de sénescence. A) Taux de prolifération des fibroblastes murals déterminés après 7 et 14 jours de culture. Des cellules ont été récoltées et comptées avec une chambre de Buerker aux points de temps respectifs. Les résultats représentent le nombre de cellules dans 1 ml de milieu. B) La sénescence est déterminée par la présence de '-galactosidase (vert teinté). Les cellules sénescentes sont indiquées avec des cercles blancs. La barre d'échelle est égale à 50 m. Les résultats sont présentés comme étant la moyenne de SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Par rapport aux lignées cellulaires de fibroblastes immortalisées, les fibroblastes primaires offrent plusieurs avantages. Ils peuvent être isolés de manière rentable en haute qualité et en quantité. En outre, les cultures primaires offrent la possibilité d'étudier des cellules de plusieurs individus, ce qui augmente la fiabilité des résultats obtenus et diminue la probabilité de simplement étudier les artefacts de culture cellulaire. La génération continue de nouvelles cultures primaires empêche les altérations génétiques qui se produisent généralement après le passage répété21. En outre, la sénescence cellulaire22,23 ou la différenciation accrue de myofibroblaste se produisent plus fréquemment dans les cultures aux passages élevés20. À de faibles passages (2-3), le nombre basofibroblaste était d'environ 20 à 30 % (données non indiquées) et seulement 2,89 % des cellules étaient considérées comme sénescentes en fonction de l'expression de la galactosidase (figure5B). Pour cette raison, il est recommandé de passer les cultures jusqu'à un maximum de 5 fois et de les remplacer ci-après. Cela garantit des résultats fiables et reproductibles tout au long des expériences. La croissance et la prolifération optimales de fibroblaste ont été obtenues avec le milieu de culture cellulaire contenant 15% FCS au lieu de 10%. Ceci a assuré un rendement robuste de fibroblaste et une bonne viabilité de cellules après le premier passage.

Ce protocole complète les techniques existantes en termes de vitesse et de degré de difficulté. Les techniques de croissance nécessitent entre 10 et 21 jours, selon l'espèce et les tissus, jusqu'à ce que des quantités suffisantes de fibroblastes puissent être récoltées12,24. Langendorff-perfusion d'autre part est rapide (lt;5 h) mais nécessite plus de compétences manuelles et de formation. Comparé aux méthodes de surcroissance12,24 ou d'isolement fibroblaste du supernatant de Langendorff-perfusion16, ce protocole offre particulièrement aux débutants la possibilité de travailler avec les cellules primaires après un très court période de formation (2 - 3 isolements) sans l'exigence d'une grande compétence mécanique ou d'un effort technique. La contamination par les cellules non fibroblastes (p. ex. les cellules endothéliales) était négligeable parce que les fibroblastes cultivés dépassent rapidement d'autres types de cellules dans les cultures en raison de leurs taux de prolifération plus élevés25. En outre, ce protocole donne des instructions claires qui aident à éviter la contamination bactérienne, qui est un problème majeur de travail avec les cellules murineprimaires primaires. Ici, deux étapes critiques pour éviter la contamination ont été identifiées. Le premier est l'ablation d'organes. Les bactéries de fourrure de rongeur peuvent être facilement transférées aux organes si les gants et les instruments chirurgicaux ne sont pas changés après enlever la fourrure et la peau. La deuxième étape critique est le processus d'isolement lui-même. Les cellules doivent être enlevées mécaniquement de leur niche tissulaire. Dans le contexte de Langendorff-perfusion cela est réalisé par un courant continu de liquide. D'autres techniques utilisent des barres magnétiques de remuage ou des méthodes de tremblement. En particulier, le remplacement des barres magnétiques d'agitation par des ondes ultrasoniques réduit le risque de contamination bactérienne en évitant le contact physique entre l'agitateur et le lysate tissulaire. Un autre avantage du bain d'eau à ultrasons est la distribution uniforme de la chaleur aux tubes, fournissant ainsi des températures de travail optimales pour les enzymes.

En conclusion, ce protocole fournit une méthode rapide, fiable et reproductible pour isoler les fibroblastes primaires qui est idéal pour les chercheurs avancés et les premiers. Cette méthode est un ajout utile au spectre existant de techniques qui peuvent contribuer à une meilleure compréhension de la fonction du fibroblaste dans la santé et la maladie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Il n'y a pas de conflits d'intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Nous remercions Mme Romy Kempe et Mme Annett Opitz pour leur soutien technique expert. Nous remercions également M. Bjoern Binnewerg pour son soutien informatique. Ce travail a été soutenu par des subventions de a) la Faculté de médecine Carl Gustav Carus Dresden et c) Else Kr'ner-Forschungskolleg (EKFK) Faculté de médecine Carl Gustav Carus Dresde. Nous sommes reconnaissants du financement et du soutien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 mL
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 376-379 (2011).
  2. Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14, (8), 484-491 (2017).
  3. Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4, (2), 159-166 (1975).
  4. Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62, (1), 1-12 (1992).
  5. Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516, (1), 71-74 (2002).
  6. Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38, (4), 1063-1074 (2016).
  7. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  8. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  9. Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. 445098 (2018).
  10. Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102, (2), 258-269 (2014).
  11. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16, (9), 582-598 (2016).
  12. Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4, (2), (2016).
  13. Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
  14. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96, (5), 535-539 (2018).
  15. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40, (8-9), 268-277 (2004).
  16. El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80, (3), 396-406 (2008).
  17. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51, (3), 311-321 (2012).
  18. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
  19. Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (9), 4219-4223 (1996).
  20. Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 389-399 (2011).
  21. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
  22. Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6, (12), 2853-2868 (2008).
  23. Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21, (12), 1424-1435 (2015).
  24. Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47, (2), 83-88 (2011).
  25. Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185, (2), 519-528 (1989).
Isolement du fibroblaste primaire adulte à ultrasons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).More

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter