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Medicine

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

doi: 10.3791/59858 Published: July 29, 2019

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll, um primäre erwachsene Fibroblasten auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise zu isolieren, die von Anfängern (z. B. Studenten) durchgeführt werden können. Das Verfahren kombiniert enzymatische Gewebeverdauung und mechanische Agitation mit Ultraschallwellen, um primäre Fibroblasten zu erhalten. Das Protokoll kann leicht an spezifische experimentelle Anforderungen (z.B. menschliches Gewebe) angepasst werden.

Abstract

Primäre erwachsene Fibroblasten sind zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Fibrose, Fibroblasten-Wechselwirkungen und Entzündungen in allen Körpergeweben zu untersuchen. Da sich primäre Fibroblasten aufgrund der Myofibroblastendifferenzierung oder der Seneszenzinduktion nicht unbegrenzt aufteilen können, müssen regelmäßig neue Kulturen etabliert werden. Es gibt jedoch mehrere Hindernisse, die während der Prozesse der Entwicklung eines zuverlässigen Isolationsprotokolls und der primären Fibroblastenisolation selbst zu überwinden sind: der Schwierigkeitsgrad der Methode (insbesondere für Anfänger), das Risiko einer bakteriellen Kontamination, die benötigte Zeit, bis primäre Fibroblasten für Experimente verwendet werden können, und anschließende Zellqualität und Lebensfähigkeit. In dieser Studie wird ein schnelles, zuverlässiges und leicht zu erlernendes Protokoll zur Isolierung und Kultur primärer Erwachsener Fibroblasten aus Mausherz, Lunge, Leber und Niere bereitgestellt, das enzymatische Verdauung und Ultraschall-Agitation kombiniert.

Introduction

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Fibroblasten sind flache, spindelförmige Zellen mit mehreren stellaten Prozessen und einem ausgedehnten groben endoplasmatischen Retikulum1,2. Ein durchschnittlicher Fibroblasten misst 30 - 100 m und hat eine Lebensdauer von 57 x 3 Tagen1,3. Die durchschnittliche Zellzyklusdauer menschlicher Fibroblasten reicht von 16 - 48 h, abhängig von den Kulturbedingungen4. Es gibt Hinweise darauf, dass die reproduktive Kapazität und funktionelle Qualität kultivierter primärer Fibroblasten negativ mit dem Spenderalter korreliert, was darauf hindeutet, dass jüngere Spender (Tiere oder Patienten) nach Möglichkeit bevorzugt werden sollten5,6 .

Fibroblasten stellen einen vorherrschenden Zelltyp der meisten Säugetierkörpergewebe dar. Trotz ihrer allgegenwärtigen Präsenz ist die molekulare Identifizierung von Fibroblasten immer noch eine Herausforderung7. Fibroblasten wandern während der embryonalen Entwicklung zu sich entwickelnden Geweben und Organen aus verschiedenen Quellen8. Aus diesem Grund gibt es eine Fülle von Markerproteinen, die in Fibroblasten gefunden werden können, während einzigartige Markerproteine, die in jeder Fibroblastenpopulation vorhanden sind und exklusiv für Fibroblasten sind, noch fehlen. Daher werden Expressionsmuster mehrerer erkannter Marker in der Regel verwendet, um Fibroblasten zu identifizieren. Zu den bekanntesten Markern gehören Vimentin, humanes Fibroblasten-Oberflächenprotein (hFSP), Discoidin-Domänenrezeptor 2 (DDR2) und Alpha-Glattmuskel-Actin (SMA).

Fibroblasten sind der wichtigste extrazelluläre Matrix (ECM)-produzierende Zelltyp. Dabei erhalten Fibroblasten eine geordnete Gewebearchitektur und bieten mechanische Unterstützung für benachbarte Zellen1. Das Gleichgewicht zwischen ECM-Synthese und Abbau ist ein gut regulierter Prozess. Verschiebungen in Richtung Synthese markieren den Beginn einer übermäßigen ECM-Ablagerung, die, wenn sie nicht beendet wird, zu Fibrose führt. Fibrose wird durch Myofibroblasten vermittelt, die von aktivierten Fibroblasten stammen, die molekularen und phänotypischen Veränderungen unterzogen werden. Ein Markenzeichen von Myofibroblasten ist die verbesserte Sekretion von ECM und Zytokinen und die Expression von geordnetangeordneten SMA-Mikrofilamenten9.

Primäre Fibroblasten standen im Rampenlicht der jüngsten Forschung, die sich auf Fibrose, Gewebeentzündung und Fibroblasten-Krebs-Zell-Wechselwirkungen10,11konzentriert. Jedoch, um effektiv zu studieren Fibroblasten Eigenschaften in Gesundheit und Krankheit, Ist es notwendig, lebensfähige primäre erwachsene Fibroblasten auf einer regelmäßigen Basis zu isolieren. Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um Fibroblasten zu isolieren12,13,14. Die drei wichtigsten Methoden der Fibroblastenisolation sind das Auswachsen aus Gewebebrocken12, enzymatische Gewebeverdauung15, und enzymatische Perfusion von Hohlorganen9,13,16. Der Vorteil des Auswuchses ist ein schonender Isolationsprozess ohne enzymatischen Zellabbau. Auf der anderen Seite benötigen Auswachstumskulturen in der Regel längere Kulturperioden, bis Zellen für Experimente verwendet werden können. Die häufige enzymatische Verdauung ist schnell, birgt aber das Risiko einer Kontamination mit anderen Zelltypen (z. B. Endothelzellen) oder Bakterien im Rührprozess, die notwendig sind, um das Gewebe mechanisch aufzulösen. Darüber hinaus sind diese Methoden oft aufwendig und erfordern Zeit und Geschick zu lernen.

Hinsichtlich der Bedeutung primärer Fibroblasten in der Forschung besteht nach wie vor die Notwendigkeit, bestehende Zellisolationsansätze in Bezug auf Schnelligkeit, Einfachheit und Zuverlässigkeit zu optimieren. Hier wird eine neuartige Ultraschall-basierte enzymatische Fibroblasten-Isolationsmethode angeboten, die hochwertige Zellen liefert.

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Protocol

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Das folgende Protokoll folgt den institutionellen Tierpflegerichtlinien der Technischen Universität Dresden (Aktenzeichen: T 2014/4) sowie den international anerkannten Tierpflegerichtlinien (FELASA)17. Abbildung 1 visualisiert den Prozess der Zellisolierung.

1. Vorbereitung des Setups, des Materials und der Medien

  1. Bereiten Sie Zellkulturmedium, PBS-Lösung, Kollagenase-Mischstofflösung (rekonstituieren 50 mg lyophilisierte Kollagennase-Mischung in 12 ml sterilem Reinstwasser) und 0,25% Trypsinlösung.
  2. Das Medium, das PBS und die Trypsin-Lösung auf 37 °C aufwärmen.
  3. Das Ultraschall-Wasserbad auf 37 °C vorheizen.
  4. Desinfektionszange, ein Edelstahlspachtel, Skalpelle (2x Skalpelle pro Organ) und 2 Glasbecher mit 70% Ethanol und legen diese Materialien unter die Zellkulturhaube.
  5. Füllen Sie einen Becher mit 70% Ethanol und den anderen mit sterilem Wasser oder PBS-Lösung. Diese Becher sind erforderlich, um das Instrument nach jeder Orgelprozession zu desinfizieren und zu waschen.
  6. Sterile 15 ml Kunststoffrohre mit kaltem PBS auf nassem Eis aufstellen. Die Anzahl der Röhren hängt von der Anzahl der Organe ab, von denen Sie Fibroblasten isolieren möchten.

2. Maussektion und Organentfernung

  1. Tragen Sie zwei Paar Handschuhe übereinander, so dass das erste Paar entfernt werden kann, sobald das Tier seziert wurde.
    HINWEIS: Dieses Verfahren verhindert, dass sich Bakterien aus fell und hautaus über die Organe ausbreiten.
  2. Euthanisieren Sie die Maus (z. B. Zervixdislokation) und heften Sie den Kadaver mit Nadeln an jedes Glied an ein Polystyrolpad.
  3. Desinfizieren Sie die Mauskarkasse mit 70% Ethanolspray. Stellen Sie sicher, dass das Fell in Ethanol getränkt ist, damit das Haar nicht aufwirbelt.
  4. Schneiden Sie das Fell direkt über dem Urogenitaltrakt mit chirurgischen Zangen und atraumatischen Scheren. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie vom Punkt des anfänglichen Schnitts bis zum Hals (3 - 4 cm) und fügen Sie Reliefschnitte an den Gliedmaßen hinzu.
    VORSICHT: Perforieren Sie die Muskelschicht bei diesem Schritt nicht, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden!
  5. Pin die Haut an das Polystyrol-Schaumpad, um optimalen Zugang zur Muskulatur zu haben, die die Bauchhöhle bedeckt.
  6. Desinfizieren Sie die Bauchmuskulatur zweimal mit 70% Ethanol. Lassen Sie das Ethanol trocknen, bevor Sie zum nächsten Schritt weiterfahren.
  7. Entfernen Sie das erste Paar Handschuhe. Verwenden Sie einen neuen, sterilen Satz Von Zangen und Scheren.
  8. Öffnen Sie die Bauchhöhle und den Thorax, indem Sie die Muskelschicht mit einer chirurgischen Schere einschneiden, um die Organe der Wahl sanft zu entfernen. Halten Sie das Organ daher vorsichtig mit chirurgischen Zangen (das Organ nicht durchbohren, minimalen Druck verwenden) und schneiden Sie die zuliefernden Blutgefäße in der Nähe des Einstiegspunkts am Organ mit einer Schere.
  9. Legen Sie die Organe in die sterilen Schläuche, die kalte SPBS enthalten. Schließen Sie die Rohre fest. Legen Sie die Rohre auf nasses Eis, bis Sie mit Schritt 3.1 fortfahren.

3. Gewebeminzierung, Verdauung und Zellextraktion

  1. Übertragen Sie die Rohre unter die sterile Zellkulturhaube.
    VORSICHT: Tragen Sie ein frisches Paar Handschuhe und desinfizieren Sie die Schläuche mit 70% Ethanol, bevor Sie sie unter die Haube übertragen!
  2. Nehmen Sie das Organ mit steriler Zange aus dem 15 ml-Rohr. Legen Sie das Organ auf die Hälfte einer sterilen 6 cm Petrischale und waschen Sie das Organ kurz mit PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen. Übertragen Sie die Orgel auf die zweite Hälfte der Petrischale, entfernen Sie überschüssige PBS.
  3. Hacken Sie das Gewebe mit zwei sterilen Skalpellen. Die verbleibenden Gewebefragmente sollten nicht größer als 1 - 2 mm sein.
  4. Übertragen Sie das gehackte Gewebe mit dem sterilen Spachtel in ein neues steriles 15 ml-Rohr und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsinlösung hinzu. Legen Sie die Röhre 5 min bei 37 °C in einen Zellkultur-Inkubator.
  5. Wirbeln Sie das Rohr sanft (ca. 1400/min) für 10 s.
  6. Stoppen Sie die Trypsin-Reaktion unter der Zellkulturhaube, indem Sie 4 ml FCS-haltiges Zellkulturmedium (Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM), z.B.) hinzufügen.
  7. Fügen Sie jeder Röhre, die Herz- oder Lungengewebe enthält, 250 l Kollagenase-Mischlösung und für Niere bzw. Leber 100 l Kollagennase-Mischlösung hinzu.
  8. Legen Sie die Schläuche in ein Ultraschall-Wasserbad (37 °C) und aktivieren Sie den Ultraschall-Sonicator 10 min.
    HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete Ultraschall-Wasserbad hat eine Betriebsfrequenz von 35 kHz und eine maximale Leistung von 320 W.
  9. Wirbeln Sie die Rohre sanft (ca. 1400/min) für 10 s.
  10. Legen Sie die Schläuche 10 min wieder in das Ultraschall-Wasserbad.
  11. Wirbel sanft (ca. 1400/min) für 10 s.
  12. Desinfizieren Sie die Rohre mit 70% Ethanol und übertragen Sie sie unter die sterile Zellkulturhaube.
  13. Filtern Sie die Lösung mit einem 40-mm-Netz in ein neues steriles 15 ml-Rohr.
  14. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 x g für 5 min.
  15. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml frischem Medium wieder auf.
  16. Übertragen Sie die Zellen in ein geeignetes Zellkulturgefäß (z.B. 6-Well-Platte) und legen Sie das Gefäßüber Nacht bei 37 °C und 5% CO2 in den Zellkultur-Inkubator.
  17. Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium, waschen Sie 3 mal mit PBS, dann fügen Sie frisches Medium hinzu (das zusätzliche Volumen hängt vom Zellkulturgefäß der Wahl ab, 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte usw.).
  18. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag.
    HINWEIS: Fibroblasten können nach Erreichen des optischen Zusammenflusses von 90% (in der Regel nach 5-7 Tagen) geteilt werden.

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Representative Results

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Die Fähigkeit dieses Protokolls, erwachsene Fibroblasten aus festem murinen Gewebe zu isolieren, wurde nachgewiesen. Es wurden lebensfähige Fibroblasten erhalten, die für nachfolgende Experimente wie Immunfluoreszenzfärbung oder Proliferationsexperimente verwendet werden konnten (Abbildung 2D-F, Abbildung 5A).

Erwachsene Fibroblasten sind flache spindelförmige Zellen mit mehreren zellulären Prozessen, die typischerweise in Monolayern wachsen12,18. Die erzielten Ergebnisse spiegeln diese morphologischen Merkmale wider und deuten auf deutliche morphologische Unterschiede in Fibroblastenpopulationen verschiedener Organe hin (Abbildung 2). Nierenfibroblasten waren besonders kleiner und wuchsen mit höheren Dichten als Herz-, Lungen- oder Leberfibroblasten (Abbildung 2).

Das obere Panel von Abbildung 3 zeigt den Prozess der Zellreifung und Proliferation am Beispiel von Herz-Fibroblasten nach der Isolierung. Die Zellen zeigten hohe Proliferationsraten, die nach 6 bis 1 Tagen einen optischen Zusammenfluss von >90 % erreichten. Auf dieser Ebene der Konfluenz stoppen Fibroblasten 18 zu vermehren und die Zellen können geteilt werden, mit 0,25% Trypsin, und übertragen, um größere Zellkulturkolben für nachfolgende Kultur oder Experimente.

Unter Basalzellkulturbedingungen bestehen Fibroblastenkulturen aus Fibroblasten und einem kleineren Anteil an Myofibroblasten19,20. Es gibt mehrere akzeptierte Marker, um Fibroblasten zu identifizieren. DDR2- und Vimentin-Expression sind häufige Fibroblasten-Marker und die Expression von organisierten SMA-Mikrofilamenten weist auf die Myofibroblast-Differenzierung7,9hin. Abbildung 4zeigt ein repräsentatives Bild eines differenzierten Myofibroblasten mit markanten SMA-Mikrofilamenten und repräsentativen Übersichtsbildern für die Fülle von SMA-Filamenten in Herz, Niere, Leber und Lunge. Während nur etwa 20 - 30% der isolierten und anschließend kultivierten Zellen geordnet angeordnete SMA-Mikrofilamente exprimierten (was auf eine Myofibroblastendifferenzierung hindeutet), alle Zellen (ca. 99%) waren positiv für vimentin und DDR2 (Abbildung 3, untere Platte).

Figure 1
Abbildung 1 . Überblick über das Fibroblasten-Isolationsverfahren. Nachdem die von Interesse befindlichen Organe aus der Maus entfernt wurden, werden sie unter einer Zellkulturhaube mit sterilen Skalpellen gehackt. Anschließend wird das gehackte Gewebe in eine 0,25% Trypsinlösung für 5 min übertragen. Nach der ersten Verdauung wird eine Kollagenase-Mischlösung zugegeben und die Röhrchen für 20 min bei 37 °C in ein Ultraschallbad überführt. Nach Filtration und Zentrifugation kann das Zellpellet in eine geeignete Zellkulturschale übertragen werden. Nach mindestens 8 h zu befestigen, werden die Kulturen dreimal mit PBS gewaschen, um Erythrozyten und Schutt zu entfernen. Schließlich wird frisches Medium (DMEM, 15% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin) zugegeben und die Zellen können kultiviert werden. Bilder von Servier smart medizinische Kunst wurden verwendet, um die Figur zu schaffen (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 . Primäre murine Fibroblasten isoliert aus festen Organen nach 7 Tagen Primärkultur. A) Herzfibroblasten. B) Lungenfibroblasten. C) Renale Fibroblasten. D) Hepatische Fibroblasten. Die Zellen wurden in DMEM (15% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin (PS)) bei37 °C und 5% CO2 kultiviert. Zur Gewinnung dieser Bilder wurden 10-fache Vergrößerung und 5,6-facher optischer Kamerazoom verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 . Identifizierung von Fibroblasten in der Kultur. A - C) Anhaftung und Wachstum von Herz-Fibroblasten für 4 Tage. Nach dem Waschen und Mittelwechsel entwickeln die angeschlossenen Fibroblasten ihre unverwechselbare Form und vermehren sich. Die Zellen wurden in DMEM kultiviert (15% FCS, 1% PS). D - F) Immunfluoreszenz-Färbungsbilder von primären Fibroblasten nach 7 Tagen Kultur für Fibroblasten-Marker SMA (D), DDR2 (E) und Vimentin (F). Die Kerne waren mit DAPI (blau) befleckt. Primäre Antikörper (Sigma-Aldrich) wurden 1:200 in 1% BSA-Lösung verdünnt (SMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-Fluor 488 wurde als Sekundärantikörper verwendet. Die Skalenbalken entsprechen den angegebenen Längen oben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 . Repräsentative immunzytochemische Bilder für die Fülle von SMA-Mikrofilamenten. A) Ein typischer Myofibroblast wird angezeigt (Vergrößerung: 20x). B – E) Repräsentative SMA-Übersichtsbilder für Herz (B), Niere (C), Leber (D) und Lunge (E) (Vergrößerung: 10x). Die weißen Kreise weisen auf repräsentative Zellen hin, die als Myofibroblasten betrachtet wurden. Die Kerne waren mit DAPI (blau) befleckt. Der primäre Antikörper wurde 1:200 in 1% BSA-Lösung verdünnt (SMA: A5228). Alexa-Fluor 488 wurde als Sekundärantikörper verwendet. Die Skalenbalken entsprechen den angegebenen Längen oben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 . Proliferationsraten von murinen Fibroblasten und In-vitro-Seneszenzentwicklung. A) Proliferationsrate von murinen Fibroblasten nach 7 und 14 Tagen Kultur bestimmt. Die Zellen wurden geerntet und mit einer Buerkerkammer zu den jeweiligen Zeitpunkten gezählt. Die Ergebnisse stellen die Zellzahl in 1 ml Medium dar. B) Die Seneszenz wird durch das Vorhandensein von '-galactosidase (grün gefleckt) bestimmt. Seneszenzzellen werden mit weißen Kreisen angezeigt. Der Maßstabsbalken entspricht 50 'm. Die Ergebnisse werden als Mittelwert dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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Im Vergleich zu verewigten Fibroblasten-Zelllinien bieten primäre Fibroblasten mehrere Vorteile. Sie lassen sich kostengünstig in hoher Qualität und Quantität isolieren. Darüber hinaus bieten Primärkulturen die Möglichkeit, Zellen von mehreren Individuen zu untersuchen, was die Zuverlässigkeit der erhaltenen Ergebnisse erhöht und die Wahrscheinlichkeit verringert, nur Zellkulturartefakte zu studieren. Kontinuierliche Erzeugung neuer Primärkulturen verhindert genetische Veränderungen, die häufig nach wiederholter Passage auftreten21. Zusätzlich treten zelluläre Seneszenz22,23 oder erhöhte Myofibroblastendifferenzierung häufiger in Kulturen an hohen Passagen20auf. Bei niedrigen Passagen (2-3) betrug die Basalmyofibroblastenzahl etwa 20 - 30% (Daten nicht gezeigt) und nur 2,89% der Zellen wurden als seneszierend auf der Grundlage der Expression von '-Galactosidase ' betrachtet (Abbildung 5B). Aus diesem Grund wird empfohlen, die Kulturen bis maximal 5 Mal zu durchziehen und sie im Folgenden zu ersetzen. Dies garantiert zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse während der gesamten Experimente. Optimales Fibroblastenwachstum und -proliferation wurden mit einem Zellkulturmedium mit 15% FCS statt 10% erreicht. Dies sorgte für eine robuste Fibroblastenausbeute und eine gute Zelllebensfähigkeit nach dem ersten Durchgang.

Dieses Protokoll ergänzt die bestehenden Techniken in Bezug auf Geschwindigkeit und Schwierigkeitsgrad. Auswuchstechniken benötigen je nach Art und Gewebe zwischen 10 - 21 Tage, bis ausreichende Mengen an Fibroblasten geerntet werden können12,24. Langendorff-Perfusion hingegen ist schnell (<5 h), erfordert aber mehr handwerkliches Geschick und Training. Im Vergleich zu den Auswuchsmethoden12,24 oder der Fibroblastenisolation vom Überstand der Langendorff-Perfusion16bietet dieses Protokoll insbesondere Anfängern die Möglichkeit, nach einer sehr kurzen Ausbildungszeit (2 - 3 Isolationen) ohne hohe mechanische Qualifikation oder technischen Aufwand. Die Kontamination mit Nicht-Fibroblasten -Zellen (z. B. Endothelzellen) war vernachlässigbar, da kultivierte Fibroblasten aufgrund ihrer höheren Proliferationsraten schnell andere Zelltypen in Kulturen überwuchern25. Darüber hinaus gibt dieses Protokoll klare Anweisungen, die helfen, bakterielle Kontamination zu vermeiden, was ein großes Problem bei der Arbeit mit primären murinen Zellen ist. Hier wurden zwei entscheidende Schritte zur Vermeidung von Kontaminationen identifiziert. Die erste ist die Organentfernung. Nagetierfellbakterien können leicht auf die Organe übertragen werden, wenn die Handschuhe und chirurgischen Instrumente nach dem Entfernen des Fells und der Haut nicht verändert werden. Der zweite kritische Schritt ist der Isolationsprozess selbst. Die Zellen müssen mechanisch aus ihrer Gewebenische entfernt werden. Im Rahmen der Langendorff-Perfusion wird dies durch einen kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom realisiert. Andere Techniken verwenden magnetische Rührstäbe oder Schütteltechniken. Insbesondere der Austausch magnetischer Rührstäbe durch Ultraschallwellen reduziert das Risiko einer bakteriellen Kontamination, indem ein physischer Kontakt zwischen Rührer und Gewebelysat vermieden wird. Ein weiterer Vorteil des Ultraschall-Wasserbades ist die gleichmäßige Verteilung der Wärme auf die Röhren, wodurch optimale Arbeitstemperaturen für die Enzyme zur Verfügung gestellt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine schnelle, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung primärer Fibroblasten bietet, die sowohl für fortgeschrittene als auch für fortgeschrittene Forscher ideal ist. Diese Methode ist eine nützliche Ergänzung zum bestehenden Spektrum von Techniken, die zu einem besseren Verständnis der Fibroblastenfunktion bei Gesundheit und Krankheit beitragen können.

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Disclosures

Es gibt keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Wir danken Frau Romy Kempe und Frau Annett Opitz für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken auch Herrn Bjoern Binnewerg für die IT-Unterstützung. Unterstützt wurde diese Arbeit durch Stipendien des Förderkreises Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Dresden und c) Else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Dresden. Wir sind dankbar für die Finanzierung und die Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 mL
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

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References

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Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation
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Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).More

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

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