Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vurdering af langvarig depression induktion i voksne cerebellar skiver

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859
Automatic Translation
1, 2
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Summary

I nogle genmanipulerede dyr, ved hjælp af en enkelt protokol kan undlade at fremkalde LTD i cerebellar Purkinje celler, og der kan være en uoverensstemmelse mellem LTD og motor læring. Flere protokoller er nødvendige for at vurdere LTD-induktion i genmanipulerede dyr. Standard protokoller vises.

Abstract

Synaptic plasticitet giver en mekanisme til indlæring og hukommelse. For cerebellar motorisk indlæring betragtes langtids depression (LTD) af synaptiske transmissioner fra parallelle fibre (PF) til Purkinje celler (PC) som grundlag for motorisk indlæring, og der observeres mangler ved både LTD og motorisk indlæring i forskellige genmanipulerede dyr. Fælles motorisk lærings sæt, såsom tilpasning af optokinetisk refleks (OKR), vestibulær-okulær refleks (VOR), og rotarod test blev anvendt til evaluering af motorisk indlæringsevne. Men, resultater opnået fra GluA2-carboxy Terminus modificeret Knock-in mus viste normal tilpasning af VOR og OKR, trods mangler PF-LTD. I denne rapport, induktion af LTD blev kun forsøgt ved hjælp af en type af stimulation protokol ved stuetemperatur. Således, betingelser for at inducere cerebellar LTD blev udforsket i samme Knock-in mutanter ved hjælp af forskellige protokoller på nær fysiologiske temperatur. Endelig fandt vi stimulation protokoller, som LTD kunne blive induceret i disse genmanipulerede mus. I denne undersøgelse foreslås en række protokoller til at evaluere LTD-induktion, som vil mere præcist tillade undersøgelse af årsagssammenhæng mellem LTD og motor læring. Afslutningsvis, eksperimentelle betingelser er afgørende, når du evaluerer LTD i genmanipulerede mus.

Introduction

Den synaptiske organisation af de udarbejdede neuronal netværk af cerebellare cortex, sammensat af pc'er, molekylært lag interneuroner (kurv og stellate celler), Golgi celler, PFs fra granulet celler, Mossy fibre og klatring fibre (CFs), er blevet belyst med hensyn til excitation/hæmning og divergens/konvergens, og den velorganiseret kredsløb diagram har antydet, at cerebellum er en "neuronal maskine"1, selv om der var tidligere ingen idé om formålet med denne "maskine". Senere foreslog Marr, at PFs-input til pc'er udgør et tredobbelt lags associativ lærings netværk2. Han foreslog også, at hver CF formidler en cerebral instruktion for elementær bevægelse2. Han antog, at samtidig aktivering af PFs og CF ville forbedre PF-PC synapse aktivitet, og forårsage langsigtede potensering (LTP) af PF-PC synapse. På den anden side antog Albus, at synkrone aktivering af PFs og CF resulterede i Ltd på PF-PC synapser3. Begge de ovennævnte undersøgelser fortolker cerebellum som en unik hukommelse enhed, inkorporering af som i cerebellare kortikale netværk fører til dannelsen af Marr-Albus model lærings maskine model.

Efter disse teoretiske forudsigelser, to linjer af beviser tyder på tilstedeværelsen af synaptisk plasticitet i cerebellum. Den første linje af beviser blev foreslået af den anatomiske organisation af flocculus; Her er MF-veje med vestibulær organ oprindelse og CF-veje af retinal oprindelse konvergerer på pc'erne4. Denne unikke konvergens mønster tyder på, at en synaptisk plasticitet forekommer i flocculus forårsager den bemærkelsesværdige tilpasningsevne af vestibulo-okulær refleks. For det andet, optagelsen af pc'er svar i flocculus og lesioning af flocculus også støttet ovenstående hypotese5,6,7. Desuden, PC udledning mønster under tilpasningen af en abe håndbevægelse8 støttede den synaptiske plasticitet hypotese, især ALBUS Ltd-hypotese3.

For at bestemme arten af den synaptiske plasticitet direkte, gentagen konjunktiv stimulation (CJS) af et bundt af PFs og CF, der specifikt innervates PC in vivo viste sig at inducere Ltd for transmissionseffekten af PF-PC synapser9, 10,11. I de efterfølgende in vitro-udforskninger ved hjælp af en cerebellar skive12 og dyrkede pc'er, sammenholdt med co-dyrkede granulet celle stimulation og oliven celle stimulation13 eller sammenhæng af iontophoretisk anvendt glutamat og somatisk depolarisering14,15 forårsagede Ltd. Den signal transduktionsmekanisme, som lå til grund for Ltd-induktion, blev også intensivt undersøgt med in vitro-præparater16,17.

Tilpasninger af VOR og OKR blev ofte brugt til kvantitativ evaluering af genmanipulerende virkninger på cerebellare motorisk indlæring, fordi vestibule-cerebellare cortex blev vist sig at være den essentielle oprindelse i den adaptive læring af VOR18 ,19,20 og okr19,21 sammenhængen mellem svigt af Ltd-induktion og svækkelse af adfærdsmæssige motorisk indlæring er blevet taget som bevis for, at Ltd spiller en væsentlig rolle i motor lærings mekanismer22. Disse synspunkter betegnes kollektivt som Ltd-hypotesen om motor læring eller Marr-Albus-Ito-hypotesen23,24,25,26.

Adaptiv indlæring af øjenbevægelser blev målt ved hjælp af lignende protokoller, mens forskellige eksperimentelle betingelser blev anvendt til at inducere Ltd i Skive tilberedning27,28,29,30,31 . For nylig rapporterede Schonewille et al.26 , at nogle genmanipulerede mus udviste normal motorisk indlæring, men de cerebellare skiver viste ikke Ltd, og konkluderede dermed, at Ltd ikke var afgørende for motorisk indlæring. Imidlertid blev induktion af LTD kun forsøgt ved hjælp af en type protokol ved stuetemperatur. Derfor brugte vi flere typer af LTD-inducerende protokoller under optagelses forhold på omkring 30 °C, og vi bekræftede, at LTD blev pålideligt induceret i de genmanipulerede mus ved hjælp af disse protokoller ved nær fysiologiske temperaturer32.

Der er dog stadig nogle spørgsmål vedrørende de grundlæggende egenskaber af konjunktiv stimulation. Den første er forholdet mellem den komplekse Spike form og amplituden af LTD. For det andet, sammenholdt med PF-stimulation og somatisk depolarisering, om antallet af anvendte stimuli var nødvendige eller ikke var undvigende. I denne undersøgelse blev disse spørgsmål undersøgt ved hjælp af Wild type (WT) mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af RIKEN-Udvalget om pasning og anvendelse af dyr til forsøg. Mus blev holdt i dyret facilitet af RIKEN Center for hjernen videnskab under velkontrolleret temperatur (23 – 25 °C) og fugtighed (45% – 65%) Betingelser. Både mænd og kvinder WT mus (C57BL/6, 3 – 6 måneder) blev anvendt.

1. forberedelse af de løsninger, der anvendes i forsøgene

Bemærk: Alle opløsninger bør fremstilles i ultrarent vand uden metaller (resistivitet > 18,2 MΩ) og andre urenheder (totalt organisk kulstof (TOC) < 5,0 PPB). Arbejder kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) til skiveskæring og optagelse er lavet frisk på dagen for eksperiment fra en 10 gange (x10) lager af ACSF. Boble løsningerne med 5% CO2/95% O2 gasblanding før brug. PH-værdien af acsf justeres til 7,4 ± 0,1, og osmolaritet justeres 315 ± 5 mosm/kg ved tilsætning af ultrarent vand.

  1. Forbered 10x lager af ACSF indeholdende 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2po4og 260 mm NaHCO3. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C.
  2. Forbered arbejder ACSF indeholder 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mm mg2så4, 1,25 mm Nah2po4, 26 mm NaHCO3 og 20 mm glucose.
    1. Først tilsættes 1 ml 2 m CaCl2 opløsning efterfulgt af 1 ml 1 M mg2så4 opløsning i omkring 800 ml ultrarent vand, for at undgå nedbør. Tilsæt derefter 100 mL 10x ACSF og glucose. Endelig skal der op til et samlet volumen på 1.000 ml ved tilsætning af ultrarent vand.
  3. Forbered 3,3% agar til hjerne håndtering. 1 g agar opløses i 30 mL 0,9% NaCl-opløsning, og der opvarmes i en mikrobølgeovn, indtil den er kogt. Rør til mix, hæld det derefter i en steril 4 cm x 10 cm plastikkasse og lad det størkne. Agarpladen (~8 mm tykkelse) opbevares i køleskab.
  4. Forbered den interne løsning.
    1. Forbered den K+-baserede interne opløsning, der indeholder 60 mm kcl, 60 mm K-gluconat, 0,3 mm EGTA, 4 mm Mgcl2,4mM ATP, 0,4 mm GTP og 30 mm hepes (pH 7,2).
      Bemærk: Lav koncentration (0,3 mM) af EGTA, en langsom ca2 +-chelator, tilsættes til Chelat muligvis forurenet ca2 + i rent vand, men denne lave koncentration af EGTA i den interne løsning blokerer aldrig induktion af Ltd (figur 3, Figur 4, figur 5) under optagelse i hele cellen. Målt osmotisk tryk er 285 mOsm/kg.
    2. Den cs+-baserede interne opløsning, der indeholder 60 mm CsCl, 46 mm D-gluconat, 27 mm tetraethylammoniumchlorid (Tea-CL), 0,3 mm EGTA, 4 mm Mgcl2,4mM ATP, 0,4 mm GTP og 30 mm hepes (pH 7,2, justeret med CSOH).
      Bemærk: CS+ blokerer spændings afhængige K-kanaler og forbedrer forholdene for plads klemmer ved Fjern dendritter ved at øge længden konstant. Målt osmotisk tryk er 285 mOsm/kg.
    3. Forbered 200 μL aliquoter af opløsninger og opbevar ved-30 °C.

2. hjerne dissektion og trimning

  1. Chill og oxygenat 2 50 mL bægre af ACSF på is, indtil temperaturen er lavere end 4 °C. Tilsæt 50 μL tetrodotoxin (TTX, 1 mM) til en af de iskold bægre i ACSF, og reserver den til skæring af skiver. For at opnå mus cerebellar skive forbeholde LTD-inducerende evne, tilsætning af TTX til den normale ACSF er nødvendig.
  2. Nedkøling metal prøve bakken ved at fylde et isbad i udsnitskammeret med is.
  3. Hæld 1 mL isofluran i en bedøvelses krukke (~1000 ml) og Placer derefter en mus i den for 30 – 45 s. Sørg for, at musen er dybt bedøvet ved at bekræfte sin manglende evne til at reagere på mekanisk stimulation.
  4. Decapitate musen ved hjælp af kirurgisk saks. Hold hovedet og skær den overfladiske hud langs midterlinjen ved hjælp af en oftalmologisk Scissor. Træk huden ved at holde med fingrene til bredt udsætte kraniets overflade.
  5. Skær kraniet vandret langs en linje fra det store neurologiske hul lige over øret og øjet ved hjælp af en oftalmologisk Scissor. Skær kraniet langs en linje over begge øjne og fjerne for at isolere kraniet.
  6. Skær hjernen i midten af cerebrum ved hjælp af en skalpel, derefter isolere den hale del af hjernen, herunder cerebellum fra kraniet. Sænk det ind i en iskold bæger af ACSF. Normalt, den samlede tid fra hugning til nedsænkning af hjernen blok i præ-kølet bæger af acsf bør være mindre end 60 s.
  7. Placeringen af boblende slange bør justeres for ikke at røre hjerne blokken i bægerglasset. Mekanisk beskadigelse kan forårsage hævelse af skive under optagelsen. Efterlad det i mindst 7 min og lad hjernen til at køle ned.
  8. For at trimme hjerne blokken skæres en rektangulær agar brik (2 cm x 2 cm) fra en stor agar plade (4 cm x 10 cm, opbevares ved 4 °C) og sætte det på et filterpapir til at absorbere den overskydende væske.
  9. Drej agar-stykket på hovedet på filtrerpapiret, og Placer derefter agar-stykket på et filtrerpapir på en forkølet metal prøve bakke (16 cm x 20 cm). Pick up hjernen blok ved hjælp af en spatel og absorbere overdreven væske omkring det med et stykke filterpapir.
  10. Monter hjerne blokken på agar blokken ved hjælp af lim (medicinsk cyanoacrylat instant klæbemiddel). Sørg for at vedhæfte bunden (ventral side) af hjernen blok til agar.
  11. Skær den højre halvkugle ud med en klinge. Sørg for, at siden af beskæringsplanet er så parallel som muligt til pc'ens dendritiske plan, fordi denne side er fastgjort til overfladen af prøve bakken. Skær og fjern den anden side af halvkugle. Derefter skæres hjernen mellem den overlegne og ringere colliculi, og afbrød rygmarven.
  12. Lim højre side af trimmet cerebellum med agar blokken på den præ-afkølede prøve bakke. Sprede overskydende lim omkring cerebellum med den flade del af en spatel, for at forhindre overskydende lim fra fastgørelse til cerebellare overflade. VIP metal bakken og hæld ACSF for at fastgøre limen og vaske den overskydende lim væk.

3. hjerne skæring

  1. Drej prøven således, at Rygsiden af cerebellum er på forsiden. Hæld iskold skæring ACSF, indeholder 1 μM TTX, tilstrækkelig til at nedsænke cerebellum helt. Anbring et gasrør i ACSF og begynd at boblende med O2/Co2 gasblanding.
  2. Fjern gennem mater med en fin pincet under kikkert. Skær cerebellare pedonkel med et blad, og fjern hjernestammen og agar blokken. Drej bakken 180 °, så den dorsale overflade af cerebellum vender mod en Razorblade.
  3. Indstil klingen, og Juster den første skære placering. Indstil vibratome udskæring parametre til følgende: amplitude til 5,5, frekvens til 85 Hz, hastighed til 3 – 4, og skive tykkelse til 300 μm.
  4. Overfør cerebellar skive på et nylon-net i en akryl inkubator og sænk skiven helt ind i den oxygenerede ACSF. Inkubator skal anbringes i et vandbad, der fastholder en temperatur ved 26 °C.
  5. Opbevar udsnittene i mindst 1 time for at tillade genoprettelse efter beskadigelse under udskæring.

4. hel-celle patch-klemme optagelse

Bemærk: En patch-clamp optagelse kræver følgende udstyr: et opretstående mikroskop med infrarød differentiale interferens kontrast (IR-DIC) optik, en patch-clamp forstærker, data digitizer, digital stimulator, isolator, computer, software til data-erhvervelse og analyse, motoriseret manipulator, mikroskop platform, vibrations isolerende bord, Faraday bur, opløsning varmesystem, peristaltiske pumper og elektrode Puller.

  1. Tilsæt picrotoxin (0,1 mM) til ACSF og løse det ved hjælp af ultra-sonikering i 3 min.
  2. Perfuse et optage kammer med picrotoxin-holdige, O2-Co2-mættet acsf med en hastighed på 2 ml/min. Hold temperaturen i optagelses kammeret på omkring 30 °c.
  3. Lav en optagelses elektrode ved at trække et borosilikat glas kapillar med glødetråd (udvendig diameter = 1,5 mm) ved hjælp af en aftrækker med 4 trin. Spids diameteren skal være ca. 1 μm.
  4. Lav en stimulerende elektrode ved at trække i den samme kapillar ved hjælp af pulleren med 2 trin, og bryd derefter for at producere en fin spids ved at ramme spidsen mod en jern blok under et Binokulært mikroskop. Den endelige diameter skal være 3 – 5 μm.
  5. Overfør cerebellar skive til optage kammeret og ordne det med en PT-vægt med nylontråde. Fyld en stimulerende elektrode med ACSF.
  6. For stimulering af PFs, Placer den stimulerende elektrode på overfladen af det molekylære lag, omkring 50 μm væk fra Purkinje cellelag.
  7. Til stimulering af CF placeres den stimulerende elektrode i bunden af Purkinje-cellelag (trin 5,3, 5,4).
  8. Filtrer K+-baseret eller cs+-baseret intern løsning med et 0,45 μm filter. Brug en mikro-loader til at fylde en optagelses elektrode med 8 μL intern opløsning.
  9. Påfør et svagt positivt tryk på optage elektroden, inden den nedsænkes i ACSF. Modstanden bør være 2 – 4 MΩ, og det flydende supplerende potentiale bør korrigeres.
  10. Nærme sig den sunde, lyse celle krop af pc'en med optagelsen elektrode. Skub overfladen af Purkinje celle lidt, stop med at anvende positivt tryk, næste anvende negativt tryk, indtil der dannes en Giga-ohm forsegling. Derefter etablere hele cellen konfiguration ved hjælp af negativt tryk.
  11. Hold membranpotentialet ved-70 mV, og Anvend-2 mV puls (varighed, 100 ms) ved 0,1 Hz til at overvåge input modstand, serie modstand og input kapacitans, kontinuerligt. Brug ikke serie resistens kompensationen. Kassér data, når serie modstanden varierer med mere end 15%.

5. induktion af LTD

  1. Stimulere det molekylære lag med en puls (varighed, 0,1 MS). Identificer de PF-excitatoriske postsynaptiske strømme (EPSC) ved at anvende en dobbelt impuls stimulus (interspike interval (ISI) af 50 MS). PF-EPSC bør vise parret-Pulse lettelse og gradvis stigning i amplitude i forhold til stigning i stimulation intensitet.
  2. Test responset fra PF-EPSC registreres ved at anvende en enkeltpuls ved 0,1 Hz. Juster intensiteten af stimulus, så den fremkaldte EPSC amplitude er omkring 200 pA. Undgå kontaminering af strømmen gennem den spændings afhængige ionkanal.
  3. Stimulere CF i bunden af Purkinje cellelag, og identificere EPSC fremkaldt af CF aktivering (ved at anvende en dobbelt impuls stimulus). CF-EPSC skal vise parret-puls depression og en alt-eller-ingen måde i henhold til stigningen i stimulation intensitet. For LTD induktion, en enkelt stimulus bør anvendes.
  4. LTD-inducerende protokol 1
    1. Ved hjælp af en elektrode, der indeholder K+-baseret intern opløsning under strøm klemmer, anvendes en enkelt PF-stimulus og et enkelt CF-stimulus samtidigt ved 1 Hz i 5 min (300 pulser) (figur 1a).
  5. LTD-inducerende protokol 2
    1. Ved hjælp af en elektrode-holdige K+-baseret intern løsning under nuværende-clamp betingelser, anvende dobbelte PF-STIMULI (ISI af 50 MS) og single CF-stimulus som den anden PF-stimulus er sammenfaldende med CF-stimuli ved 1 Hz for 5 min (figur 1b).
  6. LTD-inducerende protokol 3
    1. Ved hjælp af en elektrode, der indeholder cs+-baseret intern opløsning under spændings klemmer, anvendes en dobbelt PF-STIMULUS (ISI på 50 MS) og et enkelt depolariserende spændings trin (-70 til 0 mV, 50 MS) til Soma ved 1 Hz i 3 min, således at den anden PF-stimulus er som svarer til begyndelsen af det depolariserende spændings trin (figur 1c).
  7. LTD-inducerende protokol-4
    1. Ved hjælp af en elektrode, der indeholder cs+-baseret intern opløsning under spændings klemmer, anvendes PF-stimuli (5x ved 100 Hz) og et enkelt depolariserende spændings trin (-70 til 0 mV, 50 MS) til soma ved 0,5 Hz i 3 min. samtidigt (figur 1d ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fire protokoller blev anvendt i dette studie til at inducere cerebellar LTD. I de to første protokoller (protokol 1 og 2) blev der anvendt en kombination af PF-stimulation og CF-stimulation under de nuværende klemmer forhold. I de to andre protokoller (protokol 3 og 4) blev den somatiske depolarisering erstattet af CF-stimulation under spænding-klemme forhold. Spændings spor eller strøm spor under konjunktiv stimulation blev sammenlignet (figur 2).

Kombination af 1 PF-stimulation og 1 CF-stimulation under strøm-klemme betingelser (protokol-1) blev konventionelt anvendt til skive tilberedning26,27. Formen af den komplekse Spike fremkaldt af CJ var magen til den fremkaldt af CF-stimulation alene, med den første stejle spikelet efterfulgt af 2 til 3 småaks (figur 2a). En lignende formet kompleks Spike blev observeret under stimulation med protokol 2, nemlig 1 PF-stimulation blev fulgt 50 MS senere af en konjunktiv anden PF-og CF-stimulation (figur 2b). Under spændings klemmer ved hjælp af en cs+-baseret intern opløsning blev der anvendt en 2 PF stimulation og somatisk depolarisering (protokol 3) (figur 2c). Den første PF-stimulation blev fulgt 50 MS senere ved en samtidig anvendelse af en anden PF-stimulation og somatisk depolarisering. En aktiv strøm blev fremkaldt ved somatisk depolarisering fra-70 til 0 mV. En hale strøm blev også fremkaldt efter repolarisering. Sommetider blev der observeret gentagen generering af en aktiv strøm, hvilket ville afspejle ca-Spike-aktiviteten i den fjerntliggende dendritiske region, hvor membranpotentialet ikke var tilstrækkeligt fastspændt, på trods af at der blev brugt en cs+-baseret intern løsning ( Figur 2c). Endelig blev 5 PF-stimuli ved 100 Hz givet samtidig med somatisk depolarisering under spændings klemnings betingelser (protokol 4). Igen, gentagen generation af indadvendte strømme blev fremkaldt under depolarisering og en hale strøm blev fremkaldt efter repolarisering. Timingen af den gentagne generation af den indadvendte strøm blev ikke synkroniseret med PF-stimuli (figur 2D). Nogle gange fortsatte gentagen generering af aktiv strømmen efter repolarisering.

Med hensyn til LTD induceret af protokoller-1 og-2, reduktion af EPSC-amplitude målt i løbet af 25-min efter indtræden af CJ var spredt over en relativt bred vifte32. Sammenlignet med den stabile form af PF-EPSP, formen af komplekse Spike var ganske variabel fra celle til celle. Fordi småaks i en kompleks Spike afspejlede ca2 +-kanal aktivering33, formen af en kompleks spike, såsom amplitude eller stejlhed af småaks, der påvirker Ltd amplitude blev undersøgt med den komplekse Spike fremkaldt af protokol 1. Fordi formen af de komplekse pigge fremkaldt af protokol 2 var forurenet med PF-EPSP, vi ikke analysere disse data. For det første var summen af alle småaks (1 – 4)-amplitude korreleret med amplituden af Ltd (-δepsc%) (Figur 3A, B). Korrelationskoefficienten (r) var 0,28, men var ikke statistisk signifikant (p > 0,5). Da småaks 2 – 4 indeholdt mere af ca2 +-komponenten34, var summen af spikelet (2 – 4)-amplitude korreleret med Ltd-amplitude. Korrelationen syntes at være stærkere (r = 0,67), men stadig ikke statistisk signifikant (p > 0,1) (figur 3c). Dernæst blev den maksimale værdi af dVm/dt (maksimal stigningshastighed [MRR]) for hver spikelet beregnet (figur 3D), fordi produktet af membran kapacitans (cm) og DVM/dt groft afspejler membran strømninger35. Sammenhængen mellem produktet af cm og summen af mrrs af småaks (1 – 4) og Ltd-amplitude blev undersøgt (figur 3e), og r var 0,18 (p > 0,9). Sammenhængen mellem produktet af cm og summen af MRR af småaks (2 – 4) viste en lidt stærkere r (0,36), men det var ikke signifikant (p > 0 .6) (figur 3F).

Under spændings klemme betingelser, protokol 3 med 180 CJS effektivt induceret LTD (figur 4b)32. Men, om et mindre antal stimuli effektivt kan inducere LTD forbliver ukendt. Således, 60 CJS blev anvendt på 1 Hz for 1 min. omkring 10 min efter CJ, EPSC amplitude blev undertrykt, men, det inddrives på 15 min efter CJ-debut. Dette tyder på, at 60 gange CJS ved 1 Hz var utilstrækkelig til at inducere LTD (figur 4a). Desuden inducerede gentagelse af somatisk depolarisering alene (180 gange) ikke LTD (figur 4b)32.

Protokol 4 blev oprindelig brugt af Steinberg et al.30 til unge mus (P14 – 21). LTD blev efter sigende induceret af 30 CJS ved 0,5 Hz på RT i vildtype cerebellum. Men, når 30 CJS blev anvendt til voksne mus cerebellar Skive (3 – 6 måned) ved omkring 30 °C, ingen LTD blev induceret (figur 5a). I modsætning hertil, når 90 CJS blev anvendt, den sædvanlige amplitude af LTD blev observeret (figur 5b)32. Igen inducerede somatiske depolarisering alene (90 gange ved 0,5 Hz) ikke LTD (figur 5b).

Figure 1
Figur 1: skematisk illustration af protokoller til at fremkalde Ltd i PF-PC synapse. (A) protokol 1 CJ. 1 PF og 1 CF stimuli påføres samtidigt 300 gange ved 1 Hz (5 min) under strøm-klemme betingelser. Elektrode til hel-celle optagelse indeholder K+-baseret intern opløsning. (B) protokol 2 CJ. 2 PF og 1 CF stimuli påføres samtidigt 300 gange ved 1 Hz (5 min) under strøm-klemme tilstand. Elektrode indeholder K+-baseret intern opløsning. (C) protokol 3 CJ. 2 PF og somatisk depolarisering (-70 til 0 mV, 50 MS) påføres 180 gange ved 1 Hz (3 min) under spænding-clamp betingelse, således at den anden PF stimulus anvendes samtidig med begyndelsen af den somatiske depolarisering. Elektrode indeholder cs+-baseret intern løsning. (D). protokol 4 CJ. 5 PF ved 100 Hz og somatisk depolarisering anvendes 90 gange ved 0,5 Hz (3 min) under spænding-klemme tilstand, samtidig. Elektrode indeholder cs+-baseret intern løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: spænding eller aktuelle spor af pc'en under forbindelse stimulation. (A) membran potentiel spor fremkaldt af protokol 1 CJ. (B) membran potentiel spor fremkaldt af protokol 2 CJ. (C) membran nuværende spor fremkaldt af protokol 3 CJ. (D) membran nuværende spor fremkaldt af protokol 4 CJ. Lodrette stænger = 10 mV (A og B), 1 nA (C og D). Vandret bjælke = 20 MS. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: forholdet mellem spikelet af en kompleks Spike og Ltd-amplitude. A) repræsentativt spor af et komplekst spike, der er fremkaldt af protokol 1. Pile indikerer toppe af småaks (1 – 4). Skala bar = 20 mV. B) forholdet mellem summen af amplituden af småaks (1 – 4) og Ltd-amplitude (-δepsc%) (r = 0,28, s > 0,5). (C) forholdet mellem summen af amplituden af småaks (2 – 4) og Ltd-amplitude (r = 0,67, p > 0,1). D) repræsentativt spor af differentierede komplekse pigge vist i A. pile indikerer toppe af DVm/DT af småaks. Skala stænger = 5 MS, 50 V/s. (E) forholdet mellemprodukter af cm og summen af MRR af småaks (1 – 4) og amplitude af Ltd (-δepsc%) (r = 0,18, s > 0,7). F) forholdet mellem produktet af cm og summen af MRR af småaks (2 – 4) og amplitude af Ltd (r = 0,36, p > 0,4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: effekten af antallet af gentagelser på Ltd-induktion ved hjælp af protokol-3 CJ. (A) svigt af Ltd induktion af protokol-3 CJ, gentagelse var 60 ved 1 Hz. Mean PF-EPSC amplitude indspillet før og efter protokol-3 CJ (sort kolonne i bunden). PF-EPSC amplitude blev normaliseret af dem, der er registreret før CJ. udfyldt symbol indikerer den gennemsnitlige EPSC amplitude. Fejllinjer betegner SEM. inset: overlejret PF-EPSC spor (top) blev indspillet før (markeret 1) og 25 – 29 min efter CJ-STIM debut (markeret 2). Hvert spor repræsenterer gennemsnittet af 6 poster. Skala stænger = 100 pA, 10 MS. (B) rødt symbol: Ltd induceret af protokol 3 CJ, gentagelse var 180 gange ved 1 Hz. blåt symbol: ingen kombination stimulation men somatisk depolarisering blev anvendt 180 gange ved 1 Hz. Ltd blev ikke induceret. Inset: overlejret PF-EPSC spor (top) blev indspillet før (mærket 3) og 25 – 29 min efter CJ-STIM debut (mærket 4). Hvert spor repræsenterer gennemsnittet af 6 poster. Skala stænger = 100 pA, 10 MS. data vist i B er den samme, der anvendes i figur 3B i Yamaguchi et al.32. (C). Resumé plot af Mean PF-EPSC amplitude registreret i løbet af 25 – 29 min efter debut af CJ. depol: depolarisering. Numerisk tegn i parenteser repræsenterer antallet af celler. x60 = 60 gange, x180 = 180 gange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: effekten af antallet af gentagelser på Ltd-induktion ved hjælp af protokol 4 CJ. (A) svigt af Ltd induktion ved protokol 4 CJ, gentagelse var 30 gange ved 0,5 Hz. Mean PF-EPSC amplitude indspillet før og efter protokol-4 CJ (sort kolonne på thr bund). Udfyldt symbol indikerer den gennemsnitlige EPSC amplitude. Fejllinjer betegner SEM. inset: overlejret PF-EPSC spor (top) blev indspillet før (markeret 1) og 25 – 29 min efter CJ-STIM debut (markeret 2). Hvert spor repræsenterer gennemsnittet af 6 poster. Skala stænger = 100 pA, 10 MS. (B) rødt symbol: Ltd induceret af protokol 4 CJ., blå symbol: ingen sammenhæng stimulation men somatisk depolarisering blev anvendt 180 gange ved 0,5 Hz. Ltd blev ikke induceret. Inset: overlejret PF-EPSC spor (top) blev indspillet før (mærket 3) og 25 – 29 min efter CJ-STIM debut (mærket 4). Skala stænger = 100 pA, 10 MS. data vist i B er den samme, der anvendes i figur 4B i Yamaguchi et al. 32.C). Resumé plot af Mean PF-EPSC amplitude registreret i løbet af 25 – 29 min efter debut af CJ. Depol: depolarisering. Numerisk tegn i parenteser repræsenterer antallet af celler. x30 = 30 gange, x90 = 90 gange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskelle mellem de fire protokoller

I LTD-inducerende protokoller 1 og 2, CJS 300 gange ved 1 Hz er tilstrækkelig til at inducere cerebellar LTD. stimulation hyppigheden af CF syntes at være i et fysiologisk område, fordi den komplekse Spike fyring sats i Alert voksne mus (P60) blev rapporteret til at være 1,25 Hz36. CF-stimulationen alene forårsagede imidlertid ikke langvarig plasticitet i PF-CF-synapse som anvendt i protokol 1 og 2 (figur 4, figur 5), men CF-stimulation alene ved højere frekvens induceret Ltd24. Formen af den komplekse spike, fremkaldt i protokol 1, havde heller ikke nogen signifikant forbindelse med LTD-amplitude (figur 3). Måske formen af den komplekse Spike afspejler den gennemsnitligt ca2 +-koncentration, men ikke repræsentere den lokale ca2 +-koncentration i en BRANCHLET hvor Ltd blev induceret.

Med hensyn til PF stimulation, selv om 1 PF stimulation var konventionelt anvendes til at fremkalde cerebellar Ltd26,27, granulet celle tendens til at skyde i burst mode in vivo37. Derfor ville flere aktiveringer af PF være bedre end en enkelt PF stimulation til at efterligne den fysiologiske fyring mønster, og mGluR1 aktivering afhang af antallet og hyppigheden af PF fyring38. Således ville protokol-2 aktivere PKC mere intensivt end protokol-1 gjorde. I nogle muterede GluA2 Knock-in mus (K882A), kun protokol-2 var tilstrækkelig til at inducere LTD i forhold til protokol 132, tyder på, at en højere koncentration af aktiverede PKC var forpligtet til at inducere Ltd for denne særlige GluA2 mutation.

Flere stimuleringer af PF ville øge forekomsten af LTD-induktion, men aktivering af en spændings afhængig ca2 +-kanal via CF-stimulation eller somatisk depolarisering var stadig påkrævet. For at øge aktiveringen af en spændings afhængig ca2 +-kanal på pc'en dendrit, hvor PF blev stimuleret, celle kroppen af pc'en blev depolariseret under spænding-klemme betingelser30. Ved brug af en cs+-baseret intern løsning steg input modstanden markant32, hvilket tyder på en stigning i kabel konstanten. Derfor vil antallet af aktiverede ca2 +-kanaler i det distale område af pc'en dendrit øges. I nogle GluA2 muterede mus (Δ7), 2PF stimulation + somatisk depolarisering (protokol 3) eller 5 PF stimulation + somatisk depolarisering (protokol 4) kunne inducere LTD. omvendt, ingen LTD fænomen blev observeret ved protokol 1 eller 2 stimulation. Det kan være, at somatisk depolarisering under spænding-clamp betingelser med CS+-intern løsning aktiveret spændings afhængige ca2 +-kanaler forekommer mere effektivt end aktivering af CF-stimulation under strøm-clamp betingelser med K+-baseret intern løsning, og dette kan forårsage en ikke-additiv stigning i [ca2 +]i39 og en efterfølgende robust PKC-aktivering kræves for Ltd.

Eventuel kompensationsmekanisme for LTD i genmanipulerede dyr

Teoretisk undersøgelse antager en all-eller-None type aktivering af PKC upon LTD induktion40, men i eksperimentelle resultater ved hjælp af nogle genmanipulerede dyr såsom GluA2 Knock-in mus viste, at aktivering af PKC varierede afhængigt af Ltd induktion protokoller32. Blandt 4 forskellige protokoller var den mest effektive induktions protokol til aktivering af PKC protokoller 3 og 4, efterfulgt af protokol 2, og de svageste var protokol 1. I genmanipulerede dyr kan kompensationsmekanismerne forårsage LTD32. Sådanne kompensationsmekanismer kan have lavere følsomhed over for aktiveret PKC. Hvis ja, flere sæt af LTD-inducerende protokoller, herunder en, der kan aktivere PKC stærkere end konventionelle protokoller, er nødvendigt at evaluere LTD induktions evne i genmanipulerede dyr. Selvom normal induktion af LTD med CS+-baseret intern løsning er rapporteret i kulturperler pc'er15 eller pc'er i skiver30, en cs+-baseret intern løsning er ikke fysiologisk. Men aktivering af en spændings afhængig ca2 +-kanal ved en fjern dendrit er vanskelig ved at bruge somatisk depolarisering i Skive, på grund af de mulige mekaniske skader under klargøring og optagelse, som kan forårsage et fald i længde-konstant. For at sikre aktivering af ca2 +-kanaler i den PF-stimulerende dendritiske region er det derfor nødvendigt at bruge en protokol, der øger længden-konstant ved hjælp af en cs+-intern løsning.

Andre eksperimentelle betingelser

Andre faktorer bør også tages i betragtning, når synaptisk plasticitet og dyrs adfærd undersøges parallelt, såsom matchning af dyrenes alder og optage temperatur in vitro, fordi signal transduktionsfrekvensen konstanter og receptor handel er meget temperaturfølsomme. Faktisk, motorisk indlæring in vivo reduceret antallet af overflade udtrykt AMPA-type glutamat receptorer41 og størrelsen af asynkron mini-EPSC på PF-PC synapse42. Ideelt set skal hele cellen patch clamp optagelse ske ved 37 °C, men en stabil langtids optagelse er vanskelig ved 37 °C. Derfor blev alle elektrofysiologiske optagelser i dette studie udført ved ca. 30 °C. Selv om denne temperatur er lavere end fysiologisk temperatur, det stadig ville give mere gunstige betingelser for at sammenligne synaptisk egenskaber analyseret in vitro med adfærdsmæssige indlæringsevne. Denne forskel i optagelses temperaturer kan være en anden faktor til at få disse resultater til at afvige fra den forrige rapport26. Hertil kommer, vurdering af konstans af passive membran egenskaber32 og iboende excitabilitet43,44 er også vigtigt i studiet af den synaptiske plasticitet.

Afslutningsvis, at undersøge årsagssammenhæng mellem synaptisk plasticitet og dyrs adfærd i genmanipulerede dyr, vurdering af synaptisk plasticitet in vitro ville kræve omhyggelig kontrol af eksperimentelle betingelser såsom ved hjælp af temperatur forordning og flere typer protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker A. Oba for hendes tekniske assistance. Denne forskning blev delvis støttet af støtte til videnskabelig forskning (C) 17K01982 til K.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. The Cerebellum as a Neuronal Machine. , Springer. New York. (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

Tags

Neurovidenskab synaptisk plasticitet LTD hjerne skive hel-celle optagelse mus Purkinje celle cerebellum parallel fiber klatring fiber
Vurdering af langvarig depression induktion i voksne cerebellar skiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of … More

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter