Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Оценка долгосрочной депрессии индукции в взрослых церебеллярной ломтики

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859
Automatic Translation
1, 2
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Summary

В некоторых генов манипулировать животных, используя один протокол может не вызвать LTD в мозжечковых клетках Purkinje, и может быть несоответствие между LTD и двигательного обучения. Для оценки ltd-индукции у животных, манипулируемых генами, необходимы несколько протоколов. Отображаются стандартные протоколы.

Abstract

Синаптической пластичности обеспечивает механизм для обучения и памяти. Для мозжечкового моторного обучения, долгосрочная депрессия (LTD) синаптической передачи от параллельных волокон (PF) к клеткам Purkinje (PC) считается основой для моторного обучения, и недостатки как LTD, так и моторного обучения наблюдаются в различных генно-манипулируемых животных. Для оценки способности моторного обучения использовались общие наборы моторного обучения, такие как адаптация оптикинетического рефлекса (OKR), вестибулярно-глазного рефлекса (VOR) и тест на ротарод. Тем не менее, результаты, полученные от GluA2-carboxy конечной модифицированных стук в мышей продемонстрировали нормальную адаптацию VOR и OKR, несмотря на отсутствие PF-LTD. В этом докладе индукция LTD была предпринята только с использованием одного типа протокола стимуляции при комнатной температуре. Таким образом, условия, чтобы вызвать мозжечковые LTD были изучены в том же стук-в мутантов с использованием различных протоколов при почти физиологической температуре. Наконец, мы нашли протоколы стимуляции, с помощью которых LTD может быть индуцирована в этих генно-манипулируемых мышей. В этом исследовании предлагается набор протоколов для оценки ltd-индукции, что позволит более точно изучить причинно-следственную связь между LTD и моторного обучения. В заключение, экспериментальные условия имеют решающее значение при оценке LTD в ген-манипулируемых мышей.

Introduction

Синкаптическая организация разработанных нейрональных сетей мозжечковой коры, состоящей из ПК, молекулярных пластовых интернейронов (корзинных и стеллатных клеток), клеток Голги, PFs из гранулированных клеток, мшистых волокон и альпинистских волокон (CFs), были выяснены с точки зрения возбуждения / ингибирования и расхождения / конвергенции, и хорошо организованной схемы диаграммы предположил, что мозжечок является "нейрональной машины"1, хотя ранее не было ни малейшего представления о цели этой "машины". Позже Марр предложил, чтобы ввод PFs на ПК представлял собой трехслойную ассоциативную сеть обучения2. Он также предположил, что каждый CF передает церебральный инструкции для элементарного движения2. Он предположил, что одновременная активация ПФ и CF повысит активность синапсов PF-PC и вызовет долгосрочную потенцию (ЛТП) синапса PF-PC. С другой стороны, Альбус предположил, что синхронная активация PFs и CF привела к LTD на PF-PC синапсы3. Оба вышеисследования интерпретируют мозжечок как уникальное устройство памяти, включение которого в мозжечковую корковую сеть приводит к формированию модели модели модели Marr-Albus.

Следуя этим теоретическим предсказаниям, две линии доказательств указывают на наличие синаптической пластичности в мозжечке. Первая линия доказательств была предложена анатомической организацией флокуса; здесь Пути MF развития вестибулярного происхождения органов и CF пути происхождения сопредели на ПК4. Этот уникальный шаблон конвергенции предполагает, что синаптической пластичности, происходящих в flocculus вызывает замечательную приспособляемость вестибуло-глазного рефлекса. Во-вторых, запись реакции ПК в flocculus и поражения flocculus также поддержали выше гипотезу5,6,7. Кроме того, модель разряда ПК во время адаптации движения руки обезьяны8 поддерживала гипотезу синаптической пластичности, особенно гипотезу Альбуса LTD-гипотеза3.

Для определения характера синаптической пластичности непосредственно, повторяется конъюнктивная стимуляция (Cjs) из расслоения PFs и CF, что конкретно innervates PC in vivo было показано, чтобы вызвать LTD для передачи эффективности PF-PC синапсы9, 10,11. В последующих исследованиях in vitro с использованием мозжечкового ломтика12 и культивированных ПК, соединение совместной стимуляции гранули и стимуляции оливковых клеток13 или соединение ионтофорексически прикладного глутамата и соматического деполяризации14,15 вызвало LTD. Механизм трансдукции сигнала, лежащий в основе индукции LTD, также интенсивно исследовался с помощью препаратов in vitro16,17.

Адаптация VOR и OKR часто использовалась для количественной оценки генно-манипуляционного воздействия на мозжечковое моторное обучение, потому что вестибюль-мозжечковая кора была доказана как существенное происхождение в адаптивном изучении VOR18 ,19,20 и OKR19,21 Корреляция между отказом ltd-индукции и ухудшениеповеденческого обучения двигателя было принято в качестве доказательства того, что LTD играет важную роль в двигательной механизмы обучения22. Эти взгляды коллективно называются гипотезой LTD о моторном обучении, или гипотезой Марр-Альбус-Ито23,24,25,26.

Адаптивное обучение движения глаз было измерено с помощью аналогичных протоколов, в то время как различные экспериментальные условия были использованы, чтобы вызвать LTD в срез подготовки27,28,29,30,31 . Недавно Schonewille et al.26 сообщили, что некоторые мыши, манипулируемые генами, продемонстрировали нормальное моторное обучение, но мозжечковые ломтики не показали LTD, и тем самым пришли к выводу, что LTD не является необходимым для моторного обучения. Тем не менее, индукция LTD была только попытка использования одного типа протокола при комнатной температуре. Таким образом, мы использовали несколько типов ltd-индуцирующих протоколов в условиях записи при температуре около 30 градусов по Цельсию, и мы подтвердили, что LTD был надежно индуцирован в ген-манипулируемых мышей с помощью этих протоколов при почти физиологических температурах32.

Однако остаются некоторые вопросы относительно основных свойств конъюнктурной стимуляции. Во-первых, это связь между формой сложного шипа и амплитудой LTD. Во-вторых, в сочетании с PF-стимуляцией и соматической деполярализацией, независимо от того, было ли необходимо ею количество используемых стимулов или нет, было неуловимо. В настоящем исследовании, эти вопросы были исследованы с использованием диких мышей типа (WT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были одобрены комитетом RIKEN по уходу и использованию животных в экспериментах. Мыши содержались на животном объекте Центра наук и мозга RIKEN при хорошо контролируемой температуре (23-25 градусов по Цельсию) и влажности (45%-65%) Условия. Были использованы как мужские, так и женские мыши WT (C57BL/6, 3-6 месяцев).

1. Подготовка решений, используемых в экспериментах

ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны быть сделаны в ультрачистой воде, свободной от металлов (резивек (резистивность (18,2 МЗ) и других примесей (общий органический углерод (TOC) lt; 5.0 ppb). Работая искусственная спинномозговая жидкость (ACSF) для резки и записи срезов производится недавно в день эксперимента из 10-кратного (x10) запаса ACSF. Пузырь растворов с 5% CO2/ 95% O2 газовой смеси перед использованием. рН ACSF регулируется до 7,4 и 0,1, а осмолярность регулируется 315 и 5 мОзм/кг путем добавления ультрачистой воды.

  1. Подготовка 10x запас ACSF, содержащий 1250 мм NaCl, 30 мм KCl, 12,5 мм2PO4, и 260 мм NaHCO3. Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия.
  2. Подготовка рабочих ACSF, содержащий 125 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ Мм2SO4, 1,25 мм2PO4, 26 мм NaHCO3 и 20 мм глюкозы.
    1. Во-первых, добавьте 1 мл 2 M CaCl2 раствора, а затем 1 мл 1 М Мг2SO SO4 раствор авт., чтобы избежать осадков. Затем добавьте 100 мл 10x ACSF и глюкозы. Наконец, составить до общего объема 1000 мл, добавив ультрачистую воду.
  3. Подготовьте 3,3% агара для обработки мозга. Растворите 1 г агара в 30 мл 0,9% раствора NaCl, и нагрейте в микроволновой печи до кипения. Перемешать, затем вылить в стерильную пластиковую коробку 4 см х 10 см и дать затвердеть. Храните агар пластины(8мм толщиной) в холодильнике.
  4. Подготовьте внутреннее решение.
    1. Подготовьте внутреннее решение на основеK,содержащее 60 мм KCl, 60 мм К-глюконат, 0,3 мм EGTA, 4 мМ MgCl2,4 мМ АТП, 0,4 мм GTP и 30 мМ HEPES (pH 7.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая концентрация (0,3 мм) EGTA, медленный Ca 2 "chelator, добавляется к хелат, возможно, загрязненных Ca2 " в чистой воде, но эта низкая концентрация EGTA во внутреннем растворе никогда не блокирует индукции LTD (Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5) во время записи из цельной ячейки. Измеренное осмотическое давление составляет 285 мОзм/кг.
    2. Подготовьте внутреннее решение на основеCs,содержащее 60 мМ CsCl, 46 мМ D-глюконат, 27 мМ тетраэтиламмониевхий хлорид (TEA-Cl), 0,3 мМ EGTA, 4 мМ MgCl2, 4 мМ ATP, 0,4 мМ ГТП и 30 мМ HEPES (pH 7.2, скорректировано с помощью CSOH).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Csq блокирует напряжение-зависимых K-каналов, и улучшает условия пространства-зажима на удаленных дендритов за счет увеличения длины постоянной. Измеренное осмотическое давление составляет 285 мОзм/кг.
    3. Подготовьте 200 аликотов растворов и храните при -30 градусов по Цельсию.

2. Рассечение мозга и обрезка

  1. Охладить и оксигенировать два 50 мл клювac ACSF на льду, пока температура не будет ниже 4 градусов по Цельсию. Добавьте 50 кЛ тетродотоксина (TTX, 1 мМ) в один из ледяных клювов ACSF и зарезервируйте его для резки ломтиков. Для получения мыши мозжечкового ломтика резервирования LTD-индуцирующей способности, добавление TTX к нормальному ACSF необходимо.
  2. Охладите лоток металлического образца, заполнив ледяную баню нарезки камерой льдом.
  3. Налейте 1 мл изофлуран в анестезирующую банку(1000 мл), затем поместите мышь в нее в течение 30-45 с. Убедитесь, что мышь глубоко обезболивается, подтверждая свою неспособность реагировать на механическую стимуляцию.
  4. Обезглавить мышь хирургическими ножницами. Держите голову и вырезать поверхностную кожу вдоль средней линии с помощью офтальмологических ножницами. Потяните кожу, держа пальцами, чтобы широко разоблачить поверхность черепа.
  5. Вырежьте череп горизонтально вдоль линии от основного отверстия spinocerebellar чуть выше уха и глаз с помощью офтальмологического ножница. Вырежьте череп вдоль линии над обоими глазами и удалите, чтобы изолировать череп.
  6. Вырезать мозг в середине головного мозга с помощью скальпеля, а затем изолировать каудальной части мозга, включая мозжечок из черепа. Погрузите его в ледяной стакан ACSF. Как правило, общее время от обезглавливания до погружения мозгового блока в предварительно охлажденный стакан ACSF должно быть меньше 60 с.
  7. Положение кипящей трубки должно быть скорректировано таким образом, чтобы не перемешивать мозговой блок в стакане. Механические повреждения могут вызвать отек ломтика во время записи. Оставьте его, по крайней мере 7 мин и дайте мозгу остыть.
  8. Чтобы обрезать мозговой блок, вырежьте прямоугольный кусок агара (2 см х 2 см) из большой агаровой пластины (4 см х 10 см, х х 10 см, х х 10 см), хранящейся при 4 кв с) и положите ее на фильтровальную бумагу, чтобы поглотить лишнюю жидкость.
  9. Переверните кусок агара вверх дном на фильтровальной бумаге, а затем поместите кусок агара на фильтровальную бумагу на предварительно охлажденный металлический поднос (16 см х 20 см). Возьмите блок мозга с помощью шпателя и поглощают чрезмерную жидкость вокруг него с листом фильтровальной бумаги.
  10. Установите блок мозга на блок агара с помощью клея (медицинский цианоакрилат мгновенный клей). Убедитесь в том, чтобы прикрепить нижней (вентральной стороны) блока мозга к агару.
  11. Вырежьте правое полушарие лезвием. Убедитесь, что сторона режущей плоскости как можно более параллельна дендритной плоскости ПК, потому что эта сторона прикреплена к поверхности лотка образца. Вырезать и удалить другую сторону полушария. Затем, сократить мозг между начальником и нижней colliculi, и отрезать спинной мозг.
  12. Клей правой стороне обрезанного мозжечка с агар блок на предварительно охлажденный образец лоток. Распространение избыточного клея вокруг мозжечка с плоской частью шпателя, чтобы предотвратить избыток клея от присоединения к поверхности мозжечка. Наклоните металлический лоток и залить ACSF для того, чтобы исправить клей и смыть избыток клея.

3. Нарезка мозга

  1. Ориентируйте образец так, что сонная сторона мозжечка находится на передней стороне. Налейте ледяную резку ACSF, содержащий 1 ММ TTX, достаточно, чтобы погрузить мозжечок полностью. Поместите газовую трубку в ACSF и начните кипит с помощью газовой смеси O2/CO2.
  2. Удалите арахноидную матерсуется с помощью тонкого пинцета под биноклем. Вырезать мозжечковый опусина с лезвием, и удалить ствол мозга и агар блока. Поверните лоток на 180 градусов, так что сонная поверхность мозжечка обращена к лезвию.
  3. Установите лезвие и отрегулируйте первое место резки. Установите параметры нарезки вибратом следующим образом: амплитуда до 5,5, частота до 85 Гц, скорость до 3-4, и ломтик толщины до 300 мкм.
  4. Перенесите мозжечковый ломтик на нейлоновой сетке в акриловый инкубатор и полностью погрузите ломтик в насыщенный кислородом ACSF. Инкубатор должен быть помещен в водяную ванну, которая поддерживает температуру при температуре 26 градусов по Цельсию.
  5. Храните ломтики, по крайней мере 1 ч, чтобы позволить восстановление после повреждения во время нарезки.

4. Запись патч-зажима на цельное ячейки

ПРИМЕЧАНИЕ: Запись патч-зажима требует следующего оборудования: вертикального микроскопа с инфракрасным дифференциальным контрастом (IR-DIC) оптикой, усилителем патч-зажима, цифровым стимулятором данных, изолятором, компьютером, программным обеспечением для сбора данных и анализ, моторизованный манипулятор, платформа микроскопа, таблица изоляции вибрации, клетка Faraday, система нагрева раствора, peristaltic насосы и выдвижной электрод.

  1. Добавьте пикотоксин (0,1 мМ) в ACSF и разрешите его с помощью ультра-звукового в течение 3 мин.
  2. Пронизываете камеру звукозаписи с пикротоксин-содержащим, O2-CO2- насыщенный ACSF со скоростью 2 м/мин. Поддерживать температуру камеры записи на уровне около 30 градусов по Цельсию.
  3. Сделать запись электрода, потянув боросиликат стекла капилляра с нитью (внешний диаметр 1,5 мм) с помощью шкива с 4 шага. Диаметр наконечника должен быть около 1 мкм.
  4. Сделать стимулирующий электрод, потянув же капилляр с помощью шкива с 2 шага, а затем разорвать производить тонкий кончик, ударив кончик против железного блока под бинокулярным микроскопом. Окончательный диаметр должен быть 3-5 мкм.
  5. Перенесите мозжечковый ломтик в камеру записи и зафиксировать его с Pt-весом с нейлоновыми нитями. Заполните стимулирующий электрод с помощью ACSF.
  6. Для стимуляции PFs поместите стимулирующий электрод на поверхность молекулярного слоя, примерно в 50 мкм от клеточного слоя Пуркинье.
  7. Для стимуляции CF поместите стимулирующий электрод в нижней части клеточного слоя Пуркинье (шаги 5.3, 5.4).
  8. Фильтр K-на основе или Cs-на основе внутреннего решения с фильтром 0,45 мкм. Используйте микро-загрузчик для заполнения записывающего электрода с 8 зл внутреннего раствора.
  9. Применяйте слабое положительное давление на электрод записи перед погружением в ACSF. Его устойчивость должна быть 2-4 МЗ и ликвидный стыковки потенциал должен быть исправлен.
  10. Подойдите к здоровому, яркому клеточному телу ПК с помощью записи электрода. Надавите на поверхность клетки Пуркинье немного, прекратите применять положительное давление, затем примените отрицательное давление до формирования гига-омского уплотнения. Затем установите конфигурацию цельнояра с помощью отрицательного давления.
  11. Держите мембранный потенциал при -70 мВ,кв.м., и применять -2 мВ импульс (длительность, 100 мс) на 0,1 Гц для мониторинга вхотборного сопротивления, устойчивости серии и входнуем емости, непрерывно. Не используйте компенсацию сопротивления серии. Отбрасывайте данные, когда сопротивление серий варьируется более чем на 15%.

5. Индукция ЛТД

  1. Стимулировать молекулярный слой пульсом (длительность, 0,1 мс). Определите PF-возбуждающие постсинаптические токи (EPSC) путем применения двойного импульсного стимула (интерспайкового интервала (ISI) 50 мс). PF-EPSC должен показать парно-импульсное упрощение и постепенное увеличение амплитуды относительно увеличения интенсивности стимуляции.
  2. Запись тестовой реакции PF-EPSC, применяя один импульс на 0,1 Гц. Отрегулируйте интенсивность стимула так, чтобы вызываемый EPSC амплитуды составляет около 200 pA. Избегайте загрязнения тока через ионный канал, зависящий от напряжения.
  3. Стимулировать CF в нижней части слоя клетки Purkinje, и определить EPSC вызвано активации CF (путем применения двойного импульсного стимула). CF-EPSC должен показать парно-пульсовой депрессии и все или ни один образом в зависимости от увеличения интенсивности стимуляции. Для индукции LTD следует использовать один стимул.
  4. Протокол, вызывающий ltd 1
    1. Используя электрод, содержащий внутреннее решение на основе Kqв условиях текущего зажима, примените один PF-стимул и один CF-стимул одновременно на 1 Гц в течение 5 минут (300 импульсов)(рисунок 1A).
  5. Протокол 2, вызывающий ltd
    1. Используя электрод-содержащий K-внутреннее решение в условиях текущего зажима, примените двойной PF-стимул (ISI 50 мс) и один ОЧНЫй стимул, так как второй ПФ-стимул совпадает с CF-стимулами на 1 Гц в течение 5 мин(рисунок 1B).
  6. Протокол, вызывающий ltd 3
    1. Используя электрод, содержащийcs-на основе внутреннего раствора в условиях напряжения-зажима, применить двойной PF-стимул (ISI 50 мс) и один деполяризации напряжения шаг (-70 до 0 мВ, 50 мс) к соме на 1 Гц в течение 3 мин, так что второй ПФ-стимул эквивалентно началу шага деполяризации напряжения(рисунок 1С).
  7. Протокол-4, вызывающий ltd
    1. Используя электрод, содержащий внутреннее решение на основе Csив условиях напряжения-зажима, примените PF-стимулы (5x на 100 Гц) и один деполяризирующий напряжение-шаг (-70 до 0 мВ, 50 мс) к соме при 0,5 Гц в течение 3 мин, одновременно(рисунок 1D ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Четыре протокола были использованы в этом исследовании, чтобы вызвать мозжечковый LTD. В первых двух протоколах (протокол 1 и 2) соединение PF-стимуляции и CF-стимуляции применялось в условиях текущего зажима. В двух других протоколах (протокол 3 и 4) соматическая деполяризация была заменена на CF-стимуляцию в условиях напряжения-зажима. Сравнивались следы напряжения или ток-следы во время конъюнктивной стимуляции(рисунок 2).

Соединение 1 PF-стимуляции и 1 CF-стимуляции при текущих условиях зажима (протокол-1) были условно использованы для подготовкиломтика 26,27. Форма сложного всплеска, вызванного Cj был похож на то, что вызвано CF-стимуляции в одиночку, с первым крутым шипами следуют от 2 до 3 шипов(рисунок 2A). Аналогичным образом формы комплекс шип наблюдался во время стимуляции с протоколом 2, а именно, 1 PF-стимуляции последовал50 мс позже конъюнктивной второй PF- и CF-стимуляции(рисунок 2B). В условиях напряжения-зажима с использованием внутреннего раствора на основеCs,соединение 2 PF стимуляции и соматической деполяризации были применены (протокол 3) (Рисунок 2C). Первый PF-стимуляции последовал50 мс позже сопутствующей применения второй PF-стимуляции и соматической деполяризации. Внутренний ток был получен при соматической деполяризации от -70 до 0 мВ. Хвостовой ток также был вызван после реполяризации. Иногда наблюдалось повторяющееся генерирующее внутренний ток, что отражало бы активность Ca-spike в удаленном дендритном регионе, где мембранный потенциал не был зажат достаточно, несмотря на использование внутреннего решения на основе Csq( Рисунок 2С). Наконец, 5 PF-стимулов при 100 Гц были даны одновременно с соматической деполяризации в условиях напряжения-зажима (протокол 4). Опять же, повторяющиеся поколения внутренних течений были вызваны во время деполяризации и хвост ток был вызван после реполяризации. Сроки повторяющегося поколения внутреннего тока не были синхронизированы с PF-стимулами(рисунок 2D). Иногда повторяющееся поколение внутреннего тока продолжалось после реполяризации.

Что касается LTD индуцированных протоколами-1 и -2, сокращение EPSC-амплитуды измеряется в течение 25-мин после начала Cj был рассеян на относительно широкий диапазон32. По сравнению со стабильной формой PF-EPSP, форма сложного всплеска была довольно переменной от клетки к клетке. Поскольку шипы в сложном шипе отражают активацию Ca2-каналов33, форма сложного шипа, такого как амплитуда или крутизна шипов, влияющих на амплитуду LTD, была исследована с помощью сложного всплеска, вызванного протоколом 1. Поскольку форма сложных шипов, вызванных протоколом 2, была загрязнена PF-EPSP, мы не анализировали эти данные. Во-первых, сумма всех шипов (1-4)-амплитуды коррелировала с амплитудой LTD (-ЗЭПСК %) (Рисунок 3A,B). Коэффициент корреляции (r) составил 0,28, но не был статистически значимым (р. Потому что шипы 2-4 содержали больше Ca2 '-компонентамплитуды34, сумма шипклета (2-4)-амплитуды была коррелирована с LTD-амплитудой. Корреляция, казалось, сильнее (r 0.67), но все еще не статистическизначимым (р. Далее, максимальное значение dVm/dt (максимальная скорость подъема »MRR) каждого шипа была рассчитана(рисунок 3D), потому что продукт ембранной ембраны емкостя (Cm) и dVm/dt примерно отражает мембранные токи35. Исследована корреляция между продуктом Cm и суммой MRR шипов (1-4) и амплитудой LTD(рисунок 3E),а также р был 0,18 (стр. Корреляция между продуктом Cm и сумма MRR шипов (2-4) показал немного сильнее r (0,36), но это не былозначительным (р.

В условиях зажима напряжения протокол 3 с 180 Cjs эффективно индуцированных LTD(Рисунок 4B)32. Однако, может ли меньшее количество стимулов эффективно вызвать LTD остается неизвестным. Таким образом, 60 Cjs были применены на 1 Гц в течение 1 мин. Около 10 мин после Cj, амплитуда EPSC была подавлена, однако, он восстановился в 15 минут после начала Cj-начала. Это говорит о том, что 60 раз CJs на 1 Гц было недостаточно, чтобы побудить LTD(рисунок 4A). Кроме того, повторение соматической деполяризации только (180 раз) не побуждает LTD(рисунок 4B)32.

Протокол 4 был первоначально использован Steinberg et al.30 для молодых мышей (P14-21). Ltd, как сообщается, индуцированных 30 Cjs на 0,5 Гц на RT в диком типе мозжечка. Однако, когда 30 Cjs были применены к взрослым мышам мозжечковый ломтик (3-6 месяцев) при цене около 30 градусов по Цельсию, не LTD был индуцирован(рисунок 5A). В отличие от этого, когда 90 Cjs были применены, обычная амплитуда LTD наблюдается(рисунок 5B)32. Опять же, соматической деполяризации в одиночку (90 раз на 0,5 Гц) не вызывают LTD(рисунок 5B).

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация протоколов для индуцирования ltd в синапсе PF-PC. (A)Протокол 1 Cj. 1 PF и 1 CF стимулы применяются одновременно 300 раз на 1 Гц (5 минут) в текущих условиях зажима. Электрод для записи из цельных клеток содержит внутреннее решение на основеK. (B) Протокол 2 Cj. 2 PF и 1 CF стимулы применяются одновременно 300 раз при 1 Гц (5 мин) при текущем состоянии. Электрод содержит внутреннее решение на основеK-на основе. (C) Протокол 3 Cj. 2 PF и соматической деполяризации (-70 до 0 мВ, 50 мс) применяются 180 раз при 1 Гц (3 мин) при состоянии напряжения-зажима, так что второй стимул PF применяется одновременно с началом соматической деполяризации. Электрод содержит внутреннее решение на основе Csи. (D). Протокол 4 Cj. 5 PF при 100 Гц и соматическая деполяризация применяются 90 раз при 0,5 Гц (3 мин) при состоянии напряжения-зажима, одновременно. Электрод содержит внутреннее решение на основе Csи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Напряжение или текущие следы ПК во время стимуляции соединения. (A) Мембрана потенциальный след, вызванный протоколом 1 Cj. (B) Мембрана потенциальный след, вызванный протоколом 2 Cj. (C) Membrane текущий след, вызванный протоколом 3 Cj. (D) Membrane текущий след, вызванный протоколом 4 Cj. Вертикальные бары 10 мВ (A и B), 1 nA (C и D). Горизонтальный бар 20 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Связь между шипами сложного шипа и ltd-амплитуды. (A) Представительслед сложного всплеска, вызванного протоколом 1. Стрелки указывают на пики шипов (1-4). Шкала бар 20 мВ. (B) Связь между суммой амплитуды шипов (1-4) и LTD-амплитуды (-Зепск %) (р 0,28, р. (C) Связь между суммой амплитуды шипов (2-4) и LTD-амплитуды (r 0.67, р. (D) Представительный след дифференцированных сложных шипов, показанных в A. Стрелки указывают пики dVм/dt шипов. Шкала баров 5 мс, 50 V/s. (E) Отношение между продуктами Cm и сумма MRR шипов (1-4) и амплитуды LTD (-Зепск %) (р 0,18, р. (F) Связь между продуктом Cm и сумма MRR шипов (2-4) и амплитуды LTD (р 0,36, р. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Влияние количества повторений на ltd-индукцию с помощью протокола-3 Cj. (A) Отказ ИНД индукции протоколом-3 Cj, повторение было 60 на 1 Гц. Средняя амплитуда PF-EPSC записана до и после протокола-3 Cj (черная колонка внизу). Амплитуда PF-EPSC была нормализована теми, которые были записаны до того, как символ Cj. Заполненный указывает на среднее амплитуду EPSC. Ошибки баров обозначают SEM. Inset: наложенные следы PF-EPSC (вверху) были записаны ранее (отмечено 1) и 25-29 мин после начала Cj-stim (отмечено 2). Каждый след представляет собой в среднем 6 записей. Шкала баров 100 pA, 10 мс. (B) Красный символ: LTD индуцированных протоколом 3 Cj, повторение было 180 раз на 1 Гц Синий символ: нет связи стимуляции, но соматической деполяризации был применен 180 раз на 1 Гц. LTD не был вызван. Вставки: наложенные следы PF-EPSC (вверху) были записаны ранее (отмечено 3) и 25-29 мин после начала Cj-stim (отмечено 4). Каждый след представляет собой в среднем 6 записей. Шкала баров No 100 pA, 10 мс данных, показанных в B же используется на рисунке 3B Ямагути и др.32. (C). Резюме сюжет средней амплитуды PF-EPSC, зарегистрированный в течение 25-29 мин после начала Cj. Depol: деполяризация. Числовой символ в скобках представляет количество ячеек. x60 - 60 раз, x180 - 180 раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Влияние количества повторений на ltd-индукцию с помощью протокола 4 Cj. (A) Отказ ИНД индукции протоколом 4 Cj, повторение было 30 раз при 0,5 Гц. Средняя амплитуда PF-EPSC, записанная до и после протокола-4 Cj (черная колонка в дне тр). Заполненный символ указывает на среднее амплитуду EPSC. Ошибки баров обозначают SEM. Inset: наложенные следы PF-EPSC (вверху) были записаны ранее (отмечено 1) и 25-29 мин после начала Cj-stim (отмечено 2). Каждый след представляет собой в среднем 6 записей. Шкала баров No 100 pA, 10 ms. (B) Красный символ: LTD индуцированных протоколом 4 Cj., синий символ: нет стимуляции соединения, но соматическая деполяризация была применена 180 раз на 0,5 Гц. LTD не была вызвана. Вставки: наложенные следы PF-EPSC (вверху) были записаны ранее (отмечено 3) и 25-29 мин после начала Cj-stim (отмечено 4). Шкала баров 100 pA, 10 мс данных, показанных в B же используется в Рисунке 4B Ямагути идр. 32. (C). Резюме сюжета средней амплитуды PF-EPSC, зарегистрированной в течение 25–29 мин. после наступления Cj. Depol: деполяризация. Числовой символ в скобках представляет количество ячеек. x30 - 30 раз, x90 - 90 раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Различия между четырьмя протоколами

В ltd-индуцирующих протоколов 1 и 2, Cjs 300 раз на 1 Гц достаточно, чтобы вызвать мозжечковый LTD. Частота стимуляции CF, казалось, в физиологическом диапазоне, потому что сложный всплеск скорости стрельбы в оповещения взрослых мышей (P60) было сообщено, 1,25 Гц36. Тем не менее, cf стимуляции только не вызывает долгосрочной пластичности в PF-CF синапсе, как это используется в протоколах 1 и 2(Рисунок 4, Рисунок 5), хотя CF-стимуляции только на более высокой частоте индуцированной LTD24. Форма сложного всплеска, проислизированного в протоколе 1, также не имела существенной связи с амплитудой LTD(рисунок 3). Возможно, форма сложного всплеска отражает усредненный Ca2 "концентрации,но не представляют собой местные Ca 2"концентрациив ветке, где LTD была индуцирована.

Что касается стимуляции PF, хотя 1 PF стимуляции обычно используется для индуцирования мозжечковой LTD26,27, гранулы клетки, как правило, огонь в режиме взрыва in vivo37. Таким образом, несколько активаций PF было бы лучше, чем одна стимуляция PF, чтобы имитировать физиологическую схему стрельбы, и активация mGluR1 зависела от количества и частоты PF стрельбы38. Таким образом, протокол-2 активировал бы ПКК более интенсивно, чем протокол-1. В некоторых мутировавших GluA2 стук-в мышах (K882A), только протокол-2 было достаточно, чтобы побудить LTD по сравнению с протоколом 132, предполагая, что более высокая концентрация активированных ПкК было необходимо, чтобы вызвать LTD для этой конкретной мутации GluA2.

Несколько стимуляций ПФ увеличит частоту ltd-индукции, но активация напряжения зависимых Ca2 "каналчерез CF-стимуляции или соматической деполяризации по-прежнему требуется. Для того, чтобы увеличить активацию напряжения-зависимых Ca2 "канална ПК дендрит, где PF был стимулирован, клеточное тело ПК был деполяризован в условиях напряжения-зажима30. При использовании внутреннего решения на основеCs,сопротивление входным данным заметно увеличилось32,что свидетельствует об увеличении константа кабеля. Следовательно, количество активированных каналов Ca2 вдистальной области дендрита ПК будет увеличено. В некоторых мышах-мутантах GluA2 (No7), 2PF стимуляции и соматической деполяризации (протокол 3) или 5 PF стимуляции - соматическая деполяризация (протокол 4) может вызвать LTD. И наоборот, ни один феномен LTD не наблюдался протоколом 1 или 2 стимуляции. Вполне возможно, что соматическая деполяризация в условиях напряжения-зажима сCs-внутреннее решение активированного напряжения-зависимых Каналов Ка2 "происходитболее эффективно, чем активация CF-стимуляции в условиях текущего зажима сk-на основе внутреннего решения, и это может привести к неадтивной увеличение в "Ca2"в39 и последующей надежной PKC-активации, необходимых для LTD.

Возможный компенсационный механизм для LTD в гене манипулируемых животных

Теоретические исследования предполагает все или ни одного типа активации PKC на индукции LTD40, но в экспериментальных результатах с помощью некоторых генов манипулировали животных, таких как GluA2 стук-в мышах показали, что активация PKC варьируется в зависимости от ИНДУкции LTD протоколы32. Среди 4 различных протоколов наиболее эффективным индукционным протоколом для активации ПКК были протоколы 3 и 4, за которым следовал протокол 2, а самым слабым был протокол 1. У генно-манипулируемых животных компенсационные механизмы могут вызывать ltd32. Такие компенсационные механизмы могут иметь более низкую чувствительность к активированному ПКК. Если это так, то для оценки способности ИНДС к индукции у генов, вызывающих ltd, необходимы несколько наборов протоколов, вызывающих ltd, в том числе один, который может активировать PKC сильнее обычных протоколов. Хотя нормальная индукция LTD сCs-на основе внутреннего решения сообщается в культурных ПК15 или ПК в ломтики30, Cs-на основе внутреннего решения не является физиологическим. Тем не менее, активация напряжения-зависимого Ca2 -канална удаленном дендриттрудно трудно использовать соматическую деполяризацию в ломтик, из-за возможных механических повреждений во время подготовки и записи, которые могут привести к снижению длина постоянной. Таким образом, для обеспечения активации каналов Ca2 вдендритной области ПФ необходимо использовать протокол, который увеличивает длину постоянной с помощью cs-внутреннего решения.

Другие экспериментальные условия

Другие факторы также должны быть приняты во внимание, когда синаптической пластичности и поведения животных рассматриваются параллельно, такие как соответствие возраста животных и записи температуры в пробирке, потому что скорость трансдукции сигнала константы и трафик рецепторов высокочувствительны к температуре. На самом деле, моторное обучение in vivo уменьшило количество поверхностных выраженных рецепторов аМРА типа глутамата41 и размер асинхронного мини-EPSC на PF-PC синапсе42. В идеале, цельноклеточной записи зажима патч амб должно быть сделано при 37 градусах Цельсия, однако, стабильная долгосрочная запись трудно при 37 градусов по Цельсию. Таким образом, все электрофизиологические записи в этом исследовании были проведены при цене около 30 градусов по Цельсию. Хотя эта температура ниже, чем физиологическая температура, она по-прежнему будет обеспечивать более благоприятные условия для сравнения синаптических свойств, проанализированных в пробирке с поведенческой способности обучения. Эта разница в температуре записи может быть еще одним фактором, чтобы вызвать эти результаты отличаться от предыдущего доклада26. Кроме того, оценка постоянства пассивных мембранных свойств32 и внутренней возбудимости43,44 также имеет важное значение в изучении синаптической пластичности.

В заключение, чтобы исследовать причинно-следственную связь между синаптической пластичности и поведение животных в гене манипулировали животных, оценка синаптической пластичности в пробирке потребует тщательного контроля экспериментальных условий, таких как использование температуры регулирование и несколько типов протоколов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим А. Оба за ее техническую помощь. Это исследование было частично поддержано Грант-в-помощь для научных исследований (C) 17K01982 в K.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. The Cerebellum as a Neuronal Machine. , Springer. New York. (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

Tags

Нейронаука Выпуск 152 Синаптической пластичности LTD мозг ломтик цельноклеточная запись мышь Purkinje ячейки мозжечок параллельное волокно восхождение волокна
Оценка долгосрочной депрессии индукции в взрослых церебеллярной ломтики
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of … More

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter