Summary
Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).
Abstract
Os fibroblastos adultos primários tornaram-se uma importante ferramenta para estudar fibrose, interações fibroblásticas e inflamação em todos os tecidos do corpo. Desde que os fibroblastos preliminares não podem dividir indefinidamente devido à diferenciação do Miofibroblasto ou à indução da senescência, as culturas novas devem ser estabelecidas regularmente. No entanto, existem vários obstáculos a superar durante os processos de desenvolvimento de um protocolo de isolamento confiável e isolamento primário de fibroblastos: o grau de dificuldade do método (especialmente para iniciantes), o risco de contaminação bacteriana, o tempo necessário até que os fibroblastos primários possam ser utilizados para experimentos, e subsequente qualidade e viabilidade celular. Neste estudo, um protocolo rápido, confiável e fácil de aprender para isolar e cultura fibroblastos adultos primários do coração do mouse, pulmão, fígado e rim combinando digestão enzimática e agitação ultra-sônica é fornecido.
Introduction
Os fibroblastos são células planas, em forma de fuso, com múltiplos processos de stellate e um retículo endoplasmático áspero1,2. Um fibroblasto médio mede 30-100 μm e tem uma esperança de vida de 57 ± 3 dias1,3. A duração média do ciclo celular de fibroblastos humanos varia de 16-48 h, dependendo das condições de cultura4. Há evidências de que a capacidade replicativa e a qualidade funcional dos fibroblastos primários cultivados se correlacionam negativamente com a idade do doador, sugerindo que os doadores mais jovens (animais ou pacientes) devam ser preferidos se possível5,6 .
Os fibroblastos constituem um tipo de célula predominante da maioria dos tecidos corporais de mamíferos. Apesar de sua presença onipresente, a identificação molecular dos fibroblastos ainda é um desafio7. Os fibroblastos migram para desenvolver tecidos e órgãos de diferentes fontes durante o desenvolvimento embrionário8. Por esta razão, há uma pletora de proteínas do marcador que podem ser encontradas nos fibroblasto visto que as proteínas originais do marcador, que estão atuais em cada população do fibroblasto e exclusivas para fibroblastos, são ainda ausentes. Assim, os padrões de expressão de vários marcadores reconhecidos são geralmente usados para identificar fibroblastos. Entre os marcadores mais reconhecidos estão vimentina, proteína de superfície fibroblástica humana (hfsp), receptor de domínio filhote 2 (DDR2) e actina de músculo liso alfa (αsma).
Os fibroblastos são os principais tipos de células produtoras de matriz extracelular (ECM). Assim, os fibroblastos mantêm uma arquitetura de tecido ordenada e fornecem suporte mecânico para as células vizinhas1. O equilíbrio entre a síntese e a degradação do ECM é um processo bem regulado. Os deslocamentos para a síntese marcam o começo do depósito excessivo do ECM que, se não terminado, conduz à fibrose. A fibrose é mediada por miofibroblastos, que se originam de fibroblastos ativados submetidos a alterações moleculares e fenotípicas. Uma indicação dos miofibroblastos é secretion realçado do ECM e dos citocinas e a expressão de microfilamentos arranjados ordenadamente de αsma9.
Os fibroblastos primários têm sido os holofotes de pesquisas recentes com foco em fibrose, inflamação tecidual e interações fibroblastos-câncer-células10,11. Entretanto, para estudar eficazmente Propriedades do fibroblasto na saúde e na doença, é necessário isolar fibroblastos adultos preliminares viáveis em uma base regular. Existem vários métodos disponíveis para isolar os fibroblastos12,13,14. Os três principais métodos de isolamento de fibroblastos são o crescimento dos pedaçosde tecido12, a digestão enzimática do tecido15e a perfusão enzimática de órgãos ocos9,13,16. A vantagem do crescimento é um processo de isolamento suave sem degradação celular enzimática. De um lado, as culturas do conseqüência exigem geralmente períodos prolongados da cultura até que as pilhas possam ser usadas para experiências. A digestão enzimática comum é rápida, mas tem um risco de contaminação com outros tipos de células (por exemplo, células endoteliais) ou bactérias no processo de agitação, o que é necessário para dissolver mecanicamente o tecido. Além disso, esses métodos são muitas vezes elaborados e exigem tempo e habilidade para aprender.
Em relação à importância dos fibroblastos primários na pesquisa, ainda há a necessidade de otimizar as abordagens de isolamento de células existentes em termos de rapidez, simplicidade e confiabilidade. Aqui, um novo método de isolamento de fibroblastos enzimáticos baseados em ultra-som que fornece células de alta qualidade é fornecido.
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Protocol
O seguinte protocolo segue as diretrizes institucionais de cuidados com os animais da Technische Universität Dresden, Alemanha (número do arquivo: T 2014/4), bem como as diretrizes de cuidados com os animais internacionalmente aceites (FELASA)17. A Figura 1 visualiza o processo de isolamento da célula.
1. preparando a configuração, material e mídia
- Prepare o meio de cultura celular, solução de PBS, solução de estoque de mistura de colagenase (reconstituir 50 mg de mistura de colagenase liofilizada em 12 ml de água ultrapura estéril) e solução de tripsina de 0,25%.
- Aqueça o meio, a PBS e a solução de tripsina para 37 ° c.
- Pré-aqueça o banho de água Ultrassônico a 37 ° c.
- Desinfete fórceps, uma espátula de aço inoxidável, bipéis (2x bipels por órgão) e 2 copos de vidro com 70% de etanol e coloque esses materiais a capa de cultura celular.
- Encha um copo com 70% de etanol e outro com água estéril ou solução de PBS. Estes copos são obrigados a desinfectar e lavar o instrumento após cada procissão de órgão.
- Coloque tubos de plástico estéreis de 15 mL contendo PBS frio em gelo molhado. O número de tubos depende do número de órgãos que você deseja isolar os fibroblastos.
2. dissecção do rato e remoção de órgãos
- Use dois pares de luvas um acima do outro, assim que o primeiro par pode ser removido assim que o animal for dissecado.
Nota: este procedimento impede que as bactérias do animal peles e pele de espalhar sobre os órgãos. - Eutanizar o rato (por exemplo, luxação cervical) e fixar a carcaça com agulhas para cada membro a uma almofada de poliestireno.
- Desinfete a carcaça do rato usando 70% de spray de etanol. Certifique-se que a pele está encharcada em etanol para que o cabelo não vai girar para cima.
- Corte a pele direita acima do trato urogenital usando fórceps cirúrgico e tesouras atraumatic. Corte a pele ao lado da linha do meio desde o ponto da incisão inicial até o pescoço (3-4 cm) e adicione cortes de alívio nos membros.
Cuidado: não perfurar a camada muscular nesta etapa para evitar a contaminação bacteriana! - Fixe a pele à almofada da espuma de poliestireno para ter o acesso óptimo à musculatura que cobre a cavidade abdominal.
- Desinfecte a musculatura abdominal duas vezes usando 70% de etanol. Deixe o etanol secar antes de prosseguir para o próximo passo.
- Retire o primeiro par de luvas. Use um novo, estéril conjunto de fórceps e tesouras.
- Abra a cavidade abdominal e o tórax, incitando a camada muscular com tesoura cirúrgica para remover suavemente os órgãos de escolha. Portanto, segure o órgão suavemente com fórceps cirúrgico (não furar o órgão, usar a pressão mínima) e cortar os vasos sanguíneos de fornecimento perto do ponto de entrada no órgão com tesouras.
- Coloque os órgãos nos tubos estéreis contendo PBS frio. Feche os tubos firmemente. Coloque os tubos em gelo molhado até continuar com a etapa 3,1.
3. tecido mincing, digestão e extração celular
- Transfira os tubos a capa estéril da cultura de pilha.
Cuidado: usar um par de luvas frescas e desinfectar os tubos com 70% de etanol antes de transferi-los o capô! - Leve o órgão para fora do tubo de 15 mL usando fórceps estéril. Coloque o órgão em uma metade de um prato de Petri estéril de 6 cm e lave o órgão brevemente com PBS para remover o excesso de sangue. Transfira o órgão para a segunda metade do prato de Petri, retire o excesso de PBS.
- Mince o tecido usando dois bipels estéreis. Os fragmentos restantes do tecido não devem ser maiores do que 1-2 milímetros.
- Transfira o tecido picado para um novo tubo estéril de 15 mL utilizando a espátula estéril e adicione 2 mL de solução de tripsina a 0,25%. Coloc o tubo em uma incubadora da cultura de pilha em 37 ° c por 5 minutos.
- Vórtice do tubo suavemente (circa 1400/min) para 10 s.
- Pare a reação da tripsina a capa de cultura celular adicionando 4 mL de meio de cultura de células contendo FCS (meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM), por exemplo).
- Adicionar 250 μL de solução de mistura de colagenases a cada tubo contendo tecido cardíaco ou pulmonar e 100 μL para rim ou fígado, respetivamente.
- Coloque os tubos em um banho de água Ultrassônico (37 ° c) e ative o sonicador ultra-sônico por 10 min.
Nota: o banho de água Ultrassônico utilizado neste protocolo tem uma frequência de operação de 35 kHz e uma potência máxima de 320 W. - Vórtice os tubos suavemente (circa 1400/min) para 10 s.
- Coloque os tubos novamente no banho de água ultra-sônica por 10 min.
- Vortex suavemente (cerca de 1400/min) para 10 s.
- Desinfete os tubos com 70% de etanol e transfira-os a capa de cultura celular estéril.
- Filtre a solução com uma malha de 40 μm em um novo tubo estéril de 15 mL.
- Centrifugue o tubo a 500 x g durante 5 min.
- Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet em 1 mL de meio fresco.
- Transfira as pilhas em uma embarcação apropriada da cultura da pilha (por exemplo, placa de 6 poços) e coloc a embarcação na incubadora da cultura da pilha durante a noite em 37 ° c e em 5% CO2.
- No dia seguinte, retire o meio, lave 3 vezes com PBS, em seguida, adicione o meio fresco (o volume adicionado depende da embarcação de cultura de células de escolha, 2 mL por poço de uma placa de 6 poços, etc.).
- Mude o meio a cada outro dia.
Nota: os fibroblastos podem ser divididos depois de atingir a confluência óptica de 90% (geralmente após 5-7 dias).
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Representative Results
A habilidade deste protocolo de isolar fibroblasto adultos do tecido murino contínuo foi demonstrada. Foram obtidos fibroblastos viáveis que poderiam ser utilizados para experimentos subsequentes, como coloração por imunofluorescência ou experimentos de proliferação (Figura 2D-F, Figura 5A).
Os fibroblastos adultos são células planas em forma de eixo com múltiplos processos celulares que tipicamente crescem em monocamada12,13. Os resultados obtidos refletem essas características morfológicas e indicam diferenças morfológicas distintas em populações de fibroblastos de diferentes órgãos (Figura 2). Os fibroblastos renais foram especialmente menores e cresceram em densidades mais elevadas que os fibroblastos cardíacos, pulmonares ou hepáticos (Figura 2).
O painel superior da Figura 3 retrata o processo de maturação e proliferação celular por meio do exemplo de fibroblastos cardíacos após o isolamento. As células exibiam altas taxas de proliferação atingindo confluência óptica de > 90% após 6 ± 1 dia. Neste nível de confluência, os fibroblastos param para proliferar18 e as células podem ser divididas, usando 0,25% de tripsina, e transferidas para frascos de cultura de células maiores para cultura ou experimentos subsequentes.
condições da cultura da pilha básica, as culturas do fibroblasto consistem nos fibroblasto e em uma proporção menor dos miofibroblastos19,20. Existem vários marcadores aceitos para identificar fibroblastos. A expressão de DDR2 e de Vimentin são marcadores comuns do fibroblasto e a expressão de microfilamentos organizados do αsma indica a diferenciação do Miofibroblasto7,9. Uma imagem representativa de um Miofibroblasto diferenciado com microfilamentos distintivos de αsma e imagens de visão geral representativas para a abundância de filamento de αsma no coração, rim, fígado e pulmão são apresentados na Figura 4. Enquanto apenas cerca de 20-30% das células isoladas e subsequentemente cultivadas expressaram microfilamentos de αSMA organizados ordenadamente (indicando diferenciação miofibroblástica), todas as células (≈ 99%) foram positivas para vimentina e DDR2 (Figura 3, painel inferior).
Figura 1 . Visão geral do procedimento de isolamento de fibroblastos. Depois que os órgãos do interesse foram removidos do rato, são triturados uma capa da cultura da pilha usando Scalpels estéreis. Subsequentemente, o tecido picado é transferido para 0,25% de solução de tripsina por 5 min. Após a primeira digestão, a solução de mistura de colagenase é adicionada e os tubos são transferidos para um banho Ultrassônico por 20 min a 37 ° c. Após a filtração e a centrifugação, a pelota da pilha pode ser transferida em um prato apropriado da cultura da pilha. Depois de pelo menos 8 h para anexar, as culturas são lavadas três vezes com PBS para remover eritrócitos e detritos. Finalmente, o meio fresco (DMEM, 15% FCS, 1% penicilina/estreptomicina) é adicionado e as células podem ser cultivadas. As imagens da arte médica esperta de Servier foram usadas para criar a figura (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Fibroblastos murinos primários isolados de órgãos sólidos após 7 dias de cultura primária. A) fibroblastos cardíacos. B) fibroblastos pulmonares. C) fibroblastos renais. D) fibroblastos hepáticos. As células foram cultivadas em DMEM (15% FCS, 1% de penicilina/estreptomicina (PS)) a 37 ° c e 5% CO2. a ampliação 10x e o zumbido da câmera óptica 5.6 x foram usados para obter estas imagens. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Identificação de fibroblastos na cultura. A-C) apego e crescimento de fibroblastos cardíacos por 4 dias. Após a lavagem e a mudança média os fibroblastos anexados desenvolvem sua forma distintiva e proliferam. As células foram cultivadas em DMEM (15% FCS, 1% PS). D-F) Imunofluorescência que mancha imagens de fibroblastos preliminares após 7 dias da cultura para os marcadores do fibroblasto αSMA (D), DDR2 (E) e Vimentin (F). Os núcleos foram corados com DAPI (azul). Os anticorpos primários (Sigma-Aldrich) foram diluídos 1:200 em solução de BSA 1% (αSMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). O Alexa-fluor 488 foi utilizado como anticorpo secundário. As barras de escala são iguais aos comprimentos indicados acima. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Imagens representativas de Immunocytochemical para a abundância do Microfilamento de αSMA. A) um Miofibroblasto típico é indicado (ampliação: 20x). B – E) Imagens de síntese de αSMA representativas para o coração (B), rim (C), fígado (D) e pulmão (E) (ampliação: 10x). Os círculos brancos indicam as pilhas representativas que foram consideradas myofibroblasts. Os núcleos foram corados com DAPI (azul). O anticorpo preliminar foi diluído 1:200 na solução de BSA de 1% (αSMA: A5228). O Alexa-fluor 488 foi utilizado como anticorpo secundário. As barras de escala são iguais aos comprimentos indicados acima. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Taxas de proliferação de fibroblastos murinos e desenvolvimento de senescência in vitro. A) taxa de proliferação de fibroblastos murinos determinados após 7 e 14 dias de cultura. As células foram colhidas e contadas com uma câmara de Buerker nos respectivos pontos temporais. Os resultados representam a contagem de células em 1 mL de meio. B) a senescência é determinada pela presença de β-galactosidase (verde manchado). As células senescentes são indicadas com círculos brancos. A barra de escala é igual a 50 μm. os resultados são apresentados como média ± SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Comparado às linhas de pilha imortalizado do fibroblasto, os fibroblastos preliminares oferecem diversas vantagens. Eles podem ser isolados custo efetivamente em alta qualidade e quantidade. Além disso, as culturas primárias oferecem a possibilidade de estudar células de múltiplos indivíduos, o que aumenta a confiabilidade dos resultados obtidos e diminui a probabilidade de meramente estudar artefatos de cultura celular. A geração contínua de novas culturas primárias previne alterações genéticas que comumente ocorrem após a repetição do de21. Adicionalmente, a senescência celular22,23 ou a diferenciação aumentada do Miofibroblasto ocorrem mais freqüentemente nas culturas em passagens elevadas20. Em passagens baixas (2-3), a contagem basal de miofibroblastos foi de aproximadamente 20-30% (dados não mostrados) e apenas 2,89% das células foram consideradas senescentes com base na expressão de β-galactosidase (Figura 5B). Por esta razão, recomenda-se a passagem das culturas até 5 vezes máximo e para substituí-los a seguir. Isso garante resultados confiáveis e replicáveis ao longo dos experimentos. O crescimento e a proliferação óptimos do fibroblasto foram obtidos com o meio de cultura da pilha que contem 15% FCS em vez de 10%. Isto garantiu um rendimento robusto do fibroblasto e uma boa viabilidade da pilha após a primeira passagem.
Este protocolo complementa as técnicas existentes em termos de velocidade e grau de dificuldade. As técnicas do outgrowth exigem entre 10-21 dias, dependendo da espécie e do tecido, até que as quantidades suficientes de fibroblastos possam ser colhidas12,24. Langendorff-perfusão por outro lado é rápido (< 5 h), mas requer mais habilidade manual e treinamento. Comparado aos métodos do conseqüência12,24 ou isolação do fibroblasto do sobrenadante de Langendorff-perfusão16, este protocolo oferece especial novatos a oportunidade de trabalhar com pilhas preliminares após um muito curto período de treinamento (2-3 isolamentos) sem a exigência da habilidade mecânica elevada ou do esforço técnico. A contaminação com células não fibroblastos (por exemplo, células endoteliais) foi insignificante porque os fibroblastos cultivados rapidamente sobrecrescem outros tipos de células em culturas devido às suas maiores taxas de proliferação25. Adicionalmente, este protocolo dá instruções desobstruídas que ajudam a evitar a contaminação bacteriana, que é um problema principal que trabalha com pilhas murino preliminares. Aqui, foram identificadas duas etapas críticas para evitar a contaminação. O primeiro é a remoção de órgãos. As bactérias da pele do roedor podem fàcilmente ser transferidas aos órgãos se as luvas e os instrumentos cirúrgicos não forem mudados após ter removido a pele e o Skin. O segundo passo crítico é o próprio processo de isolamento. As células têm de ser removidas mecanicamente do seu nicho de tecido. No contexto de Langendorff-perfusão isto é realizado por uma corrente contínua do líquido. Outras técnicas usam barras de agitação magnética ou métodos de agitação. Particularmente, a recolocação de barras de agitação magnéticas por ondas ultra-sônicas reduz o risco de contaminação bacteriana evitando o contato físico entre o agitador e o Lysate do tecido. Uma vantagem adicional do banho de água ultra-sônico é a distribuição uniforme de calor para os tubos, proporcionando assim temperaturas de trabalho ideais para as enzimas.
Em conclusão, este protocolo fornece um método rápido, de confiança e replicável para isolar os fibroblastos preliminares que é ideal para investigadores avançados e do cedo-estágio. Este método é uma adição útil ao espectro existente das técnicas que podem contribuir a uma compreensão melhor da função do fibroblasto na saúde e na doença.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Sra. Romy Kempe e a Sra. Annett Opitz pelo apoio técnico especializado. Agradecemos também ao Sr. Bjoern Binnewerg por ele apoiar. Este trabalho foi apoiado por subvenções de a) o Förderkreis Dresdner Herz-kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", faculdade de medicina Carl Gustav Carus Dresden e c) else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) faculdade de medicina Carl Gustav Carus Dresden. Agradecemos o financiamento e o apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
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