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Neuroscience

Valutazione dell'induzione della depressione a lungo termine nelle fette di cerebellar adulto

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859
Automatic Translation
1, 2
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Summary

In alcuni animali manipolati dai geni, l'utilizzo di un unico protocollo potrebbe non indurre LTD nelle cellule cerebellar Purkinje, e ci può essere una discrepanza tra LTD e apprendimento motorio. Sono necessari più protocolli per valutare l'induzione di LTD in animali manipolati dal gene. Vengono visualizzati i protocolli standard.

Abstract

La plasticità sinaptica fornisce un meccanismo per l'apprendimento e la memoria. Per l'apprendimento motorio cerebellare, la depressione a lungo termine (LTD) delle trasmissioni sinaptiche dalle fibre parallele (PF) alle cellule Purkinje (PC) è considerata la base per l'apprendimento motorio, e le carenze di LTD e di apprendimento motorio sono osservate in vari animali manipolati dal gene. Per la valutazione della capacità di apprendimento motorio, sono stati utilizzati set comuni di apprendimento motorio, come l'adattamento del riflesso ottimale (OKR), il riflesso vestibolare-oculare (VOR) e il test di rotazione. Tuttavia, i risultati ottenuti dal capolinea GluA2-carboxy modificato topi knock-in hanno dimostrato il normale adattamento del VOR e della OKR, nonostante la mancanza di PF-LTD. In tale relazione, l'induzione di LTD è stata tentata utilizzando un solo tipo di protocollo di stimolazione a temperatura ambiente. Così, le condizioni per indurre cerebellar LTD sono state esplorate negli stessi mutanti knock-in utilizzando vari protocolli a temperatura quasi fisiologica. Infine, abbiamo trovato protocolli di stimolazione, mediante i quali la LTD potrebbe essere indotta in questi topi manipolati dai geni. In questo studio, viene proposta una serie di protocolli per valutare l'induzione di LTD, che consentirà più accuratamente l'esame della relazione causale tra LTD e apprendimento motorio. In conclusione, le condizioni sperimentali sono cruciali nella valutazione di LTD in topi manipolati dai geni.

Introduction

L'organizzazione sinaptica delle elaborate reti neuronali della corteccia cerebellare, composta da PC, interneuroni a strato molecolare (cellule da canestro e stellate), cellule di Golgi, PF da cellule granule, fibre muschioe e fibre rampicanti (CF), sono state chiarite in termini di eccitazione/inibizione e divergenza/convergenza, e il diagramma del circuito ben organizzato ha suggerito che il cervelletto è una "macchina neuronale"1, anche se in precedenza non c'era idea dello scopo di questa "macchina". Successivamente Marr propose che l'input di PF per i PC costituisca una rete di apprendimento associativo a triplo strato2. Suggerì anche che ogni CF trasmette un'istruzione cerebrale per il movimento elementale2. Ha assunto che l'attivazione simultanea di FR e CF avrebbe migliorato l'attività di sinapsi PF-PC, e causare potenziamento a lungo termine (LTP) della sinapsi PF-PC. D'altra parte, Albus ha ritenuto che l'attivazione sincrona di GIF e CF ha portato a LTD presso le sinapsi PF-PC3. Entrambi gli studi di cui sopra interpretano il cervelletto come un dispositivo di memoria unico, la cui incorporazione nella rete corticale cerebellare porta alla formazione del modello di machine di apprendimento del modello Marr-Albus.

Seguendo queste previsioni teoriche, due linee di prova suggeriscono la presenza di plasticità sinaptica nel cervelletto. La prima linea di prova è stata suggerita dall'organizzazione anatomica del flocculus; qui le vie MF di origine dell'organo vestibolare e le vie CF di origine retinica convergono sui PC4. Questo modello di convergenza unico suggerisce che una plasticità sinaptica che si verifica nel flocculus provoca la notevole adattabilità del riflesso vestibulo-oculare. In secondo luogo, la registrazione dei PC risposta nel flocculus e la lesioning del flocculus anche sostenuto l'ipotesi di cui sopra5,6,7. Inoltre, il modello di scarico del PC durante l'adattamento del movimento della mano di una scimmia8 ha sostenuto l'ipotesi della plasticità sinaptica, in particolare l'ipotesi LTD di Albus3.

Per determinare direttamente la natura della plasticità sinaptica, la stimolazione congiuntiva ripetuta (Cjs) di un fascio di GIF e della CF che in particolare innervail i minattici il PC in vivo è stato dimostrato a LTD indurre per l'efficacia della trasmissione delle sinapsi PF-PC9, 10,11. Nelle successive esplorazioni in vitro con una fetta cerebellare12 e PC coltivati, congiunzione di stimolazione cellulare granulo co-coltivata e stimolazione delle cellule ulivi13 o congiunzione di glutammato e somatica depolarizzazione14,15 ha causato LTD. Anche il meccanismo di trasduzione del segnale alla base dell'induzione del LTD è stato studiato intensamente utilizzando preparati in vitro16,17.

Gli adattamenti del VOR e dell'OKR sono stati spesso utilizzati per la valutazione quantitativa degli effetti di manipolazione genica sull'apprendimento motorio cerebellare, perché la corteccia vestibule-cerebellare è stata dimostrata come l'origine essenziale nell'apprendimento adattivo del VOR18 ,19,20 e L'OKR19,21 La correlazione tra il fallimento dell'induzione di LTD e la compromissione dell'apprendimento motorio comportamentale è stata presa come prova che LTD svolge un ruolo essenziale nel motore meccanismi di apprendimento22. Queste opinioni sono collettivamente indicate come l'ipotesi LTD dell'apprendimento motorio, o ipotesi Marr-Albus-Ito23,24,25,26.

L'apprendimento adattivo del movimento oculare è stato misurato utilizzando protocolli simili, mentre varie condizioni sperimentali sono state utilizzate per indurre LTD nella preparazione delle fette27,28,29,30,31 . Recentemente, Schonewille et al.26 ha riferito che alcuni topi manipolati dai geni hanno dimostrato un normale apprendimento motorio, ma le fette di cerebellar non mostravano LTD, e quindi hanno concluso che ltd non era essenziale per l'apprendimento motorio. Tuttavia, l'induzione di LTD è stata tentata utilizzando un solo tipo di protocollo a temperatura ambiente. Quindi, abbiamo utilizzato diversi tipi di protocolli che inducono LTD in condizioni di registrazione a circa 30 gradi centigradi, e abbiamo confermato che il LTD è stato indotto in modo affidabile nei topi manipolati dai geni utilizzando questi protocolli a temperature quasi fisiologiche32.

Tuttavia, rimangono alcune domande riguardanti le proprietà di base della stimolazione congiuntiva. Il primo è la relazione tra la forma del picco complesso e l'ampiezza di LTD. In secondo luogo, in combinazione con la stimolazione PF e la depolarizzazione somatica, se il numero di stimoli utilizzati erano necessari o meno era inafferrato. Nel presente studio, queste domande sono state studiate utilizzando topi di tipo selvaggio (WT).

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato RIKEN per la cura e l'uso degli animali negli esperimenti. I topi sono stati tenuti nell'impianto animale del RIKEN Center for Brain Science a temperatura ben controllata (23-25 gradi centigradi) e umidità (45%-65%) Condizioni. Sono stati utilizzati sia topi WT maschi che femmine (C57BL/6, 3–6 mesi).

1. Preparazione delle soluzioni utilizzate negli esperimenti

NOT: Tutte le soluzioni devono essere realizzate in acqua ultrapura priva di metalli (resistività > 18,2 M) e altre impurità (carbonio organico totale (TOC) < 5,0 ppb). Il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) funzionante per il taglio e la registrazione delle fette viene effettuato fresco il giorno dell'esperimento da uno stock di ACSF 10 volte (x10). Bollare le soluzioni con 5% CO2/ 95% O2 miscela di gas prima dell'uso. Il pH di ACSF viene regolato a 7,4 x 0,1, e l'osmolarità viene regolata 315 mOsm/kg aggiungendo acqua ultrapura.

  1. Preparare le scorte 10x di ACSF contenenti 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4e 260 mM NaHCO3. Questa soluzione può essere immagazzinata a 4 gradi centigradi.
  2. Preparare il lavoro ACSF contenente 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg2SO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 e 20 mM di glucosio.
    1. In primo luogo, aggiungere 1 mL di 2 M CaCl2 soluzione seguita da 1 mL di 1 M Mg2SO4 soluzione in circa 800 mL di acqua ultrapura, per evitare precipitazioni. Quindi aggiungere 100 mL di 10x ACSF e glucosio. Infine, fino a un volume totale di 1.000 mL con l'aggiunta di acqua ultrapura.
  3. Preparare 3.3% agar per la gestione del cervello. Sciogliere 1 g di agar in 30 mL di 0,9% soluzione NaCl, e riscaldare in un forno a microonde fino a far bollire. Mescolare per mescolare, quindi versarlo in una scatola di plastica sterile 4 cm x 10 cm e lasciare solidificare. Conservare la piastra di agar(spessore di 8 mm) in frigorifero.
  4. Preparare la soluzione interna.
    1. Preparare la soluzione interna a K ea4 mM contenente 60 mM KCl, 60 mM K-gluconate, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP e 30 mM HEPES (pH 7.2).
      NOT: Bassa concentrazione (0,3 mM) di EGTA, un lento Ca 2o-chelator, viene aggiunto per chelate possibilmente contaminato Ca2s in acqua pura, ma questa bassa concentrazione di EGTA nella soluzione interna non blocca mai l'induzione di LTD (Figura 3, Figura 4, Figura 5) durante la registrazione dell'intera cella. La pressione osmotica misurata è di 285 mOsm/kg.
    2. Preparare la soluzione interna basata su CseC contenente 60 mM CsCl, 46 mM D-gluconato, 27 mM di cloruro tetraetilenium (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP e 30 mM HEPES (pH 7.2, utilizzando CsOH regolato).
      NOT: Cs: blocca i canali K dipendenti dalla tensione e migliora le condizioni di morsetto dello spazio ai dendriti remoti aumentando la costante di lunghezza. La pressione osmotica misurata è di 285 mOsm/kg.
    3. Preparare 200 aliquote l'aliquote delle soluzioni e conservarle a -30 gradi centigradi.

2. Dissezione e taglio del cervello

  1. Raffreddare e ossigenare due becher da 50 mL di ACSF sul ghiaccio fino a quando la temperatura è inferiore a 4 gradi centigradi. Aggiungere 50 -L di tetrodotossina (TTX, 1 mM) in uno dei becher ghiacciati di ACSF e riservarlo per il taglio delle fette. Per ottenere la fetta cerebellare del topo che riserva la capacità di indurre LTD, è necessaria l'aggiunta di TTX al normale ACSF.
  2. Raffreddare il vassoio dei campioni di metallo riempiendo una zona di bagno di ghiaccio della camera di taglio con ghiaccio.
  3. Versare 1 mL di isoflurane in un barattolo anestesizzante(1000 mL) quindi posizionarvi un topo per 30-45 s. Assicurarsi che il mouse sia profondamente anesteto confermando la sua incapacità di rispondere alla stimolazione meccanica.
  4. Decapitare il topo usando forbici chirurgiche. Tenere la testa e tagliare la pelle superficiale lungo la linea mediana utilizzando una forbice oftalmologica. Tirare la pelle tenendo con le dita per esporre ampiamente la superficie del cranio.
  5. Tagliare il cranio orizzontalmente lungo una linea dal foro spinocerebellare maggiore appena sopra l'orecchio e l'occhio utilizzando una forbice oftalmologica. Tagliare il cranio lungo una linea sopra entrambi gli occhi e rimuovere per isolare il cranio.
  6. Tagliare il cervello al centro del cervello usando un bisturi, quindi isolare la parte caudale del cervello compreso il cervelletto dal cranio. Immergilo in un becher ghiacciato di ACSF. Di solito, il tempo totale dalla decapitazione all'immersione del blocco cerebrale nel becher pre-raffreddato di ACSF dovrebbe essere inferiore a 60 s.
  7. Posizione di tubo gorgogliante dovrebbe essere regolato in modo da non mescolare il blocco cerebrale nel becher. Danni meccanici possono causare gonfiore della fetta durante la registrazione. Lasciare per almeno 7 min e lasciare che il cervello di raffreddare.
  8. Per tagliare il blocco cerebrale, tagliare un pezzo di agar rettangolare (2 cm x 2 cm) da una grande piastra di agar (4 cm x 10 cm, conservata a 4 gradi centigradi) e metterla su una carta da filtro per assorbire il liquido in eccesso.
  9. Capovolgere il pezzo di agar sulla carta da filtro, quindi posizionare il pezzo di agar su una carta da filtro su un vassoio di campioni di metallo pre-raffreddato (16 cm x 20 cm). Raccogliere il blocco cerebrale utilizzando una spatola e assorbire liquido eccessivo intorno ad esso con un pezzo di carta da filtro.
  10. Montare il blocco cerebrale sul blocco di agar utilizzando la colla (adesivo istantaneo cianoacrilato medico). Assicurarsi di attaccare il fondo (lato ventrale) del blocco cerebrale all'agar.
  11. Tagliare l'emisfero destro con una lama. Assicurarsi che il lato del piano di taglio sia il più parallelo possibile al piano dendritico del PC perché questo lato è attaccato alla superficie del vassoio del provino. Tagliare e rimuovere l'altro lato dell'emisfero. Quindi, tagliare il cervello tra i colliculi superiori e inferiori, e tagliare il midollo spinale.
  12. Incollare il lato destro del cervelletto tagliato con il blocco di agar sul vassoio dei campioni pre-raffreddati. Stendere la colla in eccesso intorno al cerriletto con la parte piatta di una spatola, per evitare che la colla in eccesso si attacchi alla superficie del cerebellare. Inclinare il vassoio di metallo e versare ACSF al fine di fissare la colla e lavare via la colla in eccesso.

3. Affettare il cervello

  1. Orientare il campione in modo che il lato dorsale del cervelletto si trova sul lato anteriore. Versare a CAGOdi di taglio a freddo ghiaccio, contenente 1 TTX, sufficiente a immergere completamente il cervelletto. Mettere un tubo del gas nell'ACSF e iniziare a spumeggiare con miscela di gas O2/ CO2.
  2. Rimuovere il mater aracnoide utilizzando una pinzetta fine sotto il binocolo. Tagliare il peduncolo cerebellare con una lama, e rimuovere il tronco encefalico e il blocco di agar. Ruotare il vassoio di 180 gradi, in modo che la superficie dorsale del cervelletto si affaccia su una lama di rasoio.
  3. Impostare la lama e regolare la prima posizione di taglio. Impostare i parametri di sezionamento del vibratoma su: ampiezza a 5,5, frequenza a 85 Hz, velocità a 3-4 e spessore della fetta su 300 m.
  4. Trasferire la fetta cerebellare su una rete di nylon in un'incubatrice acrilica e immergerla completamente nell'ACSF ossigenato. L'incubatrice deve essere collocata in un bagno d'acqua che mantenga una temperatura a 26 gradi centigradi.
  5. Conservare le fette per almeno 1 h per consentire il recupero dal danno durante la sezionamento.

4. Registrazione patch-cl di patch a cella intera

NOT: La registrazione di un patch-clamp richiede le seguenti apparecchiature: un microscopio verticale con ottica a contrasto differenziale di interferenza a infrarossi (IR-DIC), un amplificatore patch-clamp, digitalizzatore di dati, stimolatore digitale, isolatore, computer, software per l'acquisizione di dati e analisi, manipolatore motorizzato, piattaforma al microscopio, tavolo di isolamento delle vibrazioni, gabbia di Faraday, sistema di riscaldamento della soluzione, pompe peristaliche e tiro elettrodo.

  1. Aggiungere la picrotosina (0,1 mM) ad ACSF e risolverla usando l'ultra-sonicazione per 3 min.
  2. Perfuso una camera di registrazione con picrotossina contenente, O2-CO2-saturata ACSF alla velocità di 2 mL/min. Mantenere la temperatura della camera di registrazione a circa 30 gradi centigradi.
  3. Fare un elettrodo di registrazione tirando un capillare di vetro borosilicato con filamento (diametro esterno 1,5 mm) utilizzando un tiratore con 4 passi. Il diametro della punta dovrebbe essere di circa 1 m.
  4. Fai un elettrodo stimolante tirando lo stesso capillare usando l'appullante con 2 passi, quindi spezza per produrre una punta fine colpendo la punta contro un blocco di ferro sotto un microscopio binoculare. Il diametro finale dovrebbe essere di 3-5 m.
  5. Trasferire la fetta cerebellare nella camera di registrazione e fissarla con un peso Pt con fili di nylon. Riempire un elettrodo stimolante con ACSF.
  6. Per la stimolazione degli IP, posizionare l'elettrodo stimolante sulla superficie dello strato molecolare, a circa 50 m di distanza dallo strato di cellule Purkinje.
  7. Per la stimolazione della CF, posizionare l'elettrodo stimolante nella parte inferiore dello strato cellulare Purkinje (passaggi 5.3, 5.4).
  8. Filtrarelasoluzione interna basata su K oCscon un filtro di 0,45 m. Utilizzare un micro-caricatore per riempire un elettrodo di registrazione con 8 l- di soluzione interna.
  9. Applicare una pressione positiva debole all'elettrodo di registrazione prima di immergerlo nell'ACSF. La sua resistenza dovrebbe essere 2-4 M e il potenziale giunzionale liquido deve essere corretto.
  10. Avvicinati al corpo cellulare sano e luminoso del PC con l'elettrodo di registrazione. Spingere leggermente la superficie della cella Purkinje, interrompere l'applicazione di pressione positiva, quindi applicare la pressione negativa fino a formare un sigillo giga-ohm. Quindi stabilire la configurazione dell'intera cella utilizzando la pressione negativa.
  11. Mantenere il potenziale della membrana a -70 mV e applicare un impulso di -2 mV (durata, 100 ms) a 0,1 Hz per monitorare la resistenza all'ingresso, la resistenza alla serie e la capacità di ingresso, in modo continuo. Non utilizzare la compensazione di resistenza della serie. Eliminare i dati quando la resistenza della serie varia di oltre il 15%.

5. Induzione di LTD

  1. Stimolare lo strato molecolare con un impulso (durata, 0,1 ms). Identificare le correnti post-eccitatorie PF (EPSC) applicando uno stimolo a doppio impulso (intervallo interspike (ISI) di 50 ms). Il PF-EPSC dovrebbe mostrare facilitazione a impulsi accoppiati e graduale aumento dell'ampiezza rispetto all'aumento dell'intensità di stimolazione.
  2. Registrare la risposta di prova del PF-EPSC applicando un singolo impulso a 0,1 Hz. Regolare l'intensità dello stimolo in modo che l'ampiezza EPSC evocata sia di circa 200 pA. Evitare la contaminazione della corrente attraverso il canale ionico dipendente dalla tensione.
  3. Stimolare la CF nella parte inferiore dello strato cellulare Purkinje e identificare l'EPSC suscitato dall'attivazione della CF (applicando uno stimolo a doppio impulso). Il CF-EPSC dovrebbe mostrare depressione a impulsi accoppiati e un modo tutto o nessuno in base all'aumento dell'intensità di stimolazione. Per l'induzione di LTD, deve essere utilizzato un singolo stimolo.
  4. Protocollo di induzione LTD 1
    1. Utilizzando un elettrodo che contiene una soluzione interna basata suKin condizioni di morsetto corrente, applicare un singolo PF-stimolo e un singolo CF-stimolo contemporaneamente a 1 Hz per 5 min (300 impulsi) (Figura 1A).
  5. Protocollo di induzione LTD 2
    1. Utilizzando una soluzione internabasata su elettrodi in condizioni di morsetto corrente, applicare il doppio PF-stimoli (ISI di 50 ms) e un singolo CF-stimolo come il secondo PF-stimolo è coincidente con CF-stimoli a 1 Hz per 5 min (Figura 1B).
  6. Protocollo LTD-inducing 3
    1. Utilizzando un elettrodo che contiene una soluzione interna basata suCsin condizioni di coagulazione di tensione, applicare un doppio PF-stimolo (ISI di 50 ms) e un singolo passo di tensione depolarizzante (-70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 1 Hz per 3 min, in modo che il secondo PF-smulus sia equivalente all'inizio della fase di tensione depolarizzante(Figura 1C).
  7. Protocollo che induce LTD-4
    1. Utilizzando un elettrodo che contiene una soluzione interna basata suCsin condizioni di morsetto di tensione, applicare il PF-stimuli (5x a 100 Hz) e un singolo passo depolarizzante della tensione (-70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 0,5 Hz per 3 min, contemporaneamente ( Figura 1D ( Figura 1D (Figura 1D ).

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Representative Results

Quattro protocolli sono stati utilizzati in questo studio per indurre cerebellar LTD. Nei primi due protocolli (protocollo 1 e 2), la congiunzione della stimolazione PF e della stimolazione CF è stata applicata in condizioni di morsetto attuali. Negli altri due protocolli (protocollo 3 e 4), la depolarizzazione somatica è stata sostituita per la stimolazione CF in condizioni di tensione-blocco. Sono state confrontate tracce di tensione o tracce di corrente durante la stimolazione congiuntiva (Figura 2).

La congiunzione di 1 PF-stimolazione e 1 CF-stimolazione in condizioni di corrente-blocco (protocollo 1) sono stati convenzionalmente utilizzati per la preparazione delle fette26,27. La forma del complesso picco suscitato dal Cj era simile a quella suscitata dalla sola stimolazione CF, con la prima ripida spikelet seguita da 2 a 3 spikelets (Figura 2A). Un picco complesso di forma simile è stato osservato durante la stimolazione con protocollo 2, vale a dire, 1 PF-stimolazione è stata seguita 50 ms più tardi da un secondo congiuntivo PF- e CF-stimolazione (Figura 2B). In condizioni di tensione-blocco utilizzando una soluzione interna basata suCs,è stata applicata la combinazione di una stimolazione 2 PF e depolarizzazione somatica (protocollo 3) (Figura 2C). Il primo PF-stimolazione è stato seguito 50 ms più tardi da un'applicazione concomitante di una seconda stimolazione PF e depolarizzazione somatica. Una corrente verso l'interno è stata suscitata sulla depolarizzazione somatica da -70 a 0 mV. Una corrente di coda è stata evocata anche dopo la ripolarizzazione. A volte, è stata osservata la generazione ripetitiva di una corrente interna, che rifletterebbe l'attività di Ca-spike nella regione dendritica remota in cui il potenziale della membrana non è stato bloccato a sufficienza, nonostante l'utilizzo di una soluzione interna basata suCs( Figura 2C). Infine, 5 PF-stimoli a 100 Hz sono stati dati contemporaneamente alla depolarizzazione somatica in condizioni di tensione-blocco (protocollo 4). Anche in questo caso, la generazione ripetitiva di correnti interiori è stata suscitata durante la depolarizzazione e una corrente di coda è stata suscitata dopo la ripolarizzazione. La tempistica della generazione ripetitiva della corrente verso l'interno non è stata sincronizzata con il PF-stimoli (Figura 2D). A volte, la generazione ripetitiva della corrente interiore continuava dopo la ripolarizzazione.

Per quanto riguarda il LTD indotto dai protocolli-1 e -2, la riduzione dell'EPSC-amplide misurata durante i 25-min dopo l'insorgenza di Cj è stata sparsa su una gamma relativamente ampia32. Rispetto alla forma stabile del PF-EPSP, la forma del picco complesso era abbastanza variabile da cella a cella. Poiché le punte in un picco complesso riflettevano l'attivazione di Ca2 o-channel33, la forma di un picco complesso, come l'ampiezza o la ripidezza delle punte, che interessa l'ampiezza LTD è stata esaminata con il complesso picco suscitato dal protocollo 1. Poiché la forma dei picchi complessi suscitati dal protocollo 2 sono stati contaminati dal PF-EPSP, non abbiamo analizzato questi dati. In primo luogo, la somma di tutte le ampiezze (1-4) di picchi (1-4) è stata correlata con l'ampiezza del LTD (-E - PSC %) (Figura 3A,B). Il coefficiente di correlazione (r) era di 0,28, ma non era statisticamente significativo (p > 0,5). Poiché le punte 2-4 contenevano più del componenteCa 2,la somma dell'ampiezza di spikelet (2-4) era correlata con l'ampiezza LTD. La correlazione sembrava essere più forte (r - 0,67), ma ancora non statisticamente significativa (p > 0,1) (Figura 3C). Successivamente, è stato calcolato il valore massimo di dVm/dt (velocità massima di aumento [MRR]) di ogni spikelet (Figura 3D), perché il prodotto della capacità della membrana (Cm) e dVm/dt riflette approssimativamente le correnti della membrana35. La correlazione tra il prodotto del Cm e la somma delle RM delle punte (1-4) e dell'ampiezza LTD è stata esaminata(Figura 3E), e r era 0,18 (p > 0,9). La correlazione tra il prodotto del Cm e la somma della MRR delle punte (2-4) ha mostrato un r leggermente più forte (0,36) ma non era significativo (p > 0 .6) (Figura 3F).

In condizioni di morsetto di tensione, il protocollo 3 con 180 Cjs indotto in modo efficiente LTD (Figura 4B)32. Tuttavia, se un numero minore di stimoli può effettivamente indurre LTD rimane sconosciuto. Così, 60 Cjs sono stati applicati a 1 Hz per 1 min. Circa 10 min dopo Cj, l'ampiezza EPSC è stata soppressa, tuttavia, recuperato a 15 min dopo l'insorgenza di Cj. Ciò suggerisce che 60 volte Cjs a 1 Hz era insufficiente per indurre LTD (Figura 4A). Inoltre, la ripetizione della sola depolarizzazione somatica (180 volte) non ha indotto LTD (Figura 4B)32.

Il protocollo 4 è stato originariamente utilizzato da Steinberg et al.30 per i giovani topi (P14–21). L'LTD è stato indotto da 30 Cj a 0,5 Hz a RT nel cervelletto di tipo selvatico. Tuttavia, quando 30 Cjs sono stati applicati alla fetta di cerebellar di topi adulti (3-6 mesi) a circa 30 gradi centigradi, non è stato indotto alcun LTD (Figura 5A). Al contrario, quando sono stati applicati 90 Cj, è stata osservata la solita ampiezza di LTD (Figura 5B)32. Anche in questo caso, la depolarizzazione somatica da sola (90 volte a 0,5 Hz) non ha indotto LTD (Figura 5B).

Figure 1
Figura 1: Illustrazione schematica dei protocolli per indurre LTD nella sinapsi PF-PC. (A) Gli stimoli del protocollo 1 Cj. 1 PF e 1 CF vengono applicati simultaneamente 300 volte a 1 Hz (5 min) in condizioni di morsetto corrente. L'elettrodo per la registrazione a celle intere contiene una soluzione interna basata suK. (B) Protocollo 2 Cj. 2 PF e 1 CF gli stimoli vengono applicati simultaneamente 300 volte a 1 Hz (5 min) in condizioni di blocco corrente. L'elettrodo contiene una soluzione interna basata suK. (C) Protocollo 3 Cj. 2 PF e depolarizzazione somatica (-70 a 0 mV, 50 ms) vengono applicati 180 volte a 1 Hz (3 min) in condizioni di morsetto di tensione, in modo che il secondo stimolo PF venga applicato contemporaneamente all'inizio della depolarizzazione somatica. L'elettrodo contiene una soluzione interna basata suCs. (D). Protocollo 4 Cj. 5 PF a 100 Hz e la depolarizzazione somatica vengono applicate 90 volte a 0,5 Hz (3 min) in condizioni di morsa di tensione, contemporaneamente. L'elettrodo contiene una soluzione interna basata suCs. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Tensione o tracce correnti del PC durante la stimolazione di congiunzione. (A) Membrana potenziale traccia suscitata dal protocollo 1 Cj. (B) Membrana potenziale traccia suscitata dal protocollo 2 Cj. (C) Membrana corrente corrente suscitata dal protocollo 3 Cj. (D) Membrana corrente corrente suscitata dal protocollo 4 Cj. Barre verticali: 10 mV (A e B), 1 nA (C e D). Barra orizzontale - 20 ms. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Relazione tra picco di un picco complesso e ampiezza LTD. (A) Traccia rappresentativa di un picco complesso suscitato dal protocollo 1. Le frecce indicano picchi di punte (1-4). Barra della scala: 20 mV. (B) Relazione tra la somma dell'ampiezza delle punte (1-4) e la funzione di ampliatura LTD (-EPSC %) (r - 0,28, p > 0,5). (C) Relazione tra la somma dell'ampiezza delle punte (2-4) e ltd-ampiezza (r - 0,67, p > 0.1). (D) Traccia rappresentativa dei picchi complessi differenziati indicata in A. Le frecce indicano picchi di dVm/dt di montanti. Barre di scala - 5 ms, 50 V/s. (E) Relazione tra i prodotti del Cm e la somma della MRR delle punte (1-4) e l'ampiezza di LTD (EPSC %) (r - 0,18, p > 0,7). (F) Relazione tra il prodotto del Cm e la somma della MRR delle punte (2-4) e l'ampiezza di LTD (r : 0,36, p > 0,4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Effetto del numero di ripetizioni sull'induzione di LTD utilizzando il protocollo-3 Cj. (A) Guasto dell'induzione di LTD da parte del protocollo 3 Cj, la ripetizione era di 60 a 1 Hz. L'ampiezza PF-EPSC è stata normalizzata da quelle registrate prima del simbolo Cj. Filled indica l'ampiezza EPSC media. Le barre di errore indicano l'inset di SEM. Ogni traccia rappresenta la media di 6 record. Barre di scala : 100 pA, 10 ms. (B) Simbolo rosso: LTD indotto dal protocollo 3 Cj, la ripetizione era 180 volte a 1 Hz. Simbolo blu: nessuna stimolazione di congiunzione, ma la depolarizzazione somatica è stata applicata 180 volte a 1 Hz. LTD non è stata indotta. Rientro: le tracce PF-EPSC sovrapposte (in alto) sono state registrate prima (contrassegnate 3) e 25-29 min dopo l'insorgenza di Cj-stim (contrassegnate 4). Ogni traccia rappresenta la media di 6 record. Barre di scala : 100 pA, 10 ms. I dati mostrati in B sono gli stessi utilizzati nella Figura 3B di Yamaguchi et al.32. (C). Grafico riepilogativo dell'ampiezza f-EPSC media registrata durante i 25-29 min dopo l'insorgenza del Cj. Depol: depolarizzazione. Il carattere numerico tra parentesi rappresenta il numero di celle. x60 : 60 volte, x180 e 180 volte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Effetto del numero di ripetizioni sull'induzione di LTD utilizzando il protocollo 4 Cj. (A) Guasto dell'induzione di LTD per protocollo 4 Cj, la ripetizione è stata 30 volte a 0,5 Hz. Il simbolo riempito indica l'ampiezza EPSC media. Le barre di errore indicano l'inset di SEM. Ogni traccia rappresenta la media di 6 record. Barre di scala : 100 pA, 10 ms. (B) Simbolo rosso: LTD indotto dal protocollo 4 Cj., simbolo blu: nessuna stimolazione di congiunzione ma la depolarizzazione somatica è stata applicata 180 volte a 0,5 Hz. LTD non è stata indotta. Rientro: le tracce PF-EPSC sovrapposte (in alto) sono state registrate prima (contrassegnate 3) e 25-29 min dopo l'insorgenza di Cj-stim (contrassegnate 4). Barre della scala: 100 pA, 10 ms. I dati mostrati in B sono gli stessi utilizzati nella Figura 4B di Yamaguchi et al. 32. Grafico riepilogativo dell'ampiezza media PF-EPSC registrata durante i 25-29 min dopo l'insorgenza del Cj. Il carattere numerico tra parentesi rappresenta il numero di celle. x30 - 30 volte, x90 x 90 volte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Differenze tra i quattro protocolli

Nei protocolli di induzione di LTD 1 e 2, Cjs 300 volte a 1 Hz è sufficiente per indurre cerebellar LTD. Frequenza di stimolazione della CF sembrava essere in una gamma fisiologica, perché il complesso tasso di cottura picco nei topi adulti di allarme (P60) è stato segnalato per essere 1.25 Hz36. Tuttavia, la stimolazione CF da sola non ha causato plasticità a lungo termine nella sinapsi PF-CF, come utilizzato nei protocolli 1 e 2 (Figura 4, Figura 5), anche se la stimolazione CF da sola a maggiore frequenza ha indotto LTD24. La forma del picco complesso, suscitato nel protocollo 1, non aveva alcuna relazione significativa con l'ampiezza LTD (Figura 3). Forse la forma del picco complesso riflette la concentrazione media di Ca2,ma non rappresentava la concentrazione locale di Ca2 oin una cenorale in cui è stata indotta la concentrazione di LTD.

Per quanto riguarda la stimolazione PF, anche se la stimolazione 1 PF è stata convenzionalmente utilizzata per indurre cerebellar LTD26,27, la cellula granulosa tendeva a sparare in modalità burst in vivo37. Pertanto, più attivazioni del PF sarebbe meglio di una singola stimolazione PF per imitare il modello di cottura fisiologico, e l'attivazione mGluR1 dipendeva dal numero e dalla frequenza di cottura PF38. Pertanto, protocollo 2 attiverebbe PKC in modo più intensivo rispetto al protocollo-1. In alcuni topi knock-in GluA2 mutati (K882A), solo il protocollo 2 era sufficiente a indurre LTD rispetto al protocollo 132, suggerendo che era necessaria una maggiore concentrazione di PKC attivato per indurre LTD per questa particolare mutazione di GluA2.

Le stimolazioni multiple del PF aumenterebbero l'incidenza dell'induzione di LTD, ma l'attivazione di un canale Ca2 odipendente dalla tensione tramite stimolazione CF o depolarizzazione somatica era ancora necessaria. Al fine di aumentare l'attivazione di un canale Ca2odipendente dalla tensione presso la dendrite DEL PC, dove è stato stimolato il PF, il corpo cellulare del PC è stato depolarizzato in condizioni di tensione-blocco30. Quando si utilizza una soluzione internabasatasu Cs, la resistenza all'input è aumentata notevolmentedi 32, suggerendo un aumento della costante del cavo. Di conseguenza, verrebbe aumentato il numero di canali Ca2 onell'area distale del PC dendrite. In alcuni topi mutanti GluA2 (z7), stimolazione 2PF - depolarizzazione somatica (protocollo 3) o stimolazione 5 PF - depolarizzazione somatica (protocollo 4) potrebbe indurre LTD. Al contrario, nessun fenomeno LTD è stato osservato dalla stimolazione del protocollo 1 o 2. Può darsi che la depolarizzazione somatica in condizioni di morsetto di tensione con Cs-soluzione interna attivata ca2s-i canali si verificano in modo più efficace rispetto all'attivazione da parte della stimolazione CF in condizioni di morsa di corrente con soluzione interna basata suK,e questo potrebbe causare un aumento non additivo in [Ca2 ]in39 e una successiva robusta attivazione PKC necessaria per LTD.

Possibile meccanismo compensativo per LTD in animali manipolati genici

Uno studio teorico presuppone un'attivazione di PKC su induzioneLTD 40, ma nei risultati sperimentali utilizzando alcuni animali manipolati dal gene come i topi knock-in GluA2 hanno dimostrato che l'attivazione del PKC variava a seconda dell'induzione di LTD protocolli32. Tra i 4 diversi protocolli, il protocollo di induzione più efficace per attivare il PKC erano i protocolli 3 e 4, seguiti dal protocollo 2 e il più debole era il protocollo 1. Negli animali manipolati dai geni, i meccanismi compensativi potrebbero causare LTD32. Tali meccanismi compensativi potrebbero avere una sensibilità inferiore all'ADdicazione del PKC. In tal caso, sono necessari più serie di protocolli che inducono LTD, tra cui uno in grado di attivare il PKC più forte dei protocolli convenzionali, per valutare la capacità di induzione di LTD negli animali manipolati dai geni. Anche se la normale induzione di LTD con soluzione interna basata suCsè segnalata in PC coltivati15 o PC in fette30, una soluzione interna basata suCsnon è fisiologica. Tuttavia, l'attivazione di un canale Ca2o-dipendentedalla tensione a un dendrite remoto è difficile da usare per la depolarizzazione somatica nella fetta, a causa dei possibili danni meccanici durante la preparazione e la registrazione che possono causare una diminuzione lunghezza-costante. Pertanto, per garantire l'attivazione dei canali Ca2e ,nella regione dendritica che stimola il PF, è necessario utilizzare un protocollo che aumenti la costante di lunghezza utilizzando una soluzione cs-interna.

Altre condizioni sperimentali

Altri fattori dovrebbero essere presi in considerazione anche quando la plasticità sinaptica e il comportamento animale vengono esaminati in parallelo, come la corrispondenza tra l'età animale e la registrazione della temperatura in vitro, perché le costanti del tasso di trasduzione del segnale e il traffico dei recettori sono molto sensibili alla temperatura. In realtà, l'apprendimento motorio in vivo ha ridotto il numero di recettori del glutammato di tipo AMPAespressi 41 e la dimensione del mini-EPSC asincrono alla sinapsi PF-PC42. Idealmente, la registrazione del morsetto a patch a celle intere dovrebbe essere fatta a 37 gradi centigradi, tuttavia, una registrazione stabile a lungo termine è difficile a 37 gradi centigradi. Quindi, tutte le registrazioni elettrofisiologiche in questo studio sono state condotte a circa 30 gradi centigradi. Anche se questa temperatura è inferiore alla temperatura fisiologica, sarebbe ancora fornire condizioni più favorevoli per confrontare le proprietà sinaptiche analizzate in vitro con la capacità di apprendimento comportamentale. Questa differenza nelle temperature di registrazione potrebbe essere un altro fattore per causare questi risultati a differire dal rapporto precedente26. Inoltre, la valutazione della costanza delle proprietà della membrana passiva32 e l'eccitabilità intrinseca43,44 è anche importante nello studio della plasticità sinaptica.

In conclusione, per studiare la relazione causale tra plasticità sinaptica e comportamento animale in animali manipolati genici, la valutazione della plasticità sinaptica in vitro richiederebbe un attento controllo delle condizioni sperimentali come l'uso della temperatura regolamentazione e diversi tipi di protocolli.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo A. Oba per la sua assistenza tecnica. Questa ricerca è stata parzialmente supportata da Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 a K.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

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Valutazione dell'induzione della depressione a lungo termine nelle fette di cerebellar adulto
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Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

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