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Neuroscience

वयस्क सेरेबेलर स्लाइस में दीर्घकालिक अवसाद प्रेरण का आकलन

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859
Automatic Translation
1, 2
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Summary

कुछ जीन-मैन्युलेटेड जानवरों में, एक एकल प्रोटोकॉल का उपयोग कर के लिए सेरेबेलर Purkinze कोशिकाओं में लिमिटेड प्रेरित करने में विफल हो सकता है, और वहाँ लिमिटेड और मोटर सीखने के बीच एक विसंगति हो सकती है. जीन-मैन्युलेटेड पशुओं में लिमिटेड-इनक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एकाधिक प्रोटोकॉल आवश्यक हैं। मानक प्रोटोकॉल दिखाए जाते हैं।

Abstract

Synaptic plasticity सीखने और स्मृति के लिए एक तंत्र प्रदान करता है. सेरेबेलर मोटर सीखने के लिए, समानांतर फाइबर (पीएफ) से पारकिंजे कोशिकाओं (पीसी) से synaptic प्रसारण की लंबी अवधि के अवसाद (LTD) मोटर सीखने के लिए आधार माना जाता है, और दोनों लिमिटेड और मोटर सीखने की कमी विभिन्न में मनाया जाता है जीन-मैन्युलेटेड जानवर। आम मोटर लर्निंग सेट, जैसे ऑप्टोकाइनेटिक रिफ्लेक्स (ओकेआर), वेस्टिबुलर-ऑकुलर रिफ्लेक्स (वॉर) और रोटारोड परीक्षण मोटर सीखने की क्षमता के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, GluA2-carboxy टर्मिनस संशोधित दस्तक में चूहों से प्राप्त परिणाम ों VOR और OKR के सामान्य अनुकूलन का प्रदर्शन किया, पीएफ-एलटीडी की कमी के बावजूद. उस रिपोर्ट में, लिमिटेड के प्रेरण केवल कमरे के तापमान पर उत्तेजना प्रोटोकॉल का एक प्रकार का उपयोग करने का प्रयास किया गया था. इस प्रकार, केरेबेलर लिमिटेड प्रेरित करने के लिए शर्तों के पास शारीरिक तापमान पर विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक ही दस्तक में म्यूटेंट में पता लगाया गया. अंत में, हम उत्तेजना प्रोटोकॉल पाया, जिसके द्वारा लिमिटेड इन जीन में प्रेरित किया जा सकता है-manipulated चूहों. इस अध्ययन में, प्रोटोकॉल का एक सेट लिमिटेड प्रेरण का मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तावित है, जो अधिक सही लिमिटेड और मोटर सीखने के बीच कारण संबंध की परीक्षा की अनुमति देगा. अंत में, प्रयोगात्मक स्थितियों महत्वपूर्ण हैं जब जीन में लिमिटेड का मूल्यांकन-मैन्युअल चूहों.

Introduction

सेरेबेलर प्रांतस्था के विस्तृत न्यूरोनल नेटवर्क के synaptic संगठन, पीसी से बना, आणविक परत interneurons (बास्केट और स्टेलेट कोशिकाओं), Golgi कोशिकाओं, ग्रेन्युल कोशिकाओं से पीएफ, काई फाइबर और चढ़ाई फाइबर (CFs), स्पष्ट किया गया है उत्तेजना/अवरोध और विचलन/समन्वय के संदर्भ में, और सुव्यवस्थित परिपथ आरेख ने सुझाव दिया है कि सेरिबैलम एक "न्यूरोनल मशीन"1है, हालांकि इस "मशीन" के उद्देश्य के बारे में पहले से कोई विचार नहीं था। बाद में मरर ने प्रस्ताव किया कि पीसी को पीएफ इनपुट में ट्रिपल लेयर साहचर्य लर्निंग नेटवर्क2का गठन किया गया है . उन्होंने यह भी सुझाव दिया कि प्रत्येक CF मौलिक आंदोलन2के लिए एक मस्तिष्क अनुदेश को व्यक्त करता है . उन्होंने माना कि पीएफ और सीएफ के एक साथ सक्रियण से पीएफ-पीसी synapse गतिविधि में वृद्धि होगी, और पीएफ-पीसी synapse की दीर्घकालिक क्षमता (एलटीपी) का कारण होगा। दूसरी ओर, Albus मान लिया कि पीएफ और CF के तुल्यकालिक सक्रियण PF-पीसी synapses3पर लिमिटेड के परिणामस्वरूप. दोनों उपरोक्त अध्ययन एक अद्वितीय स्मृति डिवाइस के रूप में सेरिबैलम की व्याख्या, जो की शामिल करने के लिए सेरेबेलर cortical नेटवर्क में Marr-Albus मॉडल सीखने की मशीन मॉडल के गठन की ओर जाता है.

इन सैद्धांतिक भविष्यवाणियों के बाद, सबूत की दो लाइनों सेरिबैलम में synaptic प्लास्टिक की उपस्थिति का सुझाव. सबूत की पहली पंक्ति floculus के शारीरिक संगठन द्वारा सुझाव दिया गया था; यहाँ वेस्टिबुलर अंग मूल के एमएफ रास्ते और रेटिना मूल के CF रास्ते पीसी4पर एकाग्र होते हैं . इस अद्वितीय अभिसरण पैटर्न से पता चलता है कि एक synaptic plasticity flocculus में होने वाली वेस्टिबुलो-ओकुलर प्रतिवर्त की उल्लेखनीय अनुकूलनक्षमता का कारण बनता है. दूसरा, पीसी की प्रतिक्रिया की रिकॉर्डिंग फ्लैक्कुलस में और फ्लैक्यूलस के घाव ने भी उपर्युक्त परिकल्पना5,6,7का समर्थन किया । इसके अलावा, एक बंदर के हाथ आंदोलन8 के अनुकूलन के दौरान पीसी निर्वहन पैटर्न synaptic प्लास्टिक परिकल्पना का समर्थन किया, विशेष रूप से Albus है लिमिटेड-हाइपोथेसिस3.

सीधे synaptic प्लास्टिक की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए, बार-बार संयोजक उत्तेजना (CJs) PFs और CF के एक बंडल है कि विशेष रूप से vivo में पीसी innervates के एक बंडल के PF-पीसी synapses9के संचरण प्रभावकारिता के लिए लिमिटेड प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था, 10,11. बाद में इन विट्रो अन्वेषणों में एक सेरिबेलर टुकड़ा12 और सुसंस्कृत पीसी का उपयोग कर, सह-संस्कृत ग्रेन्युल सेल उत्तेजना और जैतून सेल उत्तेजना के संयोजन13 या iontophoretically लागू ग्लूटामेट और दैहिक के संयोजन depolarization14,15 कारण लिमिटेड. एलटीडी-इनक्शन के तहत सिग्नल ट्रांसडक्शन तंत्र की भी इन विट्रो तैयारियों16,17में गहन जांच की गई .

VOR और OKR के रूपांतरों अक्सर सेरेबेलर मोटर सीखने पर जीन हेरफेर प्रभाव के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया, क्योंकि वेस्टिब्यूल-सेरेबेलर प्रांतस्था VOR18 के अनुकूली सीखने में आवश्यक मूल साबित हो गया था ,19,20 और ओकेआर19,21 लिमिटेड-इनक्शन की विफलता और व्यवहार मोटर लर्निंग की हानि के बीच सहसंबंध को इस बात के प्रमाण के रूप में लिया गया है कि लिमिटेड मोटर में एक आवश्यक भूमिका निभाता है शिक्षण तंत्र22| इन विचारों को सामूहिक रूप से मोटर लर्निंग की लिमिटेड परिकल्पना, या Marr-Albus-Ito परिकल्पना23,24,25,26के रूप में संदर्भित किया जाता है .

आंख आंदोलन के अनुकूली सीखने इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग कर मापा गया था, जबकि विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों टुकड़ा तैयारी में लिमिटेड प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया27,28,29,30,31 . हाल ही में, Schonewille एट अल26 की सूचना दी है कि कुछ जीन हेरफेर चूहों सामान्य मोटर सीखने का प्रदर्शन किया, लेकिन सेरेबेलर स्लाइस लिमिटेड नहीं दिखा था, और इस तरह निष्कर्ष निकाला कि लिमिटेड मोटर सीखने के लिए आवश्यक नहीं था. हालांकि, लिमिटेड के प्रेरण केवल कमरे के तापमान पर प्रोटोकॉल का एक प्रकार का उपयोग करने का प्रयास किया गया था। इसलिए, हमने लगभग 30 डिग्री सेल्सियस पर रिकॉर्डिंग शर्तों के तहत कई प्रकार के एलटी-प्रेरित प्रोटोकॉल का उपयोग किया, और हमने पुष्टि की कि लिमिटेड को लगभग शारीरिक तापमान32पर इन प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीन-मैन्युलेटेड चूहों में मज़बूती से प्रेरित किया गया था।

हालांकि, संयोजक उत्तेजना के बुनियादी गुणों के बारे में कुछ सवाल बने हुए हैं। पहला जटिल कील के आकार और लिमिटेड के आयाम के बीच संबंध है. दूसरा, पीएफ-उत्तेजना और दैहिक विध्रुवण के साथ संयोजन के रूप में, चाहे इस्तेमाल किए गए उत्तेजनाओं की संख्या आवश्यक थी या नहीं मायावी थी। वर्तमान अध्ययन में, इन सवालों जंगली प्रकार (WT) चूहों का उपयोग कर जांच की गई.

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Protocol

प्रयोगों में पशुओं की देखभाल और उपयोग के संबंध में आरआईकेएन समिति द्वारा सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को अनुमोदित किया गया था। चूहे अच्छी तरह से नियंत्रित तापमान के तहत मस्तिष्क विज्ञान के लिए RIKEN केंद्र के पशु सुविधा में रखा गया था (23-25 डिग्री सेल्सियस) और आर्द्रता (45%-65%) शर्तों. दोनों पुरुष और महिला WT चूहों (C57BL/6, 3-6 महीने) का इस्तेमाल किया गया.

1. प्रयोगों में प्रयुक्त समाधानों की तैयारी

नोट: सभी समाधान धातुओं से मुक्त अल्ट्राप्यूर पानी में किए जाने चाहिए (प्रतिरोधितिता और 18.2 एम]) और अन्य अशुद्धियां (कुल कार्बनिक कार्बन (टीओसी) और lt; 5.0 ppb)। टुकड़ा काटने और रिकॉर्डिंग के लिए कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) काम कर रहे एक 10 बार (x10) ACSF के शेयर से प्रयोग के दिन पर हौसले से बना रहे हैं. उपयोग से पहले 5% सीओ2/ 95% ओ2 गैस मिश्रण के साथ समाधान बुलबुला। ACSF के पीएच को 7.4 डिग्री 0.1 में समायोजित किया जाता है, और अल्ट्राप्यूर पानी जोड़कर osmolarity को 315 $ 5 mOsm/kg समायोजित किया जाता है।

  1. 1250 एमएम नैकल, 30 एमएम केसीएल, 12.5 एमएम नाएच2पीओ4और 260 एमएम नाहको3से युक्त एसीएसएफ का 10x स्टॉक तैयार करें। इस विलयन को 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
  2. 125 एमएम नैकल, 3 एमएम केसीएल, 2 एमएम केसीएल2,1 एमएम2SO4, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 और 20 m.
    1. सबसे पहले, 2 एम CaCl2 समाधान के 1 एमएल के बाद जोड़ें 1 M Mg2SO4 समाधान लगभग 800 एमएल अल्ट्राप्यूर पानी में, वर्षा से बचने के लिए। फिर 10x ACSF और ग्लूकोज के 100 एमएल जोड़ें. अंत में, ultrapure पानी जोड़कर 1,000 एमएल की कुल मात्रा तक बनाते हैं।
  3. मस्तिष्क से निपटने के लिए 3.3% agar तैयार करें. 1 ग्राम आगर को 30 एमएल में 0.9% नैक्ल विलयन में घोल दें और माइक्रोवेव में तब तक गरम करें जब तक कि वह उबल न जाए। मिश्रण करने के लिए हिलाओ, तो यह एक बाँझ 4 सेमी x 10 सेमी प्लास्टिक बॉक्स में डालना और ठोस करने के लिए अनुमति देते हैं। आगर प्लेटकोफ्रिज में रखें।
  4. आंतरिक समाधान तैयार करें।
    1. कश्मीर+आधारित आंतरिक समाधान जिसमें 60 एमएम केसीएल, 60 एम एम के-ग्लूकोनेट, 0.3 एम एम ईजीटीए, 4 एमएम एमजीसीएल2,4 एमएम एटीपी, 0.4 एमएम एचईपी और 30 एमएम हैप्स (पीएच 7.2) शामिल हैं।
      नोट: EGTA की कम एकाग्रता (0.3 m), एक धीमी Ca2 +-chelator, शुद्ध पानी में संभवतः दूषित Ca2 + chelate करने के लिए जोड़ा जाता है, लेकिन आंतरिक समाधान में EGTA के इस कम एकाग्रता कभी नहीं ब्लॉक लिमिटेड के प्रेरण ( चित्र3, संपूर्ण-कक्षरिकॉर्डिंग के दौरान चित्र 4 , चित्र 5) . मापित परासरणी दाब 285 म/कग्रा है।
    2. सी एस+आधारित आंतरिक समाधान जिसमें 60 एमएम सीएससीएल, 46 एम एम डी-ग्लूकोनेट, 27 एमएम टेट्राएथिलमोनियम क्लोराइड (टीईए-सीएल), 0.3 एमएम ईजीटीए, 4 एम एम एम जीसीएल2,4 एमएम एटीपी, 0.4 एम एम एच ई पी (पीएच 7.2, समायोजित सीएसओएच) तैयार करें।
      नोट: Cs+ ब्लॉक वोल्टेज पर निर्भर कश्मीर चैनल, और लंबाई-स्थिर बढ़ाने के द्वारा दूरदराज के dendrites पर अंतरिक्ष-क्लैम्प की स्थिति में सुधार. मापित परासरणी दाब 285 म/कग्रा है।
    3. समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस एलिकोट्स तैयार करें और -30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. मस्तिष्क विच्छेदन और ट्रिमिंग

  1. ठंड और ऑक्सीजन बर्फ पर ACSF के दो 50 एमएल बीकर जब तक तापमान 4 डिग्री सेल्सियस से कम है. ACSF के बर्फ ठंडा बीकर में से एक में tetrodotoxin (TTX, 1 M) के 50 डिग्री एल जोड़ें और यह स्लाइस काटने के लिए आरक्षित. माउस सेरेबेलर टुकड़ा लिमिटेड-प्रेरित करने की क्षमता को आरक्षित प्राप्त करने के लिए, सामान्य ACSF करने के लिए TTX के अलावा आवश्यक है।
  2. टुकड़ा करने वाले कक्ष के बर्फ-बाथ क्षेत्र को बर्फ से भरकर धातु के नमूना ट्रे को ठंडा करें।
  3. एक एनेस्थेटाइज़िंग जार में आइसोफ्लुरेन के 1 एमएल डालो($1000 एमएल) तो 30-45 s के लिए यह एक माउस जगह है कि माउस गहरा यांत्रिक उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया करने में अपनी असमर्थता की पुष्टि द्वारा anesthetized है.
  4. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके चूहे को नष्ट करें। सिर पकड़ो और एक नेत्र रोग कैंची का उपयोग कर मिडलाइन के साथ सतही त्वचा में कटौती. खोपड़ी की सतह को व्यापक रूप से बेनकाब करने के लिए उंगलियों से पकड़ कर त्वचा को खींचें।
  5. एक नेत्र विज्ञान कैंची का उपयोग कर कान और आंख के ठीक ऊपर प्रमुख spinocerebellar छेद से एक लाइन के साथ क्षैतिज खोपड़ी कट। दोनों आंखों के ऊपर एक लाइन के साथ खोपड़ी कट और खोपड़ी को अलग करने के लिए हटा दें।
  6. स्कैल्पेल का उपयोग करके मस्तिष्क के बीच में कट, फिर खोपड़ी से सेरिबैलम सहित मस्तिष्क के पुच्छल भाग को अलग करें। ACSF के एक बर्फ ठंडा बीकर में विसर्जित कर दिया. आमतौर पर, decapitation से ACSF के पूर्व ठंडा बीकर में मस्तिष्क ब्लॉक के विसर्जन के लिए कुल समय से कम होना चाहिए 60 s.
  7. bubbling ट्यूबिंग की स्थिति इतनी के रूप में बीकर में मस्तिष्क ब्लॉक हलचल नहीं समायोजित किया जाना चाहिए. यांत्रिक क्षति रिकॉर्डिंग के दौरान टुकड़ा की सूजन का कारण हो सकता है. इसे कम से कम 7 मिनट के लिए छोड़ दें और मस्तिष्क को ठंडा होने दें।
  8. मस्तिष्क ब्लॉक ट्रिम करने के लिए, एक बड़े agar प्लेट (4 सेमी x 10 सेमी, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) से एक आयताकार आगर टुकड़ा (2 सेमी x 2 सेमी) में कटौती और अतिरिक्त तरल को अवशोषित करने के लिए एक फिल्टर कागज पर डाल दिया।
  9. फिल्टर पेपर पर गार टुकड़ा उल्टा करें, फिर एक पूर्व ठंडा धातु नमूना ट्रे (16 सेमी x 20 सेमी) पर एक फिल्टर पेपर पर आगर टुकड़ा जगह है। एक spatula का उपयोग कर मस्तिष्क ब्लॉक उठाओ और फिल्टर कागज के एक टुकड़े के साथ इसके चारों ओर अत्यधिक तरल अवशोषित.
  10. गोंद (चिकित्सा cyanoacrylate तत्काल चिपकने वाला) का उपयोग कर आगर ब्लॉक पर मस्तिष्क ब्लॉक माउंट। agar करने के लिए मस्तिष्क ब्लॉक के नीचे (वेंट्रल पक्ष) संलग्न करने के लिए सुनिश्चित करें।
  11. एक ब्लेड के साथ सही गोलार्द्ध बाहर कट. सुनिश्चित करें कि काटने के विमान के पक्ष पीसी के डेन्ड्रिटिक विमान के लिए संभव के रूप में समानांतर है क्योंकि इस पक्ष नमूना ट्रे की सतह से जुड़ा हुआ है. गोलार्द्ध के दूसरी ओर काटकर हटा दें। फिर, बेहतर और अवर colliculi के बीच मस्तिष्क में कटौती, और रीढ़ की हड्डी काट दिया.
  12. पूर्व ठंडा नमूना ट्रे पर agar ब्लॉक के साथ छंटनी सेरिबैलम के दाईं ओर गोंद. एक spatula के फ्लैट भाग के साथ सेरिबैलम के चारों ओर अतिरिक्त गोंद बिखरा हुआ है, सेरेबेलर सतह के लिए संलग्न से अतिरिक्त गोंद को रोकने के लिए. धातु ट्रे झुकाव और एसीएसएफ डालना आदेश गोंद को ठीक करने और अतिरिक्त गोंद दूर धोने के लिए।

3. मस्तिष्क टुकड़ा करना

  1. नमूना इस तरह है कि सेरिबैलम के पृष्ठीय पक्ष सामने की ओर है ओरिएंट. बर्फ-ठंडा काटने ACSF डालो, जिसमें 1 डिग्री एम टीटीएक्स, पूरी तरह से सेरिबैलम को विसर्जित करने के लिए पर्याप्त है। ACSF में एक गैस ट्यूब प्लेस और O2/CO2 गैस मिश्रण के साथ bubbling शुरू करते हैं.
  2. दूरबीन के तहत एक ठीक चिमटी का उपयोग कर Arachnoid मेटर निकालें. एक ब्लेड के साथ सेरेबेलर peduncle कट, और brainstem और agar ब्लॉक को हटा दें. ट्रे 180 डिग्री घुमाएँ, ताकि सेरिबैलम की पृष्ठीय सतह एक रेजरब्लेड का सामना करे।
  3. ब्लेड सेट करें, और पहले काटने स्थान को समायोजित करें। निम्न करने के लिए vibratome टुकड़ा मापदंडों सेट: 5.5 करने के लिए आयाम, आवृत्ति 85 हर्ट्ज के लिए, 3-4 करने के लिए गति, और 300 डिग्री करने के लिए मोटाई टुकड़ा।
  4. एक एक्रिलिक इनक्यूबेटर में एक नायलॉन-नेट पर सेरेबेलर टुकड़ा स्थानांतरण और पूरी तरह से oxygenated ACSF में टुकड़ा विसर्जित कर दिया। इनक्यूबेटर को पानी के स्नान में रखा जाना चाहिए जो 26 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखता है।
  5. टुकड़ा करने के दौरान नुकसान से वसूली की अनुमति देने के लिए कम से कम 1 ज के लिए स्लाइस संग्रहीत करें।

4. पूरे सेल पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग

नोट: एक पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के लिए निम्नलिखित उपकरणों की आवश्यकता होती है: अवरक्त अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (आईआर-डीआईसी) प्रकाशिकी, एक पैच-क्लैम्प एम्पलीफायर, डेटा डिजिटाइज़र, डिजिटल उत्तेजक, आइसोलेटर, कंप्यूटर, डेटा-अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर के साथ एक ईमानदार माइक्रोस्कोप और विश्लेषण, motorized manipulator, माइक्रोस्कोप मंच, कंपन अलगाव तालिका, Faraday पिंजरे, समाधान हीटिंग सिस्टम, peristaltic पंप और इलेक्ट्रोड खींचने.

  1. ACSF करने के लिए picrotoxin (0.1 एमएम) जोड़ें और 3 मिनट के लिए अल्ट्रा sonication का उपयोग कर इसे हल.
  2. पिक्रोटॉक्सिन युक्त, व्2-ब् व्2-संतृप्त एसीएसएफ 2 एमएल/मिनट की दर से एक रिकॉर्डिंग कक्ष को लगभग 30 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. 4 चरणों के साथ एक खींचने का उपयोग करते हुए फिलामेंट (बाहरी व्यास ] 1.5 मिमी) के साथ एक बोरोसिलिकेट कांच केशिका खींच कर एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड बनाओ। टिप-व्यास लगभग 1 डिग्री मीटर होना चाहिए।
  4. 2 कदम के साथ खींचने का उपयोग कर एक ही केशिका खींच कर एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड बनाओ, तो एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत एक लोहे के ब्लॉक के खिलाफ टिप हड़ताली द्वारा एक ठीक टिप का उत्पादन करने के लिए तोड़. अंतिम व्यास 3-5 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए।
  5. रिकॉर्डिंग कक्ष में सेरेबेलर टुकड़ा स्थानांतरण और नायलॉन धागे के साथ एक पीटी वजन के साथ इसे ठीक. ACSF के साथ एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड भरें.
  6. पीएफ की उत्तेजना के लिए, आणविक परत की सतह पर उत्तेजक इलेक्ट्रोड रखें, लगभग 50 डिग्री मीटर दूर पुर्किंजे सेल परत से।
  7. CF की उत्तेजना के लिए, Purkine सेल परत के तल पर उत्तेजक इलेक्ट्रोड जगह (कदम 5.3, 5.4).
  8. फ़िल्टर K+-आधारित या Cs+-आधारित आंतरिक समाधान एक 0.45 डिग्री मीटर फिल्टर के साथ। आंतरिक समाधान के 8 डिग्री एल के साथ एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को भरने के लिए एक माइक्रो-लोडर का उपयोग करें।
  9. ACSF में डुबोने से पहले रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए एक कमजोर सकारात्मक दबाव लागू करें. इसका प्रतिरोध 2ण्4 डम्म होना चाहिए तथा द्रव संधि संभाव्यता को ठीक किया जाना चाहिए।
  10. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ पीसी के स्वस्थ, उज्ज्वल सेल शरीर दृष्टिकोण. पर्किंजे सेल की सतह को थोड़ा धक्का, सकारात्मक दबाव लागू करना बंद करो, अगले एक गीगा-ओम सील बनाने तक नकारात्मक दबाव लागू करें। फिर नकारात्मक दबाव का उपयोग कर पूरे सेल विन्यास की स्थापना.
  11. -70 एमवी पर झिल्ली क्षमता पकड़ो, और लागू -2 एमवी पल्स (duration, 100 एमएस) पर 0.1 हर्ट्ज इनपुट प्रतिरोध की निगरानी करने के लिए, श्रृंखला प्रतिरोध और इनपुट समाई, लगातार. श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा का उपयोग न करें. जब श्रृंखला प्रतिरोध 15% से अधिक भिन्न होता है तो डेटा छोड़ें.

5. लिमिटेड का प्रेरण

  1. एक नाड़ी के साथ आणविक परत उत्तेजित (duration, 0.1 एमएस). 50 एमएस की डबल पल्स उद्दीपक (इंटरस्पाइक अंतराल (आईएसआई) लागू करके पीएफ-उत्तेजक पदों की पहचान करें। पीएफ-ईपीएससी को उत्तेजना तीव्रता में वृद्धि करने के लिए युग्मित-पल्स सुविधा और आयाम के सापेक्ष धीरे-धीरे वृद्धि दिखानी चाहिए।
  2. पीएफ-ईपीएससी की परीक्षण प्रतिक्रिया को 0.1 हर्ट्ज पर एक पल्स लागू करके रिकॉर्ड करें। उद्दीपक ों की तीव्रता को समायोजित करें ताकि उत्प्रेरित ईपीएससी आयाम लगभग 200 पीए हो। वोल्टेज-निर्भर आयनिक चैनल के माध्यम से धारा के संदूषण से बचें।
  3. Purkinze सेल परत के तल पर CF उत्तेजित, और (एक डबल पल्स उत्तेजना लागू करने से) CF सक्रियण द्वारा प्राप्त EPSC की पहचान. CF-EPSC युग्मित-पल्स अवसाद और उत्तेजना तीव्रता में वृद्धि के अनुसार एक सभी या कोई भी तरीके से दिखाना चाहिए. लिमिटेड प्रेरण के लिए, एक ही प्रोत्साहन का उपयोग किया जाना चाहिए.
  4. लिमिटेड-प्रेरित प्रोटोकॉल 1
    1. वर्तमान-क्लैम्प शर्तों के अंतर्गत K+-आधारित आंतरिक समाधान वाले इलेक्ट्रोड का उपयोग करके, एक एकल पीएफ-उत्तेजक और एक एकल CF-उत्तेजक एक साथ 5 मिनट (300 दालों) के लिए 1 हर्ट्ज पर लागू करें (चित्र 1A)।
  5. लिमिटेड-प्रेरित प्रोटोकॉल 2
    1. एक इलेक्ट्रोड युक्त कश्मीर का उपयोगकरना +-आधारित आंतरिक समाधान वर्तमान-क्लैम्प शर्तों के तहत, डबल पीएफ-उत्तेजना (50 एमएस के ISI) लागू होते हैं और एकल CF-उत्तेजना के रूप में दूसरे PF-उत्तेजना CF-उत्तेजना के साथ संयोग है 1 हर्ट्ज पर 5 मिनट (चित्र 1B)।
  6. लिमिटेड-प्रेरक प्रोटोकॉल 3
    1. वोल्टेज-क्लैम्प शर्तों के तहत एक इलेक्ट्रोड युक्त एक इलेक्ट्रोड का उपयोग+-आधारित आंतरिक समाधान, एक डबल पीएफ-उत्तेजक लागू (50 एमएस के ISI) और एक एकल depolarizing वोल्टेज कदम (-70 से 0 एमवी, 50 एमएस) पर सोमा करने के लिए 1 हर्ट्ज के लिए 3 मिनट, ताकि दूसरा पीएफ-उत्तेजक है विध्रुवण वोल्टता चरण की शुरुआत के बराबर (चित्र 1C)।
  7. लिमिटेड-प्रेरित प्रोटोकॉल-4
    1. वोल्टेज-क्लैम्प शर्तों के तहत Cs+-आधारित आंतरिक समाधान वाले इलेक्ट्रोड का उपयोग करके, पीएफ-उत्तेजना (5x पर 100 हर्ट्ज) और एक एकल depolarizing वोल्टेज-चरण (-70 से 0 mV, 50 ms) को सोमा को 0.5 हर्ट्ज के लिए 3 मिनट, एक साथ लागू करें (चित्र 1D ).

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Representative Results

इस अध्ययन में सेरेबेलर लिमिटेड को प्रेरित करने के लिए चार प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था। पहले दो प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल 1 और 2) में, पीएफ-उत्तेजना और CF-उत्तेजना का संयोजन वर्तमान-क्लैम्प शर्तों के तहत लागू किया गया था। अन्य दो प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल 3 और 4) में, गतिक विध्रुवण वोल्टेज-क्लैम्प शर्तों के तहत CF-उत्तेजना के लिए प्रतिस्थापित किया गया था। संयोजक उत्तेजना के दौरान वोल्टेज-ट्रेस या वर्तमान-ट्रेस की तुलना की गई थी (चित्र 2)।

वर्तमान-क्लैम्प शर्तों (प्रोटोकॉल-1) के अंतर्गत 1 पीएफ-उत्तेजना और 1 CF-उत्तेजना का संयोजन पारंपरिक रूप से स्लाइस तैयार करने के लिए26,27के लिए किया गया था। सीजे द्वारा प्राप्त जटिल कील का आकार केवल CF-उत्तेजना द्वारा प्राप्त किए गए जटिल स्पाइक के समान था, जिसके बाद पहली खड़ी कील 2 से 3 स्पाइकलेट (चित्र 2क) थी। प्रोटोकॉल 2 के साथ उत्तेजना के दौरान इसी प्रकार के आकार का जटिल कील देखा गया था, अर्थात्, 1 पीएफ-उत्तेजना का अनुसरण 50 एमएस बाद में एक संयोजक द्वितीय पीएफ- और CF-उत्तेजना द्वारा किया गया था(चित्र 2बी)। एक Cs का उपयोग कर वोल्टेज-क्लैम्प शर्तों के तहत+आधारित आंतरिक समाधान, एक 2 पीएफ उत्तेजना और दैहिक depolarization के संयोजन लागू किए गए थे (प्रोटोकॉल 3) (चित्र 2C) . पहले पीएफ-उत्तेजना के बाद 50 एमएस बाद में एक दूसरे पीएफ-उत्तेजना और दैहिक depolarization के एक सहवर्ती आवेदन द्वारा पीछा किया गया था. एक आवक धारा -70 से 0 एमवी करने के लिए दैहिक विध्रुवण पर प्राप्त किया गया था। पुनर्ध्रुवण के बाद एक पूंछ धारा भी पैदा की गई थी। कभी-कभी, आवक धारा की दोहराव वाली पीढ़ी देखी गई, जो दूरस्थ डेन्ड्रिटिक क्षेत्र में सीए-स्पाइक गतिविधि को प्रतिबिंबित करेगी जहां एक Cs+-आधारित आंतरिक समाधान का उपयोग करने के बावजूद झिल्ली की क्षमता पर्याप्त रूप से नहीं लगाई गई थी ( चित्र 2C) अंत में, 100 हर्ट्ज पर 5 पीएफ-उत्तेजना वोल्टेज-क्लैम्प शर्तों (प्रोटोकॉल 4) के तहत दैहिक विध्रुवण के साथ एक साथ दी गई थी। फिर, विध्रुवण के दौरान आवक धाराओं की दोहराव वाली पीढ़ी को प्राप्त किया गया और पुनर्करण के बाद एक पूंछ धारा प्राप्त की गई। आवक धारा की आवर्ती पीढ़ी का समय पीएफ-उत्तेजना के साथ सिंक्रनाइज़ नहीं किया गया था (चित्र 2डी)। कभी-कभी, प्रतिवर्तन धारा की दोहराव वाली पीढ़ी पुनर्ध्रुवण के बाद भी जारी रही।

प्रोटोकॉल-1 और -2 द्वारा प्रेरित लिमिटेड के लिए के रूप में, सीजे की शुरुआत के बाद 25 मिनट के दौरान मापा EPSC-amplitude की कमी एक अपेक्षाकृत विस्तृत रेंज32पर बिखरे हुए था. पीएफ-ईपीएसपी के स्थिर आकार की तुलना में, जटिल स्पाइक का आकार सेल से सेल तक काफी परिवर्तनशील था। क्योंकि एक जटिल कील में स्पाइकलेट Ca2 +-चैनल सक्रियण33परिलक्षित, एक जटिल कील के आकार, इस तरह के आयाम या spikelets की steepness के रूप में, लिमिटेड आयाम को प्रभावित करने के लिए प्रोटोकॉल 1 द्वारा प्राप्त जटिल कील के साथ जांच की गई थी। क्योंकि प्रोटोकॉल 2 द्वारा प्राप्त जटिल spikes के आकार पीएफ-EPSP के साथ दूषित थे, हम इन आंकड़ों का विश्लेषण नहीं किया. सबसे पहले, सभी spikelets का योग (1-4)-amplitude LTD के आयाम के साथ सहसंबद्ध किया गया था (-[EPSC %) (चित्र 3ए, बी)। सहसंबंध गुणांक (त्) 0ण्28 था, परंतु सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था (च एवं 0ण्5)। क्योंकि स्पाइकलेट 2-4 में Ca2+-घटक34का अधिक निहित था, स्पाइकलेट का योग (2-4)-amplitude LTD-amplitude के साथ सहसंबद्ध था। सहसंबंध मजबूत प्रतीत होता था (त र् 0ण्67), परंतु अभी भी सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं है (च एवं 0ण्1) (चित्र 3ब्) । इसके बाद, प्रत्येक स्पाइकेट की वृद्धि की अधिकतम दर (एमआरआर) का अधिकतम मूल्य परिकलित किया गया (चित्र 3D),क्योंकि झिल्ली धारिता (सीएम) और डीवीएम/डीटी का उत्पाद मोटे तौर पर झिल्ली की धाराओं को दर्शाता है35। सीएम के उत्पाद और स्पाइक्स के एमआर (1-4) और लिमिटेड-एम्प्लीट्यूड के योग के बीच सहसंबंध की जांच की गई (चित्र 3E) और त 0ण्18 (च एवं 0ण्9) था। ब् ब् के गुणवत्ता तथा स्पाइकलेट्स के एमआरआर के योग (2ण्4) में थोड़ा मजबूत त (0ण्36) दिखाया गया था परंतु यह महत्वपूर्ण नहीं था (च एवं 0 .6) (चित्र 3 थ्)।

वोल्टेज क्लैम्प शर्तों के तहत, प्रोटोकॉल 3 जिसमें 180 सीजे कुशलता से प्रेरित लिमिटेड (चित्र 4बी)32. हालांकि, उत्तेजनाओं की एक छोटी संख्या प्रभावी ढंग से लिमिटेड प्रेरित कर सकते हैं कि क्या अज्ञात रहता है. इस प्रकार, 60 CJs 1 मिनट के लिए 1 हर्ट्ज पर लागू किया गया था लगभग 10 मिनट के बाद सीजे, EPSC आयाम दबा दिया गया था, तथापि, यह सीजे-ऑनसेट के बाद 15 मिनट पर बरामद किया. इससे पता चलता है कि 1 हर्ट्ज पर 60 बार सीजे लिमिटेड को प्रेरित करने के लिए अपर्याप्त था (चित्र 4क) . इसके अलावा, अकेले दैहिक विध्रुवण की पुनरावृत्ति (180 बार ) लिमिटेड को प्रेरित नहीं करती थी (चित्र 4ख)32.

प्रोटोकॉल 4 मूल रूप से स्टाइनबर्ग एट अल द्वारा इस्तेमाल किया गया था30 युवा चूहों के लिए (P14-21). लिमिटेड कथित तौर पर जंगली प्रकार सेरिबैलम में आरटी पर 0.5 हर्ट्ज पर 30 सीजे द्वारा प्रेरित किया गया था। हालांकि, जब 30 सीजे वयस्क चूहों सेरेबेलर स्लाइस (3-6 महीने) के लिए लगभग 30 डिग्री सेल्सियस पर लागू किए गए थे, तो कोई लिमिटेड प्रेरित नहीं किया गया था (चित्र 5क)। इसके विपरीत, जब 90 सीजे लागू किए गए तो लिमिटेड का सामान्य आयाम देखा गया (चित्र 5ख)32. फिर, अकेले कायिक विध्रुवण (0.5 हर्ट्ज पर 90 बार) लिमिटेड प्रेरित नहीं किया (चित्र 5B) .

Figure 1
चित्र 1: PF-PC synapse में लिमिटेड प्रेरित करने के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण। (ए) प्रोटोकॉल 1 सीजे 1 पीएफ और 1 CF उत्तेजनाओं को वर्तमान-क्लैम्प परिस्थितियों के तहत 1 हर्ट्ज (5 मिनट) पर एक साथ 300 बार लागू किया जाता है। पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड K+आधारित आंतरिक समाधान होता है। (बी) प्रोटोकॉल 2 सीजे 2 पीएफ और 1 CF उत्तेजनाओं को वर्तमान-क्लैम्प स्थिति के तहत 1 हर्ट्ज (5 मिनट) पर एक साथ 300 बार लागू किया जाता है। इलेक्ट्रोड में K+-आधारित आंतरिक समाधान होता है। (ग)प्रोटोकॉल 3 सीजे 2 पीएफ और कायिक विध्रुवण (-70 से 0 एमवी, 50 एमएस) वोल्टेज-क्लैम्प शर्त के तहत 1 हर्ट्ज (3 मिनट) पर 180 बार लागू किए जाते हैं, ताकि दूसरा पीएफ उद्दीपक कायिक विध्रुवण की शुरुआत के साथ लागू किया जा सके। इलेक्ट्रोड में Cs+-आधारित आंतरिक समाधान होता है। (घ) प्रोटोकॉल 4 सीजे 5 पीएफ 100 हर्ट्ज और कायिक विध्रुवण पर 90 बार 0.5 हर्ट्ज (3 मिनट) वोल्टेज-क्लैम्प स्थिति के तहत, एक साथ लागू किए जाते हैं। इलेक्ट्रोड में Cs+-आधारित आंतरिक समाधान होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वोल्टेज या संयोजन उत्तेजना के दौरान पीसी के वर्तमान निशान. (ं)मेम्ब्रेन विभव का पता प्रोटोकॉल 1 सीजे (ठ) मेम्ब्रेन विभव का पता लगाना प्रोटोकॉल 2 सी.जे. (सी) झिल्ली की वर्तमान ट्रेस द्वारा प्राप्त प्रोटोकॉल 3 सी.जे. (छ) झिल्ली की धारा प्रोटोकॉल 4 सी.जे. अनुलंब सलाखों - 10 mV (ए और बी), 1 nA (C और D). क्षैतिज पट्टी - 20 ms. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एक जटिल कील और LTD-amplitude के स्पाइकलेट के बीच संबंध. (क)प्रोटोकॉल 1 द्वारा प्राप्त एक जटिल कील का प्रतिनिधि ट्रेस। तीर स्पाइकेट की चोटियों (1-4) को इंगित करते हैं। स्केल बार ] 20 एमवी. (ख) स्पाइकलेट के आयाम के योग के बीच संबंध (1-4) और LTD-आयाम (-[EPSC %) (त र् 0ण्28, च र्ं र्ं 0ण्5)। (ग) स्पाइकलेट के आयाम के योग के बीच संबंध (2-4) तथा एलटीडी-आयाम (त र् 0ण्67, च व ग़त0)। (घ)ए तीरों में दिखाए गए विभेदित जटिल स्पाइकों का प्रतिनिधि ट्रेस स्पाइकलेट के डीवीमीटर/डीटीकी चोटियों को दर्शाता है। स्केल बार्स ] 5 एमएस, 50 वी/ (त् ़ 0ण्18, च र्ं 0ण्7)। (च)ब् रु के गुणक तथा स्पाइकलेट्स के एमआरआर (2-4) तथा एलटीडी के आयाम (त र् 0ण्36, च ् एवं 0ण्4) के बीच संबंध। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रोटोकॉल-3 CJ का उपयोग करके LTD-induction पर दोहरावों की संख्या का प्रभाव. (क)प्रोटोकॉल-3 सीजे द्वारा एलटी प्रेरण की विफलता, पुनरावृत्ति 1 हर्ट्ज पर 60 थी. प्रोटोकॉल-3 सीजे (तल पर काला कॉलम) से पहले और बाद में दर्ज किया गया पीएफ-ईपीएससी आयाम। पीएफ-ईपीएससी आयाम सीजे भरे हुए प्रतीक से पहले दर्ज किए गए लोगों द्वारा सामान्यीकृत किया गया था, जिससे मतलब ईपीएससी आयाम संकेत मिलता है। त्रुटि पट्टियाँ SEM. इनसेट को निरूपित करती हैं: आरोपित PF-EPSC अंश (ऊपर) पहले (चिह्नित 1) और 25-29 मिनट सीजे-stim शुरुआत (चिह्नित 2) के बाद दर्ज किए गए थे। प्रत्येक ट्रेस 6 रिकॉर्ड के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल सलाखों ] 100 pA, 10 ms. (B) लाल प्रतीक: प्रोटोकॉल द्वारा प्रेरित लिमिटेड 3 CJ, पुनरावृत्ति 1 हर्ट्ज पर 180 बार था. ब्लू प्रतीक: कोई संयोजन उत्तेजना लेकिन दैहिक depolarization पर लागू किया गया था 180 बार 1 हर्ट्ज. लिमिटेड प्रेरित नहीं किया गया था. इनसेट: आरोपित पीएफ-ईपीएससी निशान (ऊपर) सीजे-स्टिम शुरुआत (चिह्नित 4) के बाद पहले (चिह्नित 3) और 25-29 मिनट दर्ज किए गए थे। प्रत्येक ट्रेस 6 रिकॉर्ड के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार्स ] 100 pA, B में दर्शाए गए 10 ms. डेटा का उपयोग यामागुची एट अल32के चित्र 3ख में किया जाता है। (ग) का सारांश आलेख पीएफ-ईपीएससी आयाम का सारांश आलेख, 25-29 मिनट के दौरान सीजे डेपोल: विध्रुवण की शुरुआत के बाद दर्ज किया गया। कोष्ठकों में संख्यात्मक संप्रतीक कोशिकाओं की संख्या को निरूपित करता है। x60 - 60 बार, x180 $ 180 बार. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: प्रोटोकॉल 4 CJ का उपयोग करके LTD-induction पर दोहरावों की संख्या का प्रभाव. (क)प्रोटोकॉल 4 सीजे द्वारा एलटी प्रेरण की विफलता, पुनरावृत्ति 0.5 हर्ट्ज पर 30 बार थी। प्रोटोकॉल-4 सीजे (थ्र तल पर काला कॉलम) से पहले और बाद में दर्ज किया गया पीएफ-ईपीएससी आयाम। भरा हुआ प्रतीक मतलब EPSC आयाम इंगित करते हैं. त्रुटि पट्टियाँ SEM. इनसेट को निरूपित करती हैं: आरोपित PF-EPSC अंश (ऊपर) पहले (चिह्नित 1) और 25-29 मिनट सीजे-stim शुरुआत (चिह्नित 2) के बाद दर्ज किए गए थे। प्रत्येक ट्रेस 6 रिकॉर्ड के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार्स - 100 pA, 10 ms. (B) Red symbol: LTD induced by प्रोटोकॉल 4 CJ., नीला प्रतीक: कोई संयोजन उत्तेजना लेकिन कायिक depolarization पर लागू किया गया था 180 बार 0.5 हर्ट्ज. लिमिटेड प्रेरित नहीं किया गया था. इनसेट: आरोपित पीएफ-ईपीएससी निशान (ऊपर) सीजे-स्टिम शुरुआत (चिह्नित 4) के बाद पहले (चिह्नित 3) और 25-29 मिनट दर्ज किए गए थे। स्केल बार्स ] 100 pA, 10 ms. B में दर्शाए गए डेटा का उपयोग यामागुची एट अल के चित्र 4B में ही किया जाताहै। 32. (सी) सीजे डेपोल की शुरुआत के बाद 25-29 मिनट के दौरान दर्ज की गई मतलब पीएफ-ईपीएससी आयाम का सारांश साजिश: depolarization। कोष्ठकों में संख्यात्मक संप्रतीक कोशिकाओं की संख्या को निरूपित करता है। x30 - 30 बार, x90 $ 90 बार. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

चार प्रोटोकॉल के बीच अंतर

LTD-inducing प्रोटोकॉल 1 और 2 में, CJs 300 बार 1 हर्ट्ज पर सेरेबेलर लिमिटेड प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है. CF की उत्तेजना आवृत्ति एक शारीरिक रेंज में लग रहा था, क्योंकि सतर्क वयस्क चूहों में जटिल स्पाइक फायरिंग दर (P60) 1.25 हर्ट्ज36होने की सूचना दी गई थी. तथापि, CF उत्तेजना अकेले PF-CF synapse में दीर्घकालिक plasticity का कारण नहीं था, प्रोटोकॉल 1 और 2 में के रूप में इस्तेमाल किया (चित्र 4, चित्र 5), हालांकि CF-उत्तेजना उच्च आवृत्ति प्रेरित लिमिटेड24पर अकेले . प्रोटोकॉल 1 में प्राप्त जटिल कील का आकार भी लिमिटेड-आयाम(चित्र 3)के साथ कोई महत्वपूर्ण संबंध नहीं था। शायद जटिल कील का आकार औसत Ca2 +- concentration को दर्शाता है, लेकिन स्थानीय Ca2 +- एक शाखा में एकाग्रता का प्रतिनिधित्व नहीं किया जहां लिमिटेड प्रेरित किया गया था.

पीएफ उत्तेजना के बारे में, हालांकि 1 पीएफ उत्तेजना पारंपरिक रूप से सेरेबेलर लिमिटेड26,27प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था , ग्रेन्युल सेल विवो37में फट मोड में आग के लिए खड़ा था . इसलिए, पीएफ के कई सक्रियण शारीरिक फायरिंग पैटर्न की नकल करने के लिए एक भी पीएफ उत्तेजना से बेहतर होंगे, और mGluR1 सक्रियण पीएफ फायरिंग38की संख्या और आवृत्ति पर निर्भर करता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल-2 PKC को प्रोटोकॉल-1 की तुलना में अधिक गहन रूप से सक्रिय करेगा। कुछ उत्परिवर्तित GluA2 दस्तक में चूहों (K882A), केवल प्रोटोकॉल-2 प्रोटोकॉल के साथ तुलना में लिमिटेड प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था 132, सुझाव है कि सक्रिय PKC के एक उच्च एकाग्रता के लिए इस विशेष GluA2 उत्परिवर्तन के लिए लिमिटेड प्रेरित करने के लिए आवश्यक था.

पीएफ की कई उत्तेजनाओं लिमिटेड प्रेरण की घटनाओं में वृद्धि होगी, लेकिन एक वोल्टेज निर्भर Ca2 +चैनल CF-उत्तेजना या दैहिक depolarization के माध्यम से सक्रियण अभी भी आवश्यक था. पीसी डेन्ट्रीट, जहां पीएफ को प्रेरित किया गया था पर एक वोल्टेज पर निर्भर Ca2 +चैनल के सक्रियण को बढ़ाने के लिए, पीसी के सेल शरीर वोल्टेज-क्लैम्प शर्तों के तहत depolarized था30. एक Csकाउपयोग करते समय + आधारित आंतरिक समाधान, इनपुट प्रतिरोध स्पष्ट रूप से32वृद्धि हुई, केबल स्थिरांक में वृद्धि का सुझाव. नतीजतन, सक्रिय Ca2 कीसंख्या + -चैनलपीसी dendrite के distal क्षेत्र में वृद्धि की जाएगी. कुछ GluA2 उत्परिवर्ती चूहों में ($7), 2PF उत्तेजना + दैहिक depolarization (प्रोटोकॉल 3) या 5 पीएफ उत्तेजना + दैहिक depolarization (प्रोटोकॉल 4) LTD प्रेरित कर सकता है. इसके विपरीत, कोई लिमिटेड घटना प्रोटोकॉल द्वारा मनाया गया था 1 या 2 उत्तेजना. यह हो सकता है कि सी एस के साथ वोल्टेज-क्लैम्प शर्तों के तहत दैहिक depolarization+-आंतरिक समाधान सक्रिय वोल्टेज-निर्भर Ca2 +-चैनल वर्तमान-क्लैम्प शर्तों के तहत CF-उत्तेजना द्वारा सक्रियण की तुलना में अधिक प्रभावी ढंग से होता है K+-आधारित आंतरिक समाधान के साथ, और यह39 में [Ca2 +] और बादमेंमजबूत PKC-सक्रियण लिमिटेड के लिए आवश्यक में एक गैर-अतिरिक्त वृद्धि का कारण हो सकता है।

जीन हेरफेर जानवरों में लिमिटेड के लिए संभावित प्रतिपूरक तंत्र

सैद्धांतिक अध्ययन लिमिटेड प्रेरण40पर PKC के एक सभी या कोई नहीं प्रकार सक्रियण मानता है , लेकिन प्रयोगात्मक परिणामों में कुछ जीन का उपयोग कर-मनुष्य पशुओं जैसे GluA2 दस्तक में चूहों का प्रदर्शन किया कि PKC के सक्रियण लिमिटेड प्रेरण के आधार पर विविध प्रोटोकॉल32| 4 अलग प्रोटोकॉल के अलावा, PKC को सक्रिय करने के लिए सबसे प्रभावी प्रेरण प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल थे 3 और 4, प्रोटोकॉल 2 के बाद और सबसे कमजोर प्रोटोकॉल 1 था. जीन-मैन्युलेटेड पशुओं में, प्रतिपूरक तंत्र लिमिटेड32का कारण हो सकता है। इस तरह के प्रतिपूरक तंत्र सक्रिय PKC करने के लिए कम संवेदनशीलता हो सकती है. यदि हां, तो लिमिटेड-प्रेरित प्रोटोकॉल के कई सेट, एक है जो पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना में मजबूत PKC सक्रिय कर सकते हैं सहित, जीन हेरफेर जानवरों में लिमिटेड प्रेरण क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है. यद्यपि सीएस के साथ लिमिटेड का सामान्य प्रेरण+आधारित आंतरिक विलयन सुसंस्कृत पीसी15 या पीसी मेंस्लाइस 30में सूचित किया जाता है, एक Cs+-आधारित आंतरिक समाधान शारीरिक नहीं है। हालांकि, एक वोल्टेज पर निर्भर Ca2 +चैनल के सक्रियण एक दूरस्थ डेन्ट्रीट पर काम िक depolarization का उपयोग कर मुश्किल है, क्योंकि तैयारी और रिकॉर्डिंग के दौरान संभावित यांत्रिक क्षति जो में कमी का कारण हो सकता है लंबाई-स्थिर. इस प्रकार, पीएफ-उत्तेजक डेन्ड्रिटिक क्षेत्र में Ca2+-चैनलों के सक्रियण को सुनिश्चित करने के लिए, एक प्रोटोकॉल का उपयोग करना आवश्यक है जो एक Cs+-internal समाधान का उपयोग करके लंबाई-स्थिर बढ़ता है।

अन्य प्रयोगात्मक शर्तें

अन्य कारकों को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए जब synaptic प्लास्टिक और पशु व्यवहार समानांतर में इस तरह के पशु उम्र और इन विट्रो में रिकॉर्डिंग तापमान के मिलान के रूप में जांच कर रहे हैं, क्योंकि संकेत transduction दर स्थिरांक और रिसेप्टर तस्करी अत्यधिक तापमान संवेदनशील होते हैं। वास्तव में, विवो में मोटर सीखने की संख्या कम सतह व्यक्त AMPA प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर्स41 और अतुल्यकालिक मिनी-EPSC के आकार में PF-पीसी synapse42. आदर्श रूप में, पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए, हालांकि, एक स्थिर लंबी अवधि की रिकॉर्डिंग 37 डिग्री सेल्सियस पर मुश्किल है। अतः इस अध्ययन में सभी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग लगभग 30 डिग्री सेल्सियस पर की गई। हालांकि इस तापमान शारीरिक तापमान से कम है, यह अभी भी व्यवहार सीखने की क्षमता के साथ इन विट्रो में विश्लेषण synaptic गुणों की तुलना करने के लिए और अधिक अनुकूल परिस्थितियों प्रदान करेगा. रिकॉर्डिंग तापमान में यह अंतर इन परिणामों को पिछली रिपोर्ट26से अलग करने के लिए एक और कारक हो सकता है. इसके अलावा, निष्क्रिय झिल्ली गुण32 और आंतरिक उत्तेजना43,44 की स्थिरता का मूल्यांकन भी synaptic प्लास्टिक के अध्ययन में महत्वपूर्ण है.

अंत में, जीन हेरफेर जानवरों में synaptic plasticity और पशु व्यवहार के बीच कासल संबंध की जांच करने के लिए, इन विट्रो में synaptic प्लास्टिक का मूल्यांकन इस तरह के तापमान का उपयोग कर के रूप में प्रयोगात्मक स्थितियों के सावधान नियंत्रण की आवश्यकता होगी विनियमन और प्रोटोकॉल के कई प्रकार.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम उसकी तकनीकी सहायता के लिए ए ओबा को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को आंशिक रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड द्वारा समर्थित किया गया था (सी) 17K01982 K.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 152 Synaptic plasticity लिमिटेड मस्तिष्क टुकड़ा पूरे सेल रिकॉर्डिंग माउस Purkinze सेल सेरिबैलम समानांतर फाइबर चढ़ाई फाइबर
वयस्क सेरेबेलर स्लाइस में दीर्घकालिक अवसाद प्रेरण का आकलन
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Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of … More

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

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