Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Bedömning av långvarig depression induktion hos vuxna cerebellär skivor

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859

Summary

I vissa genmanipulerade djur, med hjälp av ett enda protokoll kan misslyckas med att inducera LTD i cerebellär Purkinje celler, och det kan finnas en diskrepans mellan LTD och motoriskt lärande. Flera protokoll är nödvändiga för att bedöma LTD-induktion hos genmanipulerade djur. Standard protokoll visas.

Abstract

Synaptisk plasticitet ger en mekanism för inlärning och minne. För cerebellär motoriskt lärande, långsiktig depression (LTD) av synaptiska transmissioner från parallella fibrer (PF) till Purkinje celler (PC) anses vara grunden för motoriskt lärande, och brister i både LTD och Motorisk inlärning observeras i olika genmanipulerade djur. Vanliga motoriska inlärnings uppsättningar, såsom anpassning av optokinetiska reflex (OKR), den vestibulära-okulära reflex (VOR), och rotarod test användes för utvärdering av motorisk inlärningsförmåga. Resultaten från GluA2-karboxy Terminus modifierade Knock-in-möss uppvisade dock en normal anpassning av VOR och OKR, trots att det saknades PF-LTD. I denna rapport försökte induktion av LTD endast använda en typ av stimuleringsprotokoll vid rumstemperatur. Sålunda, villkor för att inducera cerebellär LTD utforskades i samma Knock-in mutanter med hjälp av olika protokoll vid nära fysiologiska temperatur. Slutligen fann vi stimulans protokoll, som LTD kunde induceras i dessa genmanipulerade möss. I denna studie, en uppsättning protokoll föreslås för att utvärdera LTD-induktion, som mer exakt tillåter undersökning av orsakssambandet mellan LTD och motoriska lärande. Sammanfattningsvis, experimentella förhållanden är avgörande vid utvärdering av LTD i genmanipulerade möss.

Introduction

Den synaptiska organisationen av den utarbetade neuronala nätverk av cerebellär cortex, sammansatt av datorer, molekylära skikt interneuroner (korg och stellate celler), Golgi celler, PFs från granule celler, Mossy fibrer och klätter fibrer (CFs), har klargjorts När det gäller excitation/hämning och divergens/konvergens, och den välorganiserade kretsar diagrammet har föreslagit att lillhjärnan är en "neuronal maskin"1, men det fanns tidigare ingen aning om syftet med denna "maskin". Senare Marr föreslog att PFs indata till datorer utgör ett tredubbelt skikt associativt lärande nätverk2. Han föreslog också att varje CF förmedlar en cerebral instruktion för elementär rörelse2. Han antog att samtidig aktivering av PFs och CF skulle öka PF-PC synaps aktivitet, och orsaka långsiktig potentiering (ltp) av PF-PC synapsen. Å ena sidan antog Albus att synkron aktivering av PFs och CF resulterade in LTD på PF-PC-synapsesna3. Båda ovanstående studier tolkar lillhjärnan som en unik minnesenhet, införlivandet av som i lillhjärnan kortikala nätverk leder till bildandet av Marr-Albus modell inlärnings maskin modell.

Efter dessa teoretiska förutsägelser, två rader av bevis tyder på närvaron av synaptisk plasticitet i lillhjärnan. Den första raden av bevis föreslogs av den anatomiska organisationen av flocculus; här MF vägar av vestibulära orgeln ursprung och CF vägar av retinal ursprung konvergera på PCs4. Denna unika konvergens mönster tyder på att en synaptisk plasticitet som förekommer i flocculus orsakar anmärkningsvärd anpassningsbarhet av vestibulo-okulär reflex. För det andra stödde inspelningen av PCs svar i flocculus och lesioning av flocculus också ovanstående hypotes5,6,7. Dessutom, PC urladdning mönstret under anpassningen av en Monkey ' s hand Movement8 stödde Synaptic plasticitet hypotesen, särskilt Albus ' s Ltd-hypotesen3.

För att avgöra vilken typ av synaptisk plasticitet direkt, upprepad konjunktiv stimulering (CJS) av en bunt av PFs och CF som specifikt innerverar PC in vivo visades inducera LTD för överföring effekt av PF-PC synapser9, 10,11. I efterföljande in vitro-utforskningar med hjälp av en cerebellär slice12 och odlade datorer, förening av co-odlade granule cell stimulering och Olive cell stimulering13 eller konjunktion av jontoforetically applicerad glutamat och somatiska depolarisation14,15 orsakat Ltd. Den signaltransduktionsmekanism som legat till grund för Ltd-induktion utreddes också intensivt med hjälp av in vitro-preparat16,17.

Anpassningar av VOR och OKR användes ofta för kvantitativ utvärdering av genmanipulations effekter på cerebellär motoriskt lärande, eftersom vestibulen-cerebellär cortex har visat sig vara det väsentliga ursprunget i den adaptiva inlärning av VOR18 ,19,20 och okr19,21 sambandet mellan fel i Ltd-induktion och försämring av beteende motoriskt lärande har tagits som bevis för att Ltd spelar en viktig roll i motor inlärningsmetoder22. Dessa synpunkter är kollektivt kallas Ltd hypotesen om motoriskt lärande, eller Marr-Albus-Ito hypotes23,24,25,26.

Adaptiv inlärning av ögonrörelser mättes med liknande protokoll, medan olika experimentella förhållanden användes för att inducera Ltd i slice beredning27,28,29,30,31 . Nyligen, Schonewille et al.26 rapporterade att vissa genmanipulerade möss visat normal Motorisk inlärning, men cerebellär skivorna inte Visa Ltd, och därmed drog slutsatsen att Ltd inte var nödvändigt för motoriskt lärande. Emellertid, induktion av LTD var bara försökte använda en typ av protokoll vid rumstemperatur. Därför använde vi flera typer av LTD-inducerande protokoll under inspelningsförhållanden på runt 30 ° c, och vi bekräftade att LTD var tillförlitligt induceras i gen-manipulerade möss genom att använda dessa protokoll vid nära fysiologiska temperaturer32.

Men det återstår några frågor om de grundläggande egenskaperna hos konjunktiv stimulering. Den första är förhållandet mellan den komplexa Spike ' s form och amplitud av LTD. För det andra, i samband med PF-stimulering och somatisk depolarisering, om antalet stimuli som används var nödvändiga eller inte var svårfångade. I den aktuella studien utreddes dessa frågor med hjälp av Wild Type (WT) möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella förfaranden godkändes av RIKEN kommittén för vård och användning av djur i experiment. Möss hölls i djuranläggningen i RIKEN centrum för hjärn vetenskap under välkontrollerad temperatur (23 – 25 ° c) och luftfuktighet (45% – 65%) Villkor. Både manliga och kvinnliga WT-möss (C57BL/6, 3 – 6 månader) användes.

1. beredning av lösningar som används i experimenten

Anmärkning: Alla lösningar bör göras i ultrarent vattenfri från metaller (resistivitet > 18,2 MΩ) och andra föroreningar (totalt organiskt kol (TOC) < 5,0 ppb). Arbeta artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) för slice-skärning och inspelning görs nyligen på dagen för experiment från en 10 gånger (X10) lager av ACSF. Bubbla lösningarna med 5% CO2/95% O2 gasblandning före användning. PH-värdet hos acsf justeras till 7,4 ± 0,1, och osmolaritet justeras 315 ± 5 mOsm/kg genom att tillsätta ultrarent vatten.

  1. Förbered 10X lager av ACSF innehållande 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2Po4, och 260 mm NaHCO3. Denna lösning kan förvaras vid 4 ° c.
  2. Förbered arbetande ACSF innehållande 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mm mg2so4, 1,25 mm NaH2Po4, 26 mm NaHCO3 och 20 mm glukos.
    1. Först, tillsätt 1 ml 2 m CaCl2 lösning följt av 1 ml 1 m mg24 lösning i cirka 800 ml av ultrarent vatten, för att undvika nederbörd. Tillsätt sedan 100 mL 10X ACSF och glukos. Slutligen, gör upp till en total volym på 1 000 ml genom att tillsätta ultrarent vatten.
  3. Förbered 3,3% agar för hjärn hantering. Lös upp 1 g agar i 30 mL 0,9% NaCl-lösning och värm i en mikrovågsugn tills det bara kokar. Rör om för att blanda, sedan häll den i en steril 4 cm x 10 cm plastlåda och låt stelna. Förvara agarplattan (~8 mm tjocklek) i ett kylskåp.
  4. Förbered den interna lösningen.
    1. Förbered den K+-baserade interna lösningen som innehåller 60 mm kcl, 60 mm K-glukonat, 0,3 mm EGTA, 4 mm mgcl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP och 30 mm hepes (pH 7,2).
      Anmärkning: Låg koncentration (0,3 mm) av EGTA, en långsam ca2 +-chelator, tillsätts kelat möjligen förorenat ca2 + i rent vatten, men denna låga koncentration av EGTA i den inre lösningen blockerar aldrig induktion av Ltd (figur 3, Figur 4, figur 5) vid hel cells inspelning. Uppmätt osmotiskt tryck är 285 mOsm/kg.
    2. Förbered den cs+-baserade interna lösningen som innehåller 60 mm cscl, 46 mm D-glukonat, 27 mm tetraetylammoniumklorid (Tea-cl), 0,3 mm EGTA, 4 mm mgcl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP och 30 mm hepes (pH 7,2, justerat med CSOH).
      Anmärkning: Cs+ blockerar spänningsberoende K-kanaler, och förbättrar utrymme-klämma förhållanden på avlägsna dendriter genom att öka längden-konstant. Uppmätt osmotiskt tryck är 285 mOsm/kg.
    3. Förbered 200 μL-portioner av lösningarna och förvara vid-30 ° c.

2. hjärn dissektion och trimning

  1. Kyla och syrar 2 50 mL bägare av ACSF på is tills temperaturen är lägre än 4 ° c. Tillsätt 50 μL tetrodotoxin (TTX, 1 mM) i en av de iskalla bägare av ACSF och reservera den för skivor skärning. För att få mus cerebellär slice reservera LTD-inducerande förmåga, tillägg av TTX till det normala ACSF är nödvändigt.
  2. Kyl ner metall prov facket genom att fylla ett isbad område i skivning kammaren med is.
  3. Häll 1 mL isofluran i en anesthetizing burk (~1000 ml) sedan placera en mus i den för 30 – 45 s. se till att musen är djupt sövda genom att bekräfta dess oförmåga att reagera på mekanisk stimulering.
  4. Halshugga musen med hjälp av kirurgisk sax. Håll huvudet och skär den ytliga huden längs mittlinjen med hjälp av en oftalmologisk sax. Dra huden genom att hålla med fingrarna för att allmänt exponera skallens yta.
  5. Skär skallen horisontellt längs en linje från den stora Spinocerebellär hålet strax ovanför örat och ögat med hjälp av en oftalmologisk sax. Skär skallen längs en linje ovanför båda ögonen och ta bort för att isolera skallen.
  6. Skär hjärnan i mitten av storhjärnan med hjälp av en skalpell, sedan isolera den kaudala delen av hjärnan inklusive lillhjärnan från skallen. Doppa den i en iskall bägare av ACSF. Vanligtvis bör den totala tiden från halshuggning till nedsänkning av hjärn blocket i pre-kyld bägaren av ACSF vara mindre än 60 s.
  7. Placeringen av bubblande slangar bör justeras för att inte röra hjärn blocket i bägaren. Mekaniska skador kan orsaka svullnad av segmentet under inspelningen. Låt den vara i minst 7 min och låt hjärnan svalna.
  8. För att trimma hjärn blocket, skär en rektangulär agar bit (2 cm x 2 cm) från en stor agar tallrik (4 cm x 10 cm, lagras vid 4 ° c) och Lägg den på ett filtrerpapper för att absorbera överflödig vätska.
  9. Vrid agarbiten upp och ner på filterpapperet och placera sedan agarbiten på ett filtrerpapper på en förkyld metall preparat bricka (16 cm x 20 cm). Plocka upp hjärn blocket med hjälp av en spatel och absorbera överdriven vätska runt den med en bit filtrerpapper.
  10. Montera hjärn blocket på agar blocket med lim (medicinsk cyanoakrylat Instant lim). Se till att fästa botten (ventral sida) av hjärn blocket till agar.
  11. Klipp ut den högra hjärnhalvan med ett blad. Se till att sidan av skär planet är så parallell som möjligt till den dendritiska planet på datorn eftersom denna sida är fäst på ytan av preparat facket. Skär och ta bort den andra sidan av halvklotet. Sedan klippa hjärnan mellan den överlägsna och sämre colliculi, och skära av ryggmärgen.
  12. Limma höger sida av trimmad lillhjärnan med agarblocket på pre-kyld preparat bricka. Sprid överflödigt lim runt lillhjärnan med den platta delen av en spatel, för att förhindra överflödigt lim från att fästa till lillhjärnan ytan. Luta metall facket och häll ACSF för att fixa limmet och tvätta bort överflödigt lim.

3. hjärnskivning

  1. Orientera provet så att den dorsala sidan av lillhjärnan är på framsidan. Häll iskalla skär ACSF, innehållande 1 μM TTX, tillräckligt för att doppa lillhjärnan helt. Placera en gasröret i ACSF och börja bubblande med O2/Co2 gasblandning.
  2. Ta bort spindelvävshinnan Mater med en fin pincett under kikare. Skär lillhjärnan stjälk med ett blad, och ta bort hjärnstammen och agar blocket. Rotera facket 180 °, så att den dorsala ytan av lillhjärnan står inför en Razorblade.
  3. Ställ in bladet och justera den första skär platsen. Ställ in parametrarna för vibratome-skivning på följande: amplitud till 5,5, frekvens till 85 Hz, hastighet till 3 – 4 och segment tjock lek till 300 μm.
  4. Överför cerebellär slice på en nylon-net i en akryl inkubator och sänk ned slice helt i den oxygenerade ACSF. Inkubatorn ska placeras i ett vattenbad som håller en temperatur vid 26 ° c.
  5. Lagra skivorna i minst 1 h för att möjliggöra återhämtning från skadan under skivning.

4. inspelning med hel cells patch-klämma

Anmärkning: En patch-klämma inspelning kräver följande utrustning: ett upprätt Mikroskop med infraröd differential interferens kontrast (IR-DIC) optik, en patch-klämma förstärkare, data digitizer, digital stimulator, isolator, dator, programvara för data-förvärv och analys, motoriserad manipulator, Mikroskop plattform, vibrations isolerings tabell, Faraday bur, lösning värmesystem, Peristaltiska pumpar och elektrod avdragare.

  1. Tillsätt pikrotoxin (0,1 mm) till acsf och lösa det med Ultra-ultraljudsbehandling för 3 min.
  2. Parfymera en inspelnings kammare med picrotoxin-innehållande, O2-Co2-mättad acsf med en hastighet av 2 ml/min. Behåll temperaturen i inspelnings kammaren vid cirka 30 ° c.
  3. Gör en inspelning elektrod genom att dra ett borosilikatglas glas kapillär med glödtråden (yttre diameter = 1,5 mm) med en avdragare med 4 steg. Spets diametern bör vara cirka 1 μm.
  4. Gör en stimulerande elektrod genom att dra samma kapillär med avdragare med 2 steg, sedan bryta för att producera en fin spets genom att slå spetsen mot ett järn block under en binokulärmikroskop. Den slutliga diametern ska vara 3 – 5 μm.
  5. Överför cerebellär slice till inspelnings kammaren och fixa det med en PT-vikt med nylontrådar. Fyll en stimulerande elektrod med ACSF.
  6. För stimulering av PFs, placera stimulerande elektroden på ytan av det molekylära skiktet, runt 50 μm bort från Purkinje cell skiktet.
  7. För stimulering av CF, placera den stimulerande elektroden på botten av Purkinje cell skiktet (steg 5,3, 5,4).
  8. Filter K+-baserad eller CS+-baserad intern lösning med ett 0,45 μm filter. Använd en Micro-Loader för att fylla en inspelnings elektrod med 8 μL intern lösning.
  9. Applicera ett svagt positivt tryck på inspelnings elektroden innan du fördjuvar den i ACSF. Dess resistens bör vara 2 – 4 MΩ och den flytande av potentialen bör korrigeras.
  10. Närma sig den friska, ljusa cellkroppen av datorn med inspelningen elektroden. Tryckytan av Purkinje cell något, sluta tillämpa positivt tryck, Nästa tillämpa negativt tryck tills bildar en Giga-ohm tätning. Sedan upprätta hela cellen konfiguration med hjälp av negativt tryck.
  11. Håll membranpotentialen vid-70 mV, och applicera-2 mV Pulse (längd, 100 MS) vid 0,1 Hz för att övervaka Ingångsmotstånd, serie resistens och input kapacitans, kontinuerligt. Använd inte serien motstånd kompensation. Kassera data när serie motståndet varierar med mer än 15%.

5. induktion av LTD

  1. Stimulera det molekylära skiktet med en puls (varaktighet, 0,1 MS). Identifiera PF-excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSC) genom att tillämpa en dubbelpuls stimulans (interspike intervall (ISI) av 50 ms). PF-EPSC bör Visa Parade-puls underlättande och gradvis ökning av amplitud i förhållande till ökad stimulering intensitet.
  2. Spela in testsvaret från PF-EPSC genom att använda en enda puls vid 0,1 Hz. justera intensiteten i stimulansen så att den framkallade EPSC-amplituden är runt 200 pA. Undvik kontaminering av strömmen genom den spänningsberoende Joniska kanalen.
  3. Stimulera CF på botten av Purkinje cell skiktet, och identifiera EPSC framkallas av CF aktiveringen (genom att tillämpa en dubbel impuls stimulans). CF-EPSC bör Visa Parade-Pulse depression och en all-eller-none sätt enligt ökningen av stimuleringsintensitet. För LTD Induction bör en enda stimulans användas.
  4. LTD-inducerande protokoll 1
    1. Använd en elektrod som innehåller K+-baserad intern lösning underström-kläm förhållanden, applicera en enda PF-stimulans och en enda CF-stimulus samtidigt vid 1 Hz i 5 min (300 pulser) (figur 1a).
  5. LTD-inducerande protokoll 2
    1. Med hjälp av en elektrod innehållande K+-baserad intern lösning under nuvarande kläm förhållanden, applicera dubbla PF-STIMULI (ISI på 50 ms) och Single CF-stimulus som den andra PF-stimulansen är sammanfallande med CF-stimuli vid 1 Hz i 5 min (figur 1b).
  6. LTD-inducerande protokoll 3
    1. Använda en elektrod som innehåller cs+-baserad intern lösning under spännings-klämma villkor, tillämpa en dubbel PF-STIMULUS (ISI av 50 ms) och en enda depolariserande spänning-steg (-70 till 0 mV, 50 ms) till Soma vid 1 Hz för 3 min, så att den andra PF-stimulus är motsvarar början av depolariserande spännings steget (figur 1c).
  7. LTD-inducerande protokoll-4
    1. Använda en elektrod som innehåller cs+-baserad intern lösning under spännings-klämma villkor, tillämpa PF-stimuli (5x vid 100 Hz) och en enda depolariserande spänning-steg (-70 till 0 mV, 50 ms) till soma vid 0,5 Hz för 3 min, samtidigt (figur 1d ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fyra protokoll användes i denna studie för att inducera cerebellär Ltd. I de två första protokollen (protokoll 1 och 2) tillämpades konjunktionen av PF-stimulering och CF-stimulering underström-klämma villkorar. I de andra två protokollen (protokoll 3 och 4), var somatisk depolarisering ersatt för CF-stimulering under spännings-klämma förhållanden. Spännings spår eller ström-spår under konjunktiv stimulering jämfördes (figur 2).

Anslutning av 1 PF-stimulering och 1 CF-stimulering underström-klämma villkorar (protokoll-1) användes konventionellt för segmentera förberedelse26,27. Formen på den komplexa Spike framkallade av CJ var liknande den som framkallade av CF-stimulering ensam, med den första branta Småax följt av 2 till 3 spikelets (figur 2A). En liknande formad komplex Spike observerades under stimulering med protokoll 2, nämligen, 1 PF-stimulering följdes 50 ms senare av en konjunktiv andra PF-och CF-stimulering (figur 2b). Under spännings kläm förhållanden med hjälp av en cs+-baserad intern lösning tillämpades konjunktion av en 2 PF-stimulering och somatisk depolarisering (protokoll 3) (figur 2C). Den första PF-stimulering följdes 50 ms senare av en samtidig tillämpning av en andra PF-stimulering och somatisk depolarisering. En aktiv ström uppnåddes vid somatisk depolarisering från-70 till 0 mV. En Svanström framkallades också efter Repolarization. Ibland observerades repetitiv generering av en aktiv ström, vilket skulle återspegla ca-Spike aktivitet på den avlägsna dendritiska regionen där membranet potentialen inte var fastspänd tillräckligt, trots att använda en cs+-baserad intern lösning ( Figur 2C). Slutligen gavs 5 PF-stimuli vid 100 Hz samtidigt med den somatiska Depolariseringen under spännings kläm förhållanden (protokoll 4). Återigen var repetitiva generationen av inre strömmar framkallade under depolarisering och en svans ström eliciserades efter repolarisering. Tidpunkten för den repetitiva generationen av den inre strömmen synkroniserades inte med PF-stimuli (figur 2D). Ibland, repetitiv generation av aktiv ström fortsatte efter Repolarization.

När det gäller LTD induceras av protokoll-1 och-2, minskning av EPSC-amplitud mätt under 25-min efter uppkomsten av CJ var spridda över ett relativt brett spektrum32. Jämfört med den stabila formen av PF-EPSP, var formen av komplexa Spike ganska varierande från cell till cell. Eftersom spikelets i en komplex Spike reflekterade ca2 +-kanals aktiveringen33, formen av en komplex spik, såsom amplitud eller lutning av spikelets, påverkar Ltd amplitud undersöktes med komplexa Spike framkallas av protokoll 1. Eftersom formen på komplexa spikar framkallade av protokoll 2 var förorenade med PF-EPSP, Vi analyserade inte dessa data. Först, summan av alla spikelets (1 – 4)-amplitud var korrelerad med amplituden av LTD (-ΔEPSC%) (Figur 3a, B). Korrelationskoefficienten (r) var 0,28, men var inte statistiskt signifikant (p > 0,5). Eftersom spikelets 2 – 4 innehöll mer av ca2 +-komponent34, summan av Småax (2 – 4)-amplitud var korrelerad med Ltd-amplitud. Sambandet verkade vara starkare (r = 0,67), men fortfarande inte statistiskt signifikant (p > 0,1) (figur 3c). Därefter beräknades det maximala värdet för DVM/DT (högsta löneökningstakten [MRR]) för varje Småax (figur 3D), eftersom produkten av membran kapacitans (cm) och DVM/DT ungefär återspeglar membran strömmarna35. Sambandet mellan produkten av cm och summan av MRRs av spikelets (1 – 4) och LTD-amplitud undersöktes (figur 3E), och r var 0,18 (p > 0,9). Korrelationen mellan produkten av cm och summan av MRR av spikelets (2 – 4) visade en något starkare r (0,36) men det var inte signifikant (p > 0.2) (figur 3F).

Under spänning klämma villkor, protokoll 3 med 180 CJS effektivt inducerad LTD (figur 4b)32. Emellertid, om ett mindre antal stimuli effektivt kan inducera LTD förblir okänd. Sålunda, 60 CJS tillämpades vid 1 Hz för 1 min. runt 10 min efter CJ, EPSC amplituden dämpades dock, det återhämtade sig på 15 min efter CJ-debut. Detta tyder på att 60 gånger CJS vid 1 Hz var otillräcklig för att inducera LTD (figur 4a). Dessutom hade upprepning av somatisk depolarisering ensamt (180 gånger) inte inducerade LTD (figur 4b)32.

Protokoll 4 användes ursprungligen av Steinberg et al.30 för unga möss (P14 – 21). LTD var enligt uppgift induceras av 30 CJS vid 0,5 Hz vid RT i den vilda typen cerebellum. Men när 30 CJS tillämpades på de vuxna möss cerebellär slice (3-6 månad) vid runt 30 ° c, ingen LTD inducerades (figur 5a). Däremot, när 90 CJS tillämpades, observerades den vanliga amplituden av LTD (Figur 5b)32. Igen, somatisk depolarisering ensam (90 gånger vid 0,5 Hz) inducerade inte LTD (Figur 5b).

Figure 1
Figur 1: Schematisk illustration av protokoll för att inducera Ltd i PF-PC Synapse. A) protokoll 1 CJ. 1 PF och 1 CF-stimuli appliceras samtidigt 300 gånger vid 1 Hz (5 min) under aktuella kläm förhållanden. Elektrod för hel cells inspelning innehåller K+-baserad intern lösning. (B) protokoll 2 CJ. 2 PF och 1 CF-stimuli appliceras samtidigt 300 gånger vid 1 Hz (5 min) underström-klämma villkorar. Elektroden innehåller K+-baserad intern lösning. (C) protokoll 3 CJ. 2 PF och somatisk depolarisering (-70 till 0 mV, 50 ms) appliceras 180 gånger vid 1 Hz (3 min) under spännings-klämma tillstånd, så att den andra PF stimulus appliceras samtidigt med början av den somatiska depolarisering. Elektrod innehåller cs+-baserad intern lösning. (D). protokoll 4 CJ. 5 PF vid 100 Hz och somatiska depolarisering tillämpas 90 gånger vid 0,5 Hz (3 min) under spännings-klämma tillstånd, samtidigt. Elektrod innehåller cs+-baserad intern lösning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: spänning eller ström spår av datorn under konjunktion stimulering. (A) membran potentiell spår framkallas av protokoll 1 CJ. (B) membran potentiella spår framkallas av protokoll 2 CJ. (C) membran ström spår framkallas av protokoll 3 CJ. (D) membran ström spår framkallas av protokoll 4 CJ. Vertikala staplar = 10 mV (A och B), 1 nA (C och D). Horisontell stapel = 20 MS. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: förhållandet mellan Småax av en komplex Spike och Ltd-amplitud. A) representativa spår av en komplex spik som framkallas av protokoll 1. Pilar indikerar toppar av spikelets (1 – 4). Skalstapel = 20 mV. (B) förhållandet mellan summan av amplituden för spikelets (1 – 4) och Ltd-amplitud (-ΔEPSC%) (r = 0,28, p > 0,5). (C) förhållandet mellan summan av amplituden av spikelets (2 – 4) och Ltd-amplitud (r = 0,67, p > 0,1). Drepresentativa spår av differentierade komplexa spikar som visas i A. pilar indikerar toppar av DVm/DT av spikelets. Skalstreck = 5 MS, 50 V/s. (E) förhållandet mellan produkter av cm och summan av MRR av spikelets (1 – 4) och AMPLITUD av Ltd (-ΔEPSC%) (r = 0,18, p > 0,7). Fförhållandet mellan produkten av cm och summan av MRR av spikelets (2 – 4) och AMPLITUD av Ltd (r = 0,36, p > 0,4). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: effekt av antal repetitioner på Ltd-induktion med hjälp av protokoll-3 CJ. (A) underlåtenhet av Ltd induktion av protokoll-3 CJ, upprepning var 60 vid 1 Hz. genomsnittlig PF-EPSC amplitud registreras före och efter protokoll-3 CJ (svart kolumn längst ner). PF-EPSC amplitud normaliserades av de som registrerats före CJ. fylld symbol indikerar medelvärdet för EPSC-amplituden. Felstaplar betecknar SEM. Inset: ovanpå PF-EPSC-spår (överst) spelades in före (märkt 1) och 25 – 29 min efter CJ-Stim debut (märkt 2). Varje spår representerar medelvärdet av 6 poster. Skalstreck = 100 pA, 10 MS. (B) röd symbol: Ltd inducerad av protokoll 3 CJ, upprepning var 180 gånger vid 1 Hz. blå symbol: ingen konjunktion stimulering men somatisk depolarisering tillämpades 180 gånger vid 1 Hz. Ltd var inte induceras. Infällning: överlagrade PF-EPSC-spår (överst) spelades in före (markerade 3) och 25 – 29 minuter efter att CJ-Stim debuterade (märkt 4). Varje spår representerar medelvärdet av 6 poster. Skalstreck = 100 pA, 10 MS. data som visas i B är desamma som används i figur 3B i Yamaguchi et al.32. (C) summariskPlot av medelvärdet PF-EPSC amplitud registreras under 25 – 29 min efter debut av CJ. depol: depolarisering. Det numeriska tecknet inom parentes representerar antalet celler. x60 = 60 gånger, x180 = 180 gånger. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: effekt av antal repetitioner på Ltd-induktion med hjälp av protokoll 4 CJ. (A) underlåtenhet av Ltd induktion av protokoll 4 CJ, upprepning var 30 gånger vid 0,5 Hz. genomsnittlig PF-EPSC amplitud registreras före och efter protokoll-4 CJ (svart kolumn vid thr botten). Fylld symbol indikerar medelvärdet för EPSC-amplituden. Felstaplar betecknar SEM. Inset: ovanpå PF-EPSC-spår (överst) spelades in före (märkt 1) och 25 – 29 min efter CJ-Stim debut (märkt 2). Varje spår representerar medelvärdet av 6 poster. Skalstreck = 100 pA, 10 MS. (B) röd symbol: Ltd inducerad av protokoll 4 CJ., blå symbol: ingen konjunktion stimulering men somatisk depolarisering tillämpades 180 gånger vid 0,5 Hz. Ltd var inte induceras. Infällning: överlagrade PF-EPSC-spår (överst) spelades in före (markerade 3) och 25 – 29 minuter efter att CJ-Stim debuterade (märkt 4). Skalstreck = 100 pA, 10 MS. data som visas i B är desamma som används i figur 4B i Yamaguchi et al. 32. (C). Sammanfattning Plot av medelvärdet PF-EPSC amplitud registreras under 25 – 29 min efter debut av CJ. Depol: depolarisering. Det numeriska tecknet inom parentes representerar antalet celler. x30 = 30 gånger, x90 = 90 gånger. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Skillnader mellan de fyra protokollen

I LTD-inducerande protokoll 1 och 2, CJS 300 gånger vid 1 Hz är tillräckligt för att inducera cerebellär LTD stimulering frekvens av CF verkade vara i ett fysiologiskt område, eftersom den komplexa Spike bränning hastighet i Alert vuxna möss (P60) rapporterades vara 1,25 Hz36. Emellertid, CF-stimulering ensamt inte orsaka långsiktig plasticitet i PF-CF synapsen, som används i protokollen 1 och 2 (figur 4, figur 5), men CF-stimulering ensam vid högre frekvens inducerad Ltd24. Formen på den komplexa spik, framkallade i protokoll 1, hade också några betydande samband med LTD-amplitud (figur 3). Kanske formen på den komplexa Spike återspeglar medelvärdet ca2 +-koncentration, men inte representerar den lokala ca2 +-koncentrationen i en branchlet där Ltd inducerades.

När det gäller PF stimulering, även om 1 PF stimulering var konventionellt används för att inducera cerebellär Ltd26,27, den granule cellen tenderade att avfyra i burst-läge in vivo37. Därför skulle flera aktiveringar av PF vara bättre än en enda PF stimulering för att efterlikna den fysiologiska bränning mönster, och mGluR1 aktiveringen berodde på antalet och frekvensen av PF bränning38. Sålunda, protokoll-2 skulle aktivera PKC mer intensivt än protokoll-1 gjorde. I vissa muterade GluA2 Knock-in möss (K882A), endast protokoll-2 var tillräckligt för att inducera LTD jämfört med protokoll 132, vilket tyder på att en högre koncentration av aktiverat PKC krävdes för att inducera Ltd för denna särskilda GluA2 mutation.

Multipel stimuleringar av PFEN skulle förhöjning incidensen av Ltd-induktion, men aktivering av en spännings anhörig ca2 +-kanaliserar via CF-stimulering eller somatisk depolarisation krävdes fortfarande. För att förhöjning aktiveringen av ettanhörigen ca2 +-kanaliserar på datoren Dendrite, var PFEN stimulerades, cellen förkroppsligar av PC Aricebo under spänning-klämma villkorar30. Vid användning av en cs+-baserad intern lösning ökade ingångs motståndet markant32, vilket tyder på en ökning av kabelkonstanten. Följaktligen, antalet aktiverade ca2 +-kanaler i distala området av PC Dendrit skulle ökas. Hos vissa GluA2 muterade möss (Δ7) kunde 2PF-stimulering + somatisk depolarisering (protokoll 3) eller 5 PF-stimulering + somatisk depolarisering (protokoll 4) inducera LTD. omvänt observerades inget LTD-fenomen genom protokoll 1 eller 2-stimulering. Det kan vara att somatisk depolarisering under spännings-klämma villkor med cs+-intern lösning aktiverad spänningsberoende ca2 +-kanaler uppstår mer effektivt än aktivering av CF-stimulering underström-klämma villkor med K+-baserad intern lösning, och detta kan orsaka en icke-additiv ökning i [ca2 +]i39 och en efterföljande robust PKC-aktivering krävs för Ltd.

Möjlig kompensatorisk mekanism för LTD i genmanipulerade djur

Teoretisk studie förutsätter en all-eller-none typ aktivering av PKC upon LTD induktion40, men i experimentella resultat med hjälp av vissa genmanipulerade djur såsom GluA2 Knock-in möss visat att aktiveringen av PKC varierade beroende på Ltd induktion protokoll32. Bland 4 olika protokoll, det mest effektiva induktions protokollet för att aktivera PKC var protokoll 3 och 4, följt av protokoll 2 och den svagaste var protokoll 1. I genmanipulerade djur kan kompenserande mekanismer orsaka LTD32. Sådana kompenserande mekanismer kan ha lägre känslighet föraktiverad PKC. Om så är det, flera uppsättningar av LTD-inducerande protokoll, inklusive en som kan aktivera PKC starkare än konventionella protokoll, är nödvändigt att utvärdera LTD induktion förmåga i genmanipulerade djur. Även om normal induktion av LTD med cs+-baserad intern lösning rapporteras i odlade datorer15 eller PCs i skivor30, en cs+-baserad intern lösning är inte fysiologisk. Aktivering av en spänningsberoende ca2 +-kanal vid en avlägsen Dendrit är dock svårt att använda somatisk depolarisering i segmentet, på grund av den eventuella mekaniska skadan under beredning och registrering, vilket kan orsaka en minskning av längd-konstant. Således, för att säkerställa aktivering av ca2 +-kanaler i PF-stimulerande dendritiska regionen, är det nödvändigt att använda ett protokoll som ökar längden-konstant med hjälp av en cs+-intern lösning.

Andra experimentella tillstånd

Andra faktorer bör också beaktas när synaptisk plasticitet och djur beteende undersöks parallellt, såsom matchning av djurens ålder och inspelnings temperaturen in vitro, eftersom signaltransduktionshastighetskonstanter och receptor handel är mycket temperaturkänsliga. Faktiskt, motoriskt lärande in vivo minskat antalet yta uttryckt AMPA-typ glutamatreceptorer41 och storleken på asynkron mini-EPSC på PF-PC synaps42. Helst bör hela cell patch klämma inspelning göras vid 37 ° c, men en stabil långtids inspelning är svårt vid 37 ° c. Därför utfördes alla elektrofysiologiska inspelningar i denna studie vid cirka 30 ° c. Även om denna temperatur är lägre än fysiologisk temperatur, det fortfarande skulle ge mer gynnsamma villkor för att jämföra synaptiska egenskaper analyseras in vitro med beteendemässig inlärningsförmåga. Denna skillnad i inspelnings temperaturer kan vara en annan faktor att orsaka dessa resultat skiljer sig från tidigare rapport26. Dessutom, bedömning av beständighet av passiva membran egenskaper32 och inneboende retbarhet43,44 är också viktigt i studien av synaptisk plasticitet.

Sammanfattningsvis, för att undersöka orsakssambandet mellan synaptisk plasticitet och djur beteende i gen manipulerade djur, bedömning av synaptisk plasticitet in vitro skulle kräva noggrann kontroll av experimentella tillstånd såsom att använda temperatur förordning och flera typer av protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar A. Oba för hennes tekniska hjälp. Denna forskning stöddes delvis av bidrag till vetenskaplig forskning (C) 17K01982 till K.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. The Cerebellum as a Neuronal Machine. , Springer. New York. (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

Tags

Neurovetenskap synaptisk plasticitet LTD Brain slice hel cells inspelning mus Purkinje cell cerebellum parallell fiber klättring fiber
Bedömning av långvarig depression induktion hos vuxna cerebellär skivor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of More

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter