Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تقييم الحث علي الاكتئاب علي المدى الطويل في شرائح البالغين المخيخار

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859
Automatic Translation
1, 2
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Summary

في بعض الكائنات التي تتلاعب بالجينات ، قد يفشل استخدام بروتوكول واحد للحث علي المحدودة في خلايا Purkinje المخيخ ، وقد يكون هناك اختلاف بين المحدودة والتعلم الحركي. بروتوكولات متعددة ضرورية لتقييم التعريفي المحدودة في الكائنات التي تتلاعب بالجينات. يتم عرض البروتوكولات القياسية.

Abstract

اللدونة متشابك يوفر اليه للتعلم والذاكرة. للتعلم المحرك المخيخ ، والاكتئاب علي المدى الطويل (المحدودة) من الإرسال متشابك من ألياف المتوازية (PF) إلى الخلايا Purkinje (PC) يعتبر أساسا للتعلم الحركي ، ولوحظت أوجه القصور في كل من المحدودة والتعلم الحركي في مختلف التلاعب بالجينات الحيوانية. واستخدمت مجموعات التعلم الحركي المشتركة ، مثل التكيف مع منعكس حركه اللااراديه (okr) ، منعكس الدهليزية العين (VOR) ، واختبار rotarod لتقييم قدره التعلم الحركي. ومع ذلك ، أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها من محطه GluA2-كربوكسي المعدلة في الفئران التكيف الطبيعي لل VOR و OKR ، علي الرغم من نقص PF-المحدودة. وفي ذلك التقرير ، تمت محاولة الحث علي المحدودة فقط باستخدام نوع واحد من بروتوكول التحفيز في درجه حرارة الغرفة. وهكذا ، تم استكشاف الظروف التي تحفز المخيخ المحدودة في نفس الطرق في المسوخ باستخدام بروتوكولات مختلفه في درجه حرارة الفسيولوجية القريبة. وأخيرا ، وجدنا بروتوكولات التحفيز ، التي يمكن ان يسببها المحدودة في هذه الفئران التلاعب الجينات. في هذه الدراسة ، يتم اقتراح مجموعه من البروتوكولات لتقييم التعريفي المحدودة ، والتي سوف تسمح بشكل أكثر دقه فحص العلاقة السببية بين المحدودة والتعلم الحركي. في الختام ، الظروف التجريبية حاسمه عند تقييم المحدودة في الفئران التلاعب الجينات.

Introduction

وقد تم توضيح التنظيم متشابك من الشبكات العصبية المفصلة من القشرة المخيخ ، وتتالف من أجهزه الكمبيوتر ، والخلايا العصبية الطبقة الجزيئية (سله والخلايا النجميه) ، golgi الخلية ، PFs من الخلايا الحبيبية ، وألياف المطحلب وتسلق ألياف (CFs) ، من حيث الاثاره/تثبيط والتباعد/التقارب ، والمخطط الدوائر تنظيما جيدا وقد اقترح ان المخيخ هو "اله العصبية"1، علي الرغم من انه لم يكن هناك في السابق اي فكره عن الغرض من هذا "اله". واقترح في وقت لاحق Marr ان المدخلات PFs لأجهزه الكمبيوتر تشكل طبقه ثلاثية شبكه التعلم النقابي2. واقترح أيضا ان كل CF ينقل التعليمات الدماغية للحركة عنصري2. وقال انه يفترض ان التنشيط في وقت واحد من PFs و CF من شانه ان يعزز النشاط المشبك PF-PC, ويسبب التقوية طويلة الأجل (LTP) من المشبك PF-PC. من ناحية أخرى ، افترض Albus ان تنشيط متزامن من PFs و CF أسفرت المحدودة في الاشتباكات العصبية PF-PC3. كل من الدراسات المذكورة أعلاه تفسر المخيخ كجهاز ذاكره فريدة من نوعها ، ودمج التي في الشبكة القشرية المخيخ يؤدي إلى تشكيل نموذج اله التعلم النموذج Marr-Albus.

بعد هذه التوقعات النظرية ، واثنين من خطوط الادله تشير إلى وجود اللدونة متشابك في المخيخ. واقترح السطر الأول من الادله من قبل التنظيم التشريحي لل التلبد ؛ هنا مسارات MF من أصل الجهاز الدهليزي ومسارات CF من أصل الشبكية تتلاقي علي أجهزه الكمبيوتر4. هذا النمط الفريد من التقارب يوحي بان اللدونة المتشابكة التي تحدث في التلبد تؤدي إلى التكيف الملحوظ لمنعكس العين. ثانيا ، ان تسجيل استجابه أجهزه الكمبيوتر الشخصية في التلبد والسخرية من التلبد أيضا دعم الفرضية المذكورة أعلاه5،6،7. وعلاوة علي ذلك ، فان نمط التفريغ PC خلال التكيف مع حركه اليد القردة8 دعمت فرضيه اللدونة متشابك ، وخاصه albus ' المحدودة-فرضيه3.

لتحديد طبيعة اللدونة متشابك مباشره ، والتحفيز الملتحمة المتكررة (Cjs) من حزمه من PFs و CF ان العصبي علي وجه التحديد في جهاز الكمبيوتر في الجسم الطبيعي وأظهرت للحث علي المحدودة لفعالية انتقال PF-PC الاشتباكات العصبية9، 10,11. في الاستكشافات اللاحقة في المختبر باستخدام شريحة المخيخ12 وأجهزه الكمبيوتر المثقفة ، والجمع بين التحفيز المشترك للخلايا الحبيبية وتحفيز خلايا الزيتون13 أو الاقتران من الغلوتامات التطبيقية ايوتوهوريكالي والجسدية الاستقطاب14،15 المحدودة. كما تم التحقيق بشكل مكثف في اليه محول الإشارات الكامنة وراء الحث المحدود باستخدام المستحضرات الانبوبيه16،17.

وغالبا ما تستخدم التعديلات من VOR و OKR للتقييم الكمي للآثار التلاعب الجينات علي التعلم الحركي المخيخ ، لأنه ثبت القشرة الدهليز-المخيخ ان تكون الأصل الأساسي في التعلم التكيفيه من VOR18 ,19,20 و okr19,21 وقد اتخذت العلاقة بين فشل التعريفي المحدودة وضعف التعلم الحركي السلوكي كدليل علي ان المحدودة تلعب دورا أساسيا في المحركات أليات التعلم22. ويشار إلى هذه الآراء بشكل جماعي باسم فرضيه المحدودة للتعلم الحركي ، أو الفرضية المار-albus-ايتو23،24،25،26.

تم قياس التعلم التكيفيه لحركه العين باستخدام بروتوكولات مماثله ، في حين استخدمت الظروف التجريبية المختلفة للحث علي المحدودة في اعداد شريحة27،28،29،30،31 . وفي الاونه الاخيره ، ذكرت شونفيل وآخرون26 ان بعض الفئران التلاعب الجينات أظهرت التعلم الحركي العادي ، ولكن لم تظهر شرائح المخيخ المحدودة ، التالي استنتجت ان المحدودة ليست ضرورية للتعلم الحركي. ومع ذلك ، تمت محاولة الحث المحدودة فقط باستخدام نوع واحد من البروتوكول في درجه حرارة الغرفة. التالي ، استخدمنا عده أنواع من البروتوكولات التي تحفز المحدودة تحت شروط التسجيل في حوالي 30 درجه مئوية ، وأكدنا ان المحدودة كانت مستحثه بشكل موثوق في الفئران التلاعب الجينات باستخدام هذه البروتوكولات في درجات الحرارة الفسيولوجية القريبة32.

ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الاسئله بشان الخصائص الاساسيه للتحفيز الملتحمة. الأول هو العلاقة بين شكل سبايك المعقدة والسعه المحدودة. ثانيا ، بالاقتران مع تحفيز الجبهة الذاتية والاستقطاب الجسدي ، ما إذا كان عدد المحفزات المستخدمة ضروريا ام لا كان بعيد المنال. في هذه الدراسة ، تم التحقيق في هذه الاسئله باستخدام فئران النوع البري (WT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت لجنه ريكين علي جميع الإجراءات التجريبية المتعلقة برعاية الماشية واستخدامها في التجارب. تم الاحتفاظ الفئران في مرفق الحيوانية من مركز ريكين لعلوم المخ تحت درجه حرارة تسيطر عليها جيدا (23-25 °C) والرطوبة (45 ٪-65 ٪) الظروف. واستخدمت كل من الذكور والإناث الفئران WT (C57BL/6 ، 3-6 أشهر).

1. اعداد الحلول المستخدمة في التجارب

ملاحظه: وينبغي اجراء جميع الحلول في المياه الفائقة خاليه من المعادن (المقاومة > 18.2 MΩ) وغيرها من الشوائب (الكربون العضوي الكلي (TOC) < 5.0 ppb). يتم العمل السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) لقطع شريحة وتسجيل الطازجة في يوم التجربة من 10 مرات (x10) الأسهم من ACSF. فقاعه الحلول مع 5 ٪ CO2/95 ٪ O2 خليط الغاز قبل الاستخدام. يتم تعديل درجه الحموضة من acsf إلى 7.4 ± 0.1 ، ويتم تعديل الاسموليه 315 ± 5 mosm/kg عن طريق أضافه المياه نقاء.

  1. اعداد المخزون 10x من ACSF التي تحتوي علي 1250 mM كلوريد الصوديوم ، 30 ملم KCl ، 12.5 mM الجناح2PO4، و 260 mm نهكو3. يمكن تخزين هذا الحل في 4 درجه مئوية.
  2. اعداد العمل ACSF التي تحتوي علي 125 mM كلوريد الصوديوم ، 3 ملم KCl ، 2 مم CaCl2، 1 ملم ملغ2حتى4، 1.25 mm الجناح2PO4، 26 ملم ناسكو3 و 20 ملم الجلوكوز.
    1. أولا ، أضافه 1 مل من 2 m cacl محلول2 تليها 1 مل من 1 م ملغ2حتى4 الحل إلى حوالي 800 مل من الماء نقاء ، لتجنب هطول الامطار. ثم أضافه 100 مل من 10x ACSF والجلوكوز. وأخيرا ، جعل ما يصل إلى حجم الإجمالي من 1,000 مل عن طريق أضافه المياه نقاء.
  3. اعداد أجار 3.3 ٪ للتعامل مع الدماغ. تذوب 1 غرام من أجار في 30 مل من 0.9 ٪ محلول كلوريد الصوديوم ، والحرارة في الميكروويف حتى يغلي فقط. يحرك المزيج ، ثم يسكب في صندوق من البلاستيك المعقم بطول 4 سم × 10 سم ويسمح بترسيخه. تخزين لوحه أجار (~سمك 8 ملم) في الثلاجة.
  4. اعداد الحل الداخلي.
    1. اعداد الحل الداخلي القائم عليk +التي تحتوي علي 60 Mm kcl ، 60 mm k-غلوكونات ، 0.3 MM egta ، 4 مم mgcl2، 4 مم ATP ، 0.4 mm GTP و 30 مم hepes (pH 7.2).
      ملاحظه: تركيز منخفض (0.3 mM) من EGTA ، وهو Ca بطيئه2 +-chelator ، يضاف إلى مخلب ربما الملوثة ca2 + في المياه النقية ، ولكن هذا التركيز المنخفض من egta في الحل الداخلي أبدا يمنع التعريفي المحدودة (الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5) اثناء التسجيل بالخلايا الكاملة. قياس الضغط الاسموزي هو 285 mOsm/kg.
    2. اعدادCs +-القائم الحل الداخلي الذي يحتوي علي 60 Mm cscl ، 46 mm D-غلوكونات ، 27 ملم كلوريد رباعي ايثيل الأمونيوم (الشاي-Cl) ، 0.3 MM egta ، 4 مم mgcl2، 4 مم ATP ، 0.4 mm GTP و 30 مم hepes (pH 7.2 ، تعديلها باستخدام csoh).
      ملاحظه: Cs + كتل الجهد التي تعتمد علي قنوات K ، ويحسن الظروف المشبك الفضاء في تشعبات عن طريق زيادة طول ثابت. قياس الضغط الاسموزي هو 285 mOsm/kg.
    3. اعداد 200 μl القسامات من الحلول وتخزين في-30 درجه مئوية.

2. تشريح الدماغ والتشذيب

  1. البرد والأوكسجين 2 50 mL أكواب من ACSF علي الجليد حتى درجه الحرارة اقل من 4 درجه مئوية. أضافه 50 μL من tetrodتوكسين (TTX ، 1 ملم) في واحده من الأكواب الجليد الباردة من ACSF والاحتفاظ بها لقطع شرائح. للحصول علي الماوس شريحة المخيخ المتحفظة القدرة علي الحث المحدودة ، أضافه TTX إلى ACSF العادية ضروري.
  2. تهدئه صينية عينه معدنيه من خلال ملء منطقه الجليد حمام من غرفه تشريح مع الجليد.
  3. صب 1 مل من ايزوفلوان في جره تخدير (~1000 mL) ثم وضع الماوس في ذلك ل 30-45 s. تاكد من ان الماوس هو تخدير عميق عن طريق تاكيد عدم قدرته علي الاستجابة للتحفيز الميكانيكي.
  4. قطع راس الماوس باستخدام مقص الجراحية. امسك الراس واقطع الجلد السطحي علي طول الخط الأوسط باستخدام مقص العيون. سحب الجلد عن طريق عقد مع الأصابع لفضح علي نطاق واسع سطح الجمجمة.
  5. اقطع الجمجمة أفقيا علي طول خط من الفتحة الرئيسية الراسية فوق الاذن والعين باستخدام مقص للعيون. قطع الجمجمة علي طول خط فوق كلا العينين وأزاله لعزل الجمجمة.
  6. قطع الدماغ في منتصف مخ باستخدام مشرط ، ثم عزل الجزء الذيليه من الدماغ بما في ذلك المخيخ من الجمجمة. تزج به في كاس الجليد الباردة من ACSF. عاده ، ينبغي ان يكون الوقت الإجمالي من قطع الراس إلى غمر كتله الدماغ في الكاس قبل المبردة من ACSF اقل من 60 s.
  7. وينبغي تعديل موقف الأنابيب محتدما حتى لا يحرك كتله الدماغ في الكاس. قد يسبب التلف الميكانيكي تورم الشريحة اثناء التسجيل. اتركه لمده لا تقل عن 7 دقائق والسماح للدماغ لتهدئه.
  8. لتقليم كتله الدماغ ، وقطع قطعه أجار مستطيله (2 سم × 2 سم) من لوحه أجار كبيره (4 سم × 10 سم ، وتخزينها في 4 درجه مئوية) ووضعها علي ورقه فلتر لامتصاص السائل الزائد.
  9. تحويل قطعه أجار راسا علي عقب علي ورقه فلتر ، ثم وضع قطعه أجار علي ورقه فلتر علي صينية عينه معدنيه قبل المبردة (16 سم × 20 سم). التقاط كتله الدماغ باستخدام ملعقة وامتصاص السائل المفرط حوله مع قطعه من ورق الترشيح.
  10. جبل كتله الدماغ علي كتله أجار باستخدام الغراء (الطبية اللاصقة الفورية cyanoوكريلات). تاكد من إرفاق الجزء السفلي (الجانب البطني) من كتله الدماغ إلى أجار.
  11. اقطع نصف الكره الأيمن بشفره تاكد من ان الجانب من الطائرة القطع موازيه قدر الإمكان للطائرة شجيري من جهاز الكمبيوتر لان هذا الجانب هو تعلق علي سطح درج العينة. قطع وأزاله الجانب الآخر من نصف الكره الارضيه. ثم ، وقطع الدماغ بين العليا والسفلي كولولي ، وقطع الحبل الشوكي.
  12. ألصق الجانب الأيمن من المخيخ المشذب بكتله أجار علي صينية العينات المبردة مسبقا. انشر الغراء الزائد حول المخيخ مع الجزء المسطح من الملعقة ، لمنع الغراء الزائد من التصاق بسطح المخيخ. أماله صينية معدنيه وتصب ACSF من أجل إصلاح الغراء ويغسل الغراء الزائد.

3. تشريح المخ

  1. توجيه العينة بحيث يكون الجانب الظهري من المخيخ علي الجانب الامامي. صب قطع الجليد الباردة ACSF ، التي تحتوي علي 1 μM TTX ، كافيه لتزج المخيخ تماما. وضع أنبوب الغاز في ACSF وبدء محتدما مع O2/CO2 خليط الغاز.
  2. أزاله الام العنكبوتية باستخدام ملقط غرامه تحت مناظير. قطع العم المخيخ مع شفره ، وأزاله جذع الدماغ وأجار كتله. تدوير الدرج 180 درجه ، بحيث يواجه السطح الظهري للمخيخ شفره razorblade.
  3. اضبط الشفرة ، واضبط موقع القطع الأول. تعيين المعلمات تقطيع الذبذبات إلى ما يلي: السعه إلى 5.5 ، والتردد إلى 85 هرتز ، والسرعة إلى 3 – 4 ، وسمك شريحة إلى 300 μm.
  4. نقل شريحة المخيخ علي شبكه من النايلون إلى حاضنه الأكريليك وتزج شريحة تماما في ACSF الأوكسيجين. يجب وضع الحاضنة في حمام مائي يحافظ علي درجه حرارة 26 درجه مئوية.
  5. يخزن الشرائح لمده 1 ساعة علي الأقل للسماح بالاسترداد من التلف اثناء التقطيع.

4. الخلية الكاملة التصحيح-تسجيل المشبك

ملاحظه: تسجيل التصحيح المشبك يتطلب المعدات التالية: المجهر تستقيم مع الاشعه تحت الحمراء التباين التداخل التفاضلية (IR-DIC) البصريات ، ومكبر للصوت التصحيح المشبك ، التحويل الرقمي للبيانات ، ومحفز الكترونيه ، المعزل ، والكمبيوتر ، والبرمجيات للحصول علي البيانات والتحليل ، والمناور الميكانيكية ، ومنصة المجهر ، والاهتزاز الجدول العزلة ، قفص فاراداي ، نظام التدفئة الحل ، ومضخات التمعجيه وساحبه القطب.

  1. أضافه بيكروتوكسين (0.1 mM) إلى acsf وحلها باستخدام سونيكيشن الترا لمده 3 دقائق.
  2. Perfuse غرفه تسجيل مع التي تحتوي علي picrotoxin ، O2-CO2-المشبعة Acsf بمعدل 2 مل/دقيقه. الحفاظ علي درجه حرارة غرفه التسجيل في حوالي 30 درجه مئوية.
  3. جعل القطب تسجيل عن طريق سحب الشعرية الزجاج بوروسيليكات مع خيوط (القطر الخارجي = 1.5 مم) باستخدام ساحبه مع 4 خطوات. يجب ان يكون قطر غيض حوالي 1 μm.
  4. جعل القطب تحفيز عن طريق سحب نفس الشعرية باستخدام ساحبه مع 2 الخطوات ، ثم كسر لإنتاج غيض غرامه عن طريق ضرب غيض ضد كتله الحديد تحت مجهر منظار. يجب ان يكون القطر النهائي 3 – 5 ميكرومتر.
  5. نقل شريحة المخيخ إلى غرفه التسجيل وإصلاحه مع Pt-الوزن مع خيوط النايلون. ملء القطب تحفيز مع ACSF.
  6. لتحفيز PFs ، ضع القطب الكهربائي المحفز علي سطح الطبقة الجزيئية ، حوالي 50 ميكرومتر بعيدا عن طبقه الخلايا Purkinje.
  7. لتحفيز CF ، وضع القطب تحفيز في الجزء السفلي من طبقه الخلية Purkinje (الخطوات 5.3 ، 5.4).
  8. تصفيهK +-القائم أوCs +-القائم الحل الداخلي مع فلتر 0.45 μm. استخدام محمل صغير لملء القطب تسجيل مع 8 μL من الحل الداخلي.
  9. تطبيق ضغط إيجابي ضعيف علي القطب التسجيل قبل غمرها في ACSF. يجب ان تكون مقاومته 2 – 4 MΩ ويجب تصحيح الإمكانيات السائلة.
  10. الاقتراب من جسم الخلية الصحية والمشرقة للكمبيوتر مع قطب التسجيل. دفع سطح الخلية Purkinje قليلا ، والتوقف عن تطبيق الضغط الإيجابي ، المقبل تطبيق الضغط السلبي حتى تشكيل ختم جيجا أوم. ثم إنشاء تكوين الخلية بأكملها باستخدام الضغط السلبي.
  11. عقد المحتملة غشاء في-70 mV ، وتطبيق-2 نبض mV (المدة ، 100 مللي ثانيه) في 0.1 هرتز لرصد مقاومه المدخلات ، سلسله المقاومة والسعه المدخلة ، بشكل مستمر. لا تستخدم تعويض مقاومه السلسلة. تجاهل البيانات عندما تختلف مقاومه السلسلة بنسبه تزيد عن 15%.

5. التعريفي المحدودة

  1. تحفيز الطبقة الجزيئية مع نبض (المدة ، 0.1 مللي ثانيه). تحديد التيارات بعد متشابك PF-مثير (EPSC) عن طريق تطبيق التحفيز نبض مزدوج (الفاصل الزمني البيني (ISI) من 50 ms). وينبغي ان تظهر الجبهة الخاصة بالقوات الخاصة تيسير النبض المزدوج والزيادة التدريجية في السعه بالنسبة للزيادة في كثافة التحفيز.
  2. تسجيل استجابه اختبار PF-EPSC عن طريق تطبيق نبضه واحده في 0.1 هرتز. ضبط كثافة التحفيز بحيث السعه EPSC اثار حوالي 200 pA السلطة الفلسطينية. تجنب تلوث التيار من خلال القناة الايونيه التي تعتمد علي الجهد.
  3. تحفيز CF في الجزء السفلي من طبقه الخلية Purkinje ، وتحديد EPSC التي اثارها تنشيط CF (عن طريق تطبيق التحفيز نبض مزدوج). يجب ان تظهر CF-EPSC الاكتئاب المزدوج النبض وبطريقه كل أو لا شيء وفقا للزيادة في كثافة التحفيز. لحث المحدودة ، وينبغي استخدام حافز واحد.
  4. المحدودة--حث البروتوكول 1
    1. باستخدام القطب الذي يحتوي علي الحل الداخلي القائم عليK +تحت ظروف المشبك الحالية ، وتطبيق واحد PF التحفيز والتحفيز CF واحد في وقت واحد في 1 هرتز لمده 5 دقائق (300 البقول) (الشكل 1a).
  5. المحدودة--تحريض البروتوكول 2
    1. باستخدام القطب الذي يحتوي علي الحل الداخلي القائم عليK +تحت ظروف المشبك الحالية ، وتطبيق مزدوج pf-المحفزات (ISI من 50 مللي ثانيه) وواحده cf-التحفيز كما الثاني pf-التحفيز هو تتزامن مع cf-المحفزات في 1 هرتز لمده 5 دقيقه (الشكل 1b).
  6. المحدودة تحريض بروتوكول 3
    1. باستخدام القطب الذي يحتوي عليCs +-القائم علي حل داخلي تحت ظروف الجهد والمشبك ، وتطبيق مزدوج PF-التحفيز (ISI من 50 ms) والجهد الاستقطاب واحده-خطوه (-70 إلى 0 mV ، 50 ms) إلى سوما في 1 هرتز لمده 3 دقائق ، بحيث الثاني PF-التحفيز هو مكافئه لبداية الجهد الذي يتم في الاستقطاب (الشكل 1C).
  7. المحدودة--حث بروتوكول--4
    1. باستخدام القطب الذي يحتوي عليCs +-القائم علي الحل الداخلي تحت ظروف الجهد المشبك ، وتطبيق المحفزات PF (5x في 100 هرتز) والجهد الاستقطاب واحده-خطوه (-70 إلى 0 mV ، 50 ms) إلى سوما في 0.5 هرتز لمده 3 دقائق ، في وقت واحد (الشكل 1d ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدمت أربعه بروتوكولات في هذه الدراسة للحث علي المخيخ المحدودة. وفي البروتوكولين الأول والثاني (البروتوكولان 1 و 2) ، تم تطبيق الاقتران بين التحفيز وتحفيز التيار الكهربي في ظل ظروف المشبك الحالية. في البروتوكولين الآخرين (البروتوكول 3 و 4) ، تم استبدال الاستقطاب الجسدي لتحفيز CF تحت ظروف الجهد المشبك. تمت مقارنه اثار الجهد أو الآثار الحالية اثناء التحفيز الملتحمة (الشكل 2).

الاقتران من 1 PF-التحفيز و 1 CF-التحفيز تحت الحالية-المشبك الظروف (البروتوكول-1) كانت تستخدم تقليديا لاعداد شريحة26,27. وكان شكل الطفرة المعقدة التي اثارها Cj مماثله لتلك التي اثارها CF-التحفيز وحدها ، مع السنيبلات الحاد الاولي تليها 2 إلى 3 السنيبلات (الشكل 2a). ولوحظ أيضا ارتفاع مركب علي شكل مماثل خلال التحفيز مع البروتوكول 2 ، وهي ، تم اتباع 1 PF التحفيز 50 ms في وقت لاحق من قبل العطف الثاني PF-و CF-التحفيز (الشكل 2B). تحت ظروف الجهد المشبك باستخدام الحل الداخلي القائم عليCs +، تم تطبيق الاقتران من 2 PF التحفيز والاستقطاب الجسدي (البروتوكول 3) (الشكل 2 ج). وأعقب التحفيز الأول PF 50 ms في وقت لاحق من قبل تطبيق مصاحب لتحفيز PF الثاني والاستقطاب الجسدي. وقد تم استخلاص التيار الداخلي علي الاستقطاب الجسدي من-70 إلى 0 mV. وأثيرت أيضا الذيل الحالي بعد أعاده الاستقطاب. في بعض الأحيان ، لوحظ الجيل المتكرر من التيار الداخلي ، والتي من شانها ان تعكس النشاط Ca-سبايك في منطقه شجيري النائية حيث لم يتم فرض الغشاء المحتمل بما فيه الكفاية ، علي الرغم من استخدام الحل الداخلي القائم عليCs +( الشكل 2 جيم). وأخيرا ، أعطيت 5 المحفزات PF في 100 هرتز في وقت واحد مع الاستقطاب الجسدي تحت ظروف الجهد المشبك (البروتوكول 4). ومره أخرى ، تم التماس الجيل المتكرر من التيارات الداخلية اثناء الاستقطاب وتمت الآثار علي التيار الخلفي بعد أعاده الاستقطاب. لم يتزامن توقيت الجيل المتكرر من التيار الداخلي مع المحفزات PF (الشكل 2D). وفي بعض الأحيان ، استمر الجيل المتكرر من التيار الداخلي بعد أعاده الاستقطاب.

اما بالنسبة لل LTD الناجمة عن بروتوكولات-1 و-2 ، والحد من السعه EPSC تقاس خلال 25 دقيقه بعد بداية Cj كانت متناثرة علي مدي واسع نسبيا32. بالمقارنة مع الشكل المستقر لل PF-EPSP ، كان شكل الارتفاع المعقد متغيرا تماما من خليه إلى خليه. لان spikelets في ارتفاع المعقدة عكست Ca2 +-قناه التنشيط33، شكل ارتفاع معقده ، مثل السعه أو الانحدار من spikelets ، التي تؤثر علي السعه المحدودة تم فحص مع ارتفاع المعقدة التي اثارها البروتوكول 1. لان شكل التموجات المعقدة التي اثارها البروتوكول 2 كانت ملوثه مع PF-EPSP ، لم نحلل هذه البيانات. أولا ، وكان مجموع جميع spikelets (1 – 4)-السعه مرتبطة مع اتساع المحدودة (-ΔEPSC ٪) (الشكل 3ا ، ب). وكان معامل الارتباط (ص) 0.28 ، ولكنه لم يكن هاما من الناحية الاحصائيه (ص > 0.5). لان spikelets 2-4 الواردة أكثر من Ca2 +-مكون34، وقد ارتبط مجموع spikelets (2-4)-السعه مع السعه المحدودة. ويبدو ان الارتباط اقوي (ص = 0.67) ، ولكنه لا يزال غير ذي دلاله احصائيه (ص > 0.1) (الشكل 3 ج). بعد ذلك ، تم حساب الحد الأقصى للقيمة dvm/dt (الحد الأقصى لمعدل ارتفاع [mrr]) من كل السنيبلات (الشكل 3d) ، لان المنتج من السعه الغشاء (سم) و dvm/dt يعكس تقريبا التيارات الغشاء35. تم فحص الارتباط بين المنتج من Cm ومجموع MRRs من spikelets (1 – 4) والمحدودة السعه (الشكل 3E) ، وكان r 0.18 (p > 0.9). وأظهرت العلاقة بين الناتج من السم ومجموع MRR من spikelets (2 – 4) r اقوي قليلا (0.36) ولكنه لم يكن كبيرا (ع > 0 .6) (الشكل 3F).

تحت شروط المشبك الجهد ، وبروتوكول 3 مع 180 Cjs المستحثة بكفاءة المحدودة (الشكل 4B)32. ومع ذلك ، ما إذا كان عدد أصغر من المحفزات يمكن ان تحفز بشكل فعال المحدودة لا يزال غير معروف. وهكذا ، تم تطبيق 60 Cjs في 1 هرتز لمده 1 دقيقه. حوالي 10 دقيقه بعد Cj ، تم قمع السعه EPSC ، ومع ذلك ، فانه استعاد في 15 دقيقه بعد Cj-بداية. وهذا يشير إلى ان 60 مرات Cjs في 1 هرتز غير كافيه للحث علي المحدودة (الشكل 4a). وعلاوة علي ذلك ، فان تكرار الاستقطاب الجسدي وحده (180 مرات) لم يستحث المحدودة (الشكل 4 ب)32.

تم استخدام البروتوكول 4 في الأصل من قبل شتاينبرغ وآخرون30 للفئران الشباب (P14-21). وأفيد بان الشركة المحدودة قد تسببت في 30 Cjs في 0.5 هرتز في RT في المخيخ نوع البرية. ومع ذلك ، عندما تم تطبيقها 30 Cjs إلى شريحة الفئران الكبار المخيخ (3-6 أشهر) في حوالي 30 درجه مئوية ، وكان المستحث لا المحدودة (الشكل 5A). وعلي النقيض من ذلك ، عندما تم تطبيق 90 Cjs ، لوحظ السعه المعتادة لشركه المحدودة (الشكل 5 ب)32. مره أخرى ، لم يحفز الاستقطاب الجسدي وحده (90 مرات في 0.5 هرتز) المحدودة (الشكل 5B).

Figure 1
الشكل 1: الرسم التخطيطي للبروتوكولات للحث علي المحدودة في PF-PC المشبك. (ا) البروتوكول 1 Cj. 1 PF و 1 CF المحفزات يتم تطبيقها في وقت واحد 300 مرات في 1 هرتز (5 دقيقه) تحت ظروف المشبك الحالية. القطب الكهربي لتسجيل الخلايا الكاملة يحتوي علي الحل الداخلي القائم عليK +. (ب) البروتوكول 2 Cj. 2 PF و 1 CF المحفزات يتم تطبيقها في وقت واحد 300 مرات في 1 هرتز (5 دقيقه) تحت حاله المشبك الحالية. القطب يحتوي علي الحل الداخلي القائم عليK +. (ج) البروتوكول 3 Cj. 2 pf والاستقطاب الجسدي (-70 إلى 0 mV ، 50 ms) يتم تطبيقها 180 مرات في 1 هرتز (3 دقيقه) تحت حاله الجهد المشبك ، بحيث يتم تطبيق التحفيز PF الثاني في وقت واحد مع بداية الاستقطاب الجسدي. يحتوي القطب الكهربائي علي الحل الداخلي القائم عليCs +. (د)-البروتوكول 4 Cj. 5 PF في 100 هرتز ويتم تطبيق الاستقطاب الجسدي 90 مرات في 0.5 هرتز (3 دقيقه) تحت حاله الجهد المشبك ، في وقت واحد. يحتوي القطب الكهربائي علي الحل الداخلي القائم عليCs +. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الجهد أو الآثار الحالية للكمبيوتر اثناء التحفيز بالتزامن. (ا) اثر الغشاء المحتمل الذي أثاره البروتوكول 1 cj. (ب) اثر الغشاء المحتمل الذي أثاره البروتوكول 2 cj. (ج) اثر الغشاء الحالي الذي أثاره البروتوكول 3 cj. (د) اثر الغشاء الحالي الذي أثاره البروتوكول 4 cj. الاشرطه العمودية = 10 mV (A و B) ، 1 nA (C و D). شريط أفقي = 20 مللي ثانيه الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: العلاقة بين السنيبلات من ارتفاع المعقدة والمحدودة السعه. (ا) اثر تمثيلي لارتفاع معقد أثاره البروتوكول 1. تشير الأسهم إلى قمم spikelets (1 – 4). شريط مقياس = 20 mV. (ب) العلاقة بين مجموع سعة الأبراج (1 – 4) والسعه المحدودة (-δepsc%) (ص = 0.28 ، ص > 0.5). (ج) العلاقة بين مجموع سعة الأبراج (2 – 4) والسعه المحدودة (ص = 0.67 ، ص > 0.1). (د) الأثر التمثيلي للزيادات المعقدة المتمايزة المبينة في ا. الأسهم تشير إلى قمم dVm/dt من spikelets. قضبان المقياس = 5 مللي ثانيه ، 50 V/s. (ه) العلاقة بين منتجات السنتيمتر ومجموع المواد التي من طراز mrkelets (1 – 4) والسعه المحدودة (-δepsc%) (ص = 0.18 ، ص > 0.7). (و) العلاقة بين منتج السنتيمتر ومجموع القيمة الاجماليه للمنتجات الخاصة بالspikelets (2 – 4) وسعه الشركة المحدودة (r = 0.36 ، ص > 0.4). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تاثير عدد من التكرار علي المحدودة التعريفي باستخدام بروتوكول-3 Cj. (ا) فشل الاستقراء المحدود بواسطة البروتوكول-3 cj ، وكان التكرار 60 في 1 هرتز. يعني السعه PF-epsc سجلت قبل وبعد البروتوكول-3 cj (العمود الأسود في الجزء السفلي). تم تطبيع السعه PF-EPSC من قبل تلك المسجلة قبل Cj. رمز يملا يشير إلى السعه EPSC المتوسط. القضبان خطا دلاله SEM. أقحم: فرضت اثار PF-EPSC (اعلي) سجلت قبل (ملحوظ 1) و 25-29 دقيقه بعد ظهور Cj-stim (ملحوظ 2). يمثل كل تتبع متوسط 6 سجلات. قضبان المقياس = 100 باسكال ، 10 مللي ثانيه (B) رمز احمر: المحدودة الناجمة عن البروتوكول 3 Cj ، وكان التكرار 180 مرات في 1 هرتز. الرمز الأزرق: لا تحفيز الاقتران ولكن تم تطبيق الاستقطاب الجسدي 180 مرات في 1 هرتز المحدودة لم يكن مستحثا. أقحم: تم تسجيل اثار PF-EPSC (اعلي) قبل (ملحوظ 3) و 25-29 دقيقه بعد Cj-stim بداية (ملحوظ 4). يمثل كل تتبع متوسط 6 سجلات. قضبان المقياس = 100 باسكال ، 10 مللي ثانيه البيانات المبينة في B هي نفسها المستخدمة في الشكل 3B من ياماغوتشي وآخرون32. (ج). ملخص مؤامرة من متوسط السعه PF-epsc سجلت خلال 25-29 دقيقه بعد بداية Cj. depol: الاستقطاب. يمثل الحرف العددي بين قوسين عدد الخلايا. x60 = 60 مرات ، x180 = 180 مره. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تاثير عدد من التكرار علي المحدودة التعريفي باستخدام بروتوكول 4 Cj. (ا) فشل الاستقراء المحدود بواسطة البروتوكول 4 Cj ، وكان التكرار 30 مره في 0.5 هرتز. يعني السعه PF-epsc سجلت قبل وبعد بروتوكول-4 cj (العمود الأسود في أسفل thr). رمز معباه تشير إلى السعه EPSC متوسط. القضبان خطا دلاله SEM. أقحم: فرضت اثار PF-EPSC (اعلي) سجلت قبل (ملحوظ 1) و 25-29 دقيقه بعد ظهور Cj-stim (ملحوظ 2). يمثل كل تتبع متوسط 6 سجلات. قضبان المقياس = 100 باسكال ، 10 مللي ثانيه (B) رمز احمر: المحدودة التي يسببها البروتوكول 4 Cj. ، الرمز الأزرق: لم التحفيز الاقتران ولكن تم تطبيق الاستقطاب الجسدي 180 مرات في 0.5 هرتز المحدودة لم يكن مستحثا. أقحم: تم تسجيل اثار PF-EPSC (اعلي) قبل (ملحوظ 3) و 25-29 دقيقه بعد Cj-stim بداية (ملحوظ 4). قضبان المقياس = 100 باسكال ، 10 مللي ثانيه البيانات المبينة في B هي نفسها المستخدمة في الشكل 4B من ياماغوتشيوآخرون. 32(ج). ملخص مؤامرة من متوسط PF-EPSC السعه المسجلة خلال 25-29 دقيقه بعد بداية Cj. Depol: الاستقطاب. يمثل الحرف العددي بين قوسين عدد الخلايا. x30 = 30 مره ، x90 = 90 مرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الاختلافات بين البروتوكولات الاربعه

في البروتوكولات التي تحفز المحدودة 1 و 2 ، Cjs 300 مرات في 1 هرتز يكفي للحث علي المخيخ المحدودة. تردد التحفيز من CF يبدو ان تكون في نطاق الفسيولوجية ، لان ارتفاع معدل إطلاق النار في حاله تاهب الفئران الكبار (P60) وأفيد ان 1.25 هرتز36. ومع ذلك ، فان التحفيز CF وحدها لا تسبب اللدونة علي المدى الطويل في المشبك PF-CF ، كما هو مستخدم في البروتوكولين 1 و 2 (الشكل 4، الشكل 5) ، علي الرغم من cf-التحفيز وحدها في التردد العالي التي يسببها المحدودة24. كما ان شكل الارتفاع المعقد ، الذي أثاره البروتوكول 1 ، لم يكن له علاقة كبيره مع السعه المحدودة (الشكل 3). ولعل شكل الارتفاع المعقد يعكس متوسط Ca2 +-تركيز ، ولكن لم تمثل ca المحلية2 +-التركيز في branchlet حيث كان مستحثا المحدودة.

وفيما يتعلق التحفيز pf, علي الرغم من ان 1 pf التحفيز كان يستخدم تقليديا للحث علي المخيخ المحدودة26,27, الخلية الحبيبية تميل إلى إطلاق النار في وضع الاندفاع في فيفو37. ولذلك ، فان التنشيط المتعدد لل PF يكون أفضل من التحفيز PF واحد لتقليد نمط إطلاق النار الفسيولوجية ، والتنشيط mGluR1 يعتمد علي عدد وتردد PF إطلاق النار38. التالي ، فان البروتوكول-2 سينشط PKC بشكل أكثر كثافة من البروتوكول-1. في بعض تحور GluA2 تدق في الفئران (K882A) ، فقط بروتوكول-2 كان كافيا للحث علي المحدودة بالمقارنة مع البروتوكول 132، مما يوحي بان تركيزا اعلي من المنشطة pkc كان مطلوبا للحث علي المحدودة لهذه الطفرة GluA2 خاصه.

ومن شان التحفيزات المتعددة لل PF زيادة حدوث التعريفي المحدودة ، ولكن تفعيل الجهد التابعة Ca2 +-قناه عبر التحفيز CF أو الاستقطاب الجسدي كان لا يزال مطلوبا. من أجل زيادة تفعيل الجهد المعتمدة Ca2 +-قناه في dendrite pc ، حيث تم تحفيز PF ، تم تشويه جسم الخلية من جهاز الكمبيوتر تحت الجهد المشبك الظروف30. عند استخدام الحل الداخلي القائم عليCs +، زادت مقاومه الإدخال بشكل ملحوظ32، مما يوحي بزيادة في ثبات الكابل. التالي ، سيتم زيادة عدد القناات المنشطة Ca2 +-في المنطقة البعيدة من تغصن PC. في بعض الفئران متحولة GluA2 (Δ7) ، 2PF التحفيز + الاستقطاب الجسدي (بروتوكول 3) أو 5 PF التحفيز + الاستقطاب الجسدي (البروتوكول 4) يمكن ان تحفز المحدودة. وعلي العكس من ذلك ، لم يلاحظ اي ظاهره المحدودة من قبل البروتوكول 1 أو 2 التحفيز. قد يكون هذا الاستقطاب الجسدي تحت ظروف الجهد المشبك معCs +-الحل الداخلي تنشيط الجهد تعتمد Ca2 +-القناات يحدث بشكل أكثر فعاليه من التنشيط بواسطة CF-التحفيز تحت ظروف المشبك الحالية مع الحل الداخلي القائم عليK +، وهذا قد يسبب زيادة غير المضافة في [Ca2 +]في39 واللاحقة pkc قويه-التنشيط المطلوبة لل LTD.

اليه التعويضية الممكنة لل LTD في الجينات التلاعب الحيوانية

الدراسة النظرية يفترض التنشيط نوع كل أو لا شيء من PKC علي40التعريفي المحدودة ، ولكن في النتائج التجريبية باستخدام بعض الكائنات التلاعب الجينات مثل GluA2 تدق في الفئران أظهرت ان تفعيل pkc تختلف اعتمادا علي التعريفي المحدودة بروتوكولات32. ومن بين البروتوكولات الاربعه المختلفة ، كان بروتوكول الاستقراء الأكثر فعاليه لتنشيط النظام الكتروني للبروتوكول الثاني هو البروتوكولين 3 و 4 ، يليهما البروتوكول 2 والأضعف هو البروتوكول 1. في الجينات التلاعب الحيوانية ، واليات التعويضية قد تسبب المحدودة32. وقد تكون لهذه أليات التعويضية حساسية اقل لتنشيط PKC. إذا كان الأمر كذلك ، ومجموعات متعددة من البروتوكولات التي تحفز المحدودة ، بما في ذلك واحد والتي يمكن تفعيل PKC اقوي من البروتوكولات التقليدية ، من الضروري تقييم القدرة التعريفي المحدودة في الجينات التلاعب الجين. علي الرغم من التحريض العادي المحدودة معCs +-المستندة إلى حل داخلي في مثقف أجهزه الكمبيوتر15 أو أجهزه الكمبيوتر في شرائح30، وهو الحل الداخلي القائم عليcs +ليس الفسيولوجية. ومع ذلك ، فان تفعيل القناة Ca2 +-المعتمدة علي الجهد الكهربي في تغصن البعيدة أمر صعب باستخدام الاستقطاب الجسدي في الشريحة ، بسبب الضرر الميكانيكي المحتمل اثناء الاعداد والتسجيل مما قد يسبب انخفاضا في طول ثابت. وهكذا ، لضمان تفعيل Ca2 +-القناات في المنطقة الجذعية المحفزة PF ، فمن الضروري استخدام بروتوكول الذي يزيد من طول ثابت باستخدامCs +-الحل الداخلي.

الظروف التجريبية الأخرى

وينبغي أيضا ان تؤخذ عوامل أخرى في الاعتبار عندما يتم فحص اللدونة متشابك والسلوك الحيواني في موازاة ذلك مثل مطابقه للعمر الحيواني وتسجيل درجه الحرارة في المختبر ، وذلك لان الثوابت معدل محول الاشاره والاتجار مستقبلات حساسة لدرجه الحرارة العالية. في الواقع, التعلم الحركي في الجسم الآخر خفض عدد السطح الذي أعرب عنه المستقبلات الغلوتامات نوع امبا41 وحجم البسيطة epsc غير متزامن في PF-PC المشبك42. من الناحية المثالية ، يجب ان يتم تسجيل المشبك التصحيح الخلية الكاملة في 37 درجه مئوية ، ومع ذلك ، من الصعب تسجيل مستقر علي المدى الطويل في 37 درجه مئوية. التالي ، أجريت جميع التسجيلات الكهربائية في هذه الدراسة في حوالي 30 درجه مئوية. علي الرغم من ان درجه الحرارة هذه اقل من درجه الحرارة الفسيولوجية ، فانه لا يزال توفير المزيد من الظروف المواتية للمقارنة خصائص متشابك تحليلها في المختبر مع القدرة علي التعلم السلوكي. وقد يكون هذا الاختلاف في درجات حرارة التسجيل عاملا آخر يؤدي إلى اختلاف هذه النتائج عن التقرير السابق26. الاضافه إلى ذلك ، تقييم ثبات خصائص الغشاء السلبي32 والاستثارة الذاتية43،44 هو أيضا مهم في دراسة اللدونة متشابك.

في الختام ، للتحقيق في العلاقة السببية بين اللدونة متشابك والسلوك الحيواني في الجينات التلاعب الكائنات الجينية ، وتقييم اللدونة متشابك في المختبر يتطلب التحكم الدقيق في الظروف التجريبية مثل استخدام درجه الحرارة تنظيم وعده أنواع من البروتوكولات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ونشكر ا. اوبا علي مساعدتها التقنية. وقد دعم هذا البحث جزئيا بمنحه المعونة للبحوث العلمية (C) 17K01982 إلى ك امواكو

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. The Cerebellum as a Neuronal Machine. , Springer. New York. (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

Tags

علم الأعصاب الإصدار 152 اللدونة متشابك المحدودة شريحة الدماغ تسجيل الخلايا الكاملة الماوس الخلية Purkinje المخيخ ألياف المتوازية تسلق ألياف
تقييم الحث علي الاكتئاب علي المدى الطويل في شرائح البالغين المخيخار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of … More

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter