Summary
Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).
Abstract
Los fibroblastos adultos primarios se han convertido en una herramienta importante para estudiar la fibrosis, las interacciones con los fibroblastos y la inflamación en todos los tejidos del cuerpo. Dado que los fibroblastos primarios no pueden dividirse indefinidamente debido a la diferenciación de miofibroblastos o a la inducción de la senescencia, se deben establecer periódicamente nuevos cultivos. Sin embargo, hay varios obstáculos que superar durante los procesos de desarrollo de un protocolo de aislamiento fiable y el aislamiento primario de fibroblastos en sí: el grado de dificultad del método (especialmente para principiantes), el riesgo de contaminación bacteriana, el tiempo necesario hasta que los fibroblastos primarios se puedan utilizar para experimentos, y la posterior calidad celular y viabilidad. En este estudio, se proporciona un protocolo rápido, confiable y fácil de aprender para aislar y cultivar fibroblastos adultos primarios del corazón del ratón, pulmón, hígado y riñón combinando digestión enzimática y agitación ultrasónica.
Introduction
Los fibroblastos son células planas en forma de husillo con múltiplesprocesos estelares y un extenso retículo endoplasmático áspero 1,2. Un fibroblasto medio mide 30 - 100 m y tiene una vida útil de 57 a 3 días1,3. La duración media del ciclo celular de los fibroblastos humanos oscila entre 16 y 48 h dependiendo de las condiciones de cultivo4. Existe evidencia de que la capacidad replicativa y la calidad funcional de los fibroblastos primarios cultivados se correlacionan negativamente con la edad del donante, lo que sugiere que se debe preferir a los donantes más jóvenes (animales o pacientes) si es posible5,6 .
Los fibroblastos constituyen un tipo celular predominante de la mayoría de los tejidos corporales de mamíferos. A pesar de su presencia omnipresente, la identificaciónmolecular de los fibroblastos sigue siendo un desafío 7. Los fibroblastos migran a desarrollar tejidosy órganos de diferentes fuentes durante el desarrollo embrionario 8. Por esta razón, hay una plétora de proteínas marcadoras que se pueden encontrar en los fibroblastos, mientras que las proteínas marcadoras únicas, que están presentes en cada población de fibroblastos y exclusivas de los fibroblastos, todavía faltan. Por lo tanto, los patrones de expresión de varios marcadores reconocidos se utilizan generalmente para identificar fibroblastos. Entre los marcadores más reconocidos se encuentran la vimentina, la proteína superficial de fibroblastohumano humano (hFSP), el receptor de dominio de discoicina 2 (DDR2) y la actina muscular alfa suave (SMA).
Los fibroblastos son el tipo de célula que produce la matriz extracelular principal (ECM). De este tipo, los fibroblastos mantienen una arquitectura de tejido ordenada y proporcionan soporte mecánico para las células vecinas1. El equilibrio entre la síntesis y la degradación de ECM es un proceso bien regulado. Los cambios hacia la síntesis marcan el comienzo de una deposición excesiva de ECM que, si no se termina, conduce a la fibrosis. La fibrosis está mediada por miofibroblastos, que se originan a partir de fibroblastos activados sometidos a cambios moleculares y fenotípicos. Una característica distintiva de los miofibroblastos es la secreción mejorada de ECM y citoquinas y la expresión de microfilamentos ordenados de la ACM9.
Los fibroblastos primarios han estado en el centro de atención de investigaciones recientes centradas en la fibrosis, la inflamación de los tejidos y las interacciones fibroblastos-cáncer-células10,11. Sin embargo, para estudiar eficazmente las propiedades de los fibroblastos en la salud y la enfermedad, es necesario aislar los fibroblastos adultos primarios viables de forma regular. Existen varios métodos disponibles para aislar fibroblastos12,13,14. Los tres principales métodos de aislamiento de fibroblastos son el crecimiento de los trozos de tejido12,la digestión de tejido enzimático15,y la perfusión enzimática de órganos huecos9,13,16. La ventaja del crecimiento es un proceso de aislamiento suave sin degradación celular enzimática. Por otro lado, los cultivos de crecimiento generalmente requieren períodos de cultivo prolongados hasta que las células se pueden utilizar para experimentos. La digestión enzimática común es rápida, pero conlleva un riesgo de contaminación con otros tipos de células (por ejemplo, células endoteliales) o bacterias en el proceso de agitación, que es necesario para disolver mecánicamente el tejido. Además, estos métodos a menudo son elaborados y requieren tiempo y habilidad para aprender.
En cuanto a la importancia de los fibroblastos primarios en la investigación, todavía es necesario optimizar los enfoques de aislamiento celular existentes en términos de rapidez, simplicidad y fiabilidad. Aquí, se proporciona un nuevo método de aislamiento de fibroblastos enzimáticos a base de ultrasonidos que proporciona células de alta calidad.
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Protocol
El siguiente protocolo sigue las directrices institucionales de cuidado de animales de la Universidad Tecnológica de Dresde, Alemania (Número de fichero: T 2014/4), así como las directrices de cuidado animal internacionalmente aceptadas (FELASA)17. La Figura 1 visualiza el proceso de aislamiento de celda.
1. Preparación de la configuración, material y medios de
- Preparar el medio de cultivo celular, solución de PBS, solución de mezcla de colagenasa (reconstituir 50 mg de mezcla de colagenasa liofilizada en 12 ml de agua ultrapura estéril) y 0.25% de solución de trippsina.
- Calentar el medio, el PBS y la solución de trippsina a 37 oC.
- Precalentar el baño de agua ultrasónica a 37 oC.
- Desinfecte fórceps, una espátula de acero inoxidable, bisturíes (2 x bisturíes por órgano) y 2 vasos de vidrio con 70% de etanol y coloque estos materiales debajo de la campana de cultivo celular.
- Llene un vaso de precipitados con 70% de etanol y el otro con agua estéril o solución de PBS. Estos vasos son necesarios para desinfectar y lavar el instrumento después de cada procesión de órgano.
- Coloque tubos de plástico estériles de 15 ml que contengan PBS frío sobre hielo húmedo. El número de tubos depende del número de órganos de los que desea aislar los fibroblastos.
2. Disección del ratón y extracción de órganos
- Use dos pares de guantes uno encima del otro, por lo que el primer par se puede quitar tan pronto como el animal ha sido diseccionado.
NOTA: Este procedimiento evita que las bacterias del pelaje y la piel del animal se propaguen sobre los órganos. - Eutanasia el ratón (p. ej., luxación cervical) y clava la carcasa con agujas en cada extremidad a una almohadilla de poliestireno.
- Desinfecte la carcasa del ratón con un 70% de pulverización de etanol. Asegúrese de que el pelaje esté empapado en etanol para que el cabello no se arremolina.
- Cortar el pelaje justo por encima del tracto urogenital usando fórceps quirúrgicos y tijeras atraumáticas. Cortar la piel junto a la línea media desde el punto de la incisión inicial hasta el cuello (3 - 4 cm) y añadir cortes de alivio en las extremidades.
ADVERTENCIA: ¡No perfore la capa muscular en este paso para evitar la contaminación bacteriana! - Anclar la piel a la almohadilla de espuma de poliestireno para tener un acceso óptimo a la musculatura que cubre la cavidad abdominal.
- Desinfectar la musculatura abdominal dos veces con 70% de etanol. Deje que el etanol se seque antes de continuar con el siguiente paso.
- Retire el primer par de guantes. Usa un nuevo conjunto estéril de fórceps y tijeras.
- Abra la cavidad abdominal y el tórax inclinando la capa muscular con tijeras quirúrgicas para eliminar suavemente los órganos de elección. Por lo tanto, sostenga el órgano suavemente con fórceps quirúrgicos (no perfore el órgano, use una presión mínima) y corte los vasos sanguíneos suministradores cerca del punto de entrada en el órgano con tijeras.
- Coloque los órganos en los tubos estériles que contienen PBS frío. Cierre bien los tubos. Coloque los tubos sobre hielo húmedo hasta que continúe con el paso 3.1.
3. Picado de tejido, digestión y extracción celular
- Transfiera los tubos debajo de la campana de cultivo celular estéril.
ADVERTENCIA: Use un par de guantes frescos y desinfecte los tubos con 70% de etanol antes de transferirlos bajo el capó! - Saque el órgano del tubo de 15 ml con fórceps estériles. Coloque el órgano en la mitad de una placa estéril de 6 cm de Petri y lave el órgano brevemente con PBS para eliminar el exceso de sangre. Transfiera el órgano a la segunda mitad de la placa de Petri, elimine el exceso de PBS.
- Mince el tejido usando dos bisturíes estériles. Los fragmentos de tejido restantes no deben ser mayores de 1 - 2 mm.
- Transfiera el tejido picado a un nuevo tubo estéril de 15 ml utilizando la espátula estéril y agregue 2 ml de solución de trippsina al 0,25%. Coloque el tubo en una incubadora de cultivo celular a 37 oC durante 5 minutos.
- Vortex el tubo suavemente (circa 1400/min) durante 10 s.
- Detenga la reacción de trippsina bajo el capó del cultivo celular agregando un medio de cultivo celular que contiene FCS de 4 ml (medio de águila modificado (DMMEM) de Dulbecco, por ejemplo).
- Añadir 250 l de solución de mezcla de colagenasa a cada tubo que contenga tejido cardíaco o pulmonar y 100 l para riñón o hígado, respectivamente.
- Colocar los tubos en un baño de agua ultrasónico (37 oC) y activar el sonicador ultrasónico durante 10 minutos.
NOTA: El baño de agua ultrasónico utilizado en este protocolo tiene una frecuencia de funcionamiento de 35 kHz y una potencia máxima de 320 W. - Vortex los tubos suavemente (circa 1400/min) durante 10 s.
- Coloque los tubos de nuevo en el baño de agua ultrasónico durante 10 minutos.
- Vórtice suavemente (circa 1400/min) durante 10 s.
- Desinfectar los tubos con 70% de etanol y transferirlos bajo la campana de cultivo celular estéril.
- Filtrar la solución con una malla de 40 m en un nuevo tubo estéril de 15 ml.
- Centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio fresco.
- Transfiera las células a un recipiente de cultivo celular adecuado (p. ej., placa de 6 pocillos) ycoloque el recipiente en la incubadora de cultivo celular durante la noche a 37 oC y 5% CO 2.
- Al día siguiente, retirar el medio, lavar 3 veces con PBS, a continuación, añadir medio fresco (el volumen añadido depende del recipiente de cultivo celular de elección, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos, etc.).
- Cambia el medio cada dos días.
NOTA: Los fibroblastos se pueden dividir después de alcanzar una confluencia óptica del 90% (generalmente después de 5-7 días).
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Representative Results
Se demostró la capacidad de este protocolo para aislar los fibroblastos adultos del tejido murino sólido. Se obtuvieron fibroblastos viables que podrían utilizarse para experimentos posteriores, como la tinción de inmunofluorescencia o experimentos de proliferación (Figura2D-F, Figura 5A).
Los fibroblastos adultos son células planas en forma de husillo con múltiples procesos celulares que normalmente crecen en monocapas12,18. Los resultados obtenidos reflejan estas señas morfológicas e indican diferencias morfológicas distintas en las poblaciones de fibroblastos de diferentes órganos (Figura2). Los fibroblastos renales fueron especialmente más pequeños y crecieron a densidades más altas que los fibroblastos cardíacos, pulmonares o hepáticos (Figura2).
El panel superior de la Figura 3 representa el proceso de maduración celular y proliferación a través del ejemplo de fibroblastos cardíacos después del aislamiento. Las células mostraron altas tasas de proliferación que alcanzaron una confluencia óptica de >90% después de 6 a 1 días. En este nivel de confluencia los fibroblastos se detienen para proliferar18 y las células se pueden dividir, usando 0.25% de trippsina, y transferidas a matraces de cultivo celular más grandes para el cultivo posterior o experimentos.
En condiciones de cultivo de células basales, los cultivos de fibroblastos consisten en fibroblastos y una proporción menor de miofibroblastos19,20. Hay varios marcadores aceptados para identificar los fibroblastos. DDR2 y la expresión de vimentina son marcadores comunes de fibroblastos y la expresión de microfilamentos organizados de SMA indica diferenciación de miofibroblastos7,9. En la Figura 4se presenta una imagen representativa de un miofibroblasto diferenciado con microfilamentos distintivos de la APYME e imágenes de visión general representativas para la abundancia de filamentos de la ASMA en el corazón, el riñón, el hígado y el pulmón. Mientras que sólo alrededor del 20 - 30% de las células aisladas y posteriormente cultivadas expresaron microfilamentos samilatos ordenados (lo que indica diferenciación de miofibroblastos), todas las células (99%) positivos para vimentin y DDR2 (Figura3, panel inferior).
Figura 1 . Descripción general del procedimiento de aislamiento de fibroblastos. Después de que los órganos de interés se han eliminado del ratón, se pican bajo una campana de cultivo celular utilizando bisturíes estériles. Posteriormente, el tejido picado se transfiere a una solución de trippsina del 0,25% durante 5 min. Después de la primera digestión, se añade la solución de mezcla de colagenasa y los tubos se transfieren a un baño ultrasónico durante 20 minutos a 37 oC. Después de la filtración y centrifugación, el pellet celular se puede transferir a un plato de cultivo celular adecuado. Después de al menos 8 h para adherirse, los cultivos se lavan tres veces con PBS para eliminar eritrocitos y escombros. Finalmente, se añade un medio fresco (DMEM, 15% FCS, 1% Penicilina/Estreptomicina) y se pueden cultivar las células. Las imágenes del arte médico inteligente de Servier se han utilizado para crear la figura (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Fibroblastos murinos primarios aislados de órganos sólidos después de 7 días de cultivo primario. A) Fibroblastos cardíacos. B) Fibroblastos pulmonares. C) Fibroblastos renales. D) Fibroblastos hepáticos. Las células se cultivaron en DMEM (15% FCS, 1% Penicilina/Estreptomicina (PS))a 37oC y 5% CO 2. Para obtener estas imágenes se utilizaron aumentos de 10x y zoom de cámara óptica de 5,6x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Identificación de fibroblastos en cultivo. A - C) Fijación y crecimiento de fibroblastos cardíacos durante 4 días. Después del lavado y el cambio medio, los fibroblastos unidos desarrollan su forma distintiva y proliferan. Las células se cultivaron en DMEM (15% FCS, 1% PS). D - F) Imágenes de tinción de inmunofluorescencia de fibroblastos primarios después de 7 días de cultivo para marcadores de fibroblastos (D), DDR2 (E) y Vimentin (F). Los núcleos estaban manchados con DAPI (azul). Los anticuerpos primarios (Sigma-Aldrich) se diluyeron 1:200 en una solución de BSA al 1% (A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). Alexa-Fluor 488 fue utilizado como anticuerpo secundario. Las barras de escala son iguales a las longitudes indicadas anteriormente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Imágenes inmunocitoquímicas representativas para la abundancia de microfilamentos de la AIMA. A) Se muestra un miofibroblasto típico (magnificación: 20x). B – E) Imágenes de visión general representativas de la ACM para el corazón (B), el riñón (C), el hígado (D) y el pulmón (E) (magnificación: 10x). Los círculos blancos indican células representativas que se consideraron miofibroblastos. Los núcleos estaban manchados con DAPI (azul). El anticuerpo primario se diluyó 1:200 en solución de BSA al 1% (A5228). Alexa-Fluor 488 fue utilizado como anticuerpo secundario. Las barras de escala son iguales a las longitudes indicadas anteriormente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Tasas de proliferación de fibroblastos murinos y desarrollo de senescencia in vitro. A) Tasa de proliferación de fibroblastos murinos determinadodespués de 7 y 14 días de cultivo. Las células fueron cosechadas y contadas con una cámara Buerker en los respectivos puntos de tiempo. Los resultados representan el recuento de celdas en 1 ml de medio. B) La senescencia se determina por la presencia de la galactosidasa (verde teñido). Las celdas senescentes se indican con círculos blancos. La barra de escala es igual a 50 m. Los resultados se presentan como media s SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En comparación con las líneas celulares de fibroblastos inmortalizadas, los fibroblastos primarios ofrecen varias ventajas. Pueden ser aislados de manera rentable en alta calidad y cantidad. Además, los cultivos primarios ofrecen la posibilidad de estudiar células de múltiples individuos, lo que aumenta la fiabilidad de los resultados obtenidos y disminuye la probabilidad de estudiar simplemente los artefactos de cultivo celular. La generación continua de nuevos cultivos primarios previene las alteraciones genéticas que suelen ocurrir después del paso repetido21. Además, la senescencia celular22,23 o el aumento de la diferenciación de miofibroblastos se producen con mayor frecuencia en cultivos a pasos altos20. En pasajes bajos (2-3), el recuento basal de miofibroblastos fue de aproximadamente 20 - 30% (datos no mostrados) y sólo 2.89% de las células se consideraron senescentes basados en la expresión de galactosidasa (Figura5B). Por esta razón, se recomienda pasar las culturas hasta un máximo de 5 veces y reemplazarlas en adelante. Esto garantiza resultados fiables y replicables a lo largo de los experimentos. El crecimiento óptimo de fibroblastos y la proliferación se obtuvieron con un medio de cultivo celular que contenía 15% de FCS en lugar del 10%. Esto aseguró un rendimiento robusto de fibroblastos y una buena viabilidad celular después del primer paso.
Este protocolo complementa las técnicas existentes en términos de velocidad y grado de dificultad. Las técnicas de crecimiento requieren entre 10 - 21 días, dependiendo de la especie y el tejido, hasta que se puedan cosechar cantidades suficientes de fibroblastos12,24. La perfusión de Langendorff por otro lado es rápida (<5 h) pero requiere más habilidad manual y entrenamiento. En comparación con los métodos de crecimiento12,24 o aislamiento de fibroblastos del sobrenadante de Langendorff-perfusión16, este protocolo ofrece especialmente a los principiantes la oportunidad de trabajar con células primarias después de un muy corto período de formación (2 - 3 aislamientos) sin el requisito de alta habilidad mecánica o esfuerzo técnico. La contaminación con células no fibroblastas (por ejemplo, células endoteliales) fue insignificante porque los fibroblastos cultivados crecen rápidamente otros tipos de células en cultivos debido a sus mayores tasas de proliferación25. Además, este protocolo da instrucciones claras que ayudan a evitar la contaminación bacteriana, que es un problema importante trabajando con células murinas primarias. Aquí, se identificaron dos pasos críticos para evitar la contaminación. La primera es la extracción de órganos. Las bacterias de piel de roedores se pueden transferir fácilmente a los órganos si los guantes y los instrumentos quirúrgicos no se cambian después de retirar el pelaje y la piel. El segundo paso crítico es el propio proceso de aislamiento. Las células tienen que ser removidas mecánicamente de su nicho de tejido. En el contexto de Langendorff-perfusión esto se realiza por una corriente continua de líquido. Otras técnicas utilizan barras de agitación magnéticas o métodos de agitación. Particularmente, la sustitución de las barras de agitación magnéticas por ondas ultrasónicas reduce el riesgo de contaminación bacteriana evitando el contacto físico entre el agitador y el tejido lisado. Una ventaja adicional del baño de agua ultrasónico es la distribución uniforme de calor a los tubos, proporcionando así temperaturas de trabajo óptimas para las enzimas.
En conclusión, este protocolo proporciona un método rápido, fiable y replicable para aislar los fibroblastos primarios que es ideal para investigadores avanzados y en etapa temprana. Este método es una adición útil al espectro existente de técnicas que pueden contribuir a una mejor comprensión de la función de los fibroblastos en la salud y la enfermedad.
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Disclosures
No hay conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Sra. Romy Kempe y a la Sra. Annett Opitz el apoyo técnico de expertos. También damos las gracias al Sr. Bjoern Binnewerg por el apoyo de TI. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de a) el Dresdedrner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsf-rderprogramm f'r Frauen", Facultad de Medicina Carl Gustav Carus Dresden y c) Else Kr'ner-Forschungskolleg (EKFK) Facultad de Medicina Carl Carus Dresden. Agradecemos la financiación y el apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
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