Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Published: October 16, 2019 doi: 10.3791/59859
Automatic Translation
1, 2
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Summary

Bazı gen manipüle hayvanlarda, tek bir protokol kullanarak serebellar Purkinje hücrelerinde LTD neden başarısız olabilir, ve LTD ve motor öğrenme arasında bir tutarsızlık olabilir. Gen lemanlı hayvanlarda LTD indüksiyonu değerlendirmek için birden fazla protokol gereklidir. Standart protokoller gösterilir.

Abstract

Sinaptik plastisite öğrenme ve bellek için bir mekanizma sağlar. Serebellar motor öğrenme için, paralel liflerden (PF) Purkinje hücrelerine (PC) sinaptik iletimlerin uzun süreli depresyonu (LTD) motor öğrenmenin temeli olarak kabul edilir ve hem LTD hem de motor öğrenme nin eksiklikleri çeşitli genle manipüle edilmiş hayvanlar. Motor öğrenme yeteneğinin değerlendirilmesi için optokinetik refleks (OKR), vestibüler-göz refleksi (VOR) ve rotarod testi gibi yaygın motor öğrenme setleri kullanıldı. Ancak, GluA2 karboksi sonlandırıcı modifiye knock-in fareler elde edilen sonuçlar, PF-LTD olmamasına rağmen, VOR ve OKR normal adaptasyon gösterdi. Bu raporda, LTD indüksiyon uymuş sadece oda sıcaklığında stimülasyon protokolü bir tür kullanılarak denendi. Böylece, serebellar LTD indüklemek için koşullar yakın fizyolojik sıcaklıkta çeşitli protokoller kullanılarak aynı knock-in mutantlar araştırıldı. Son olarak, LTD'nin bu gen letimli farelerde indüklenebileceği stimülasyon protokolleri bulduk. Bu çalışmada, LTD-indüksiyonu değerlendirmek için bir dizi protokol önerilmiştir, bu da LTD ile motor öğrenimi arasındaki nedensel ilişkinin daha doğru bir şekilde incelenmesine olanak sağlayacaktır. Sonuç olarak, gen leilgili farelerde LTD değerlendirilirken deneysel koşullar çok önemlidir.

Introduction

Serebellar korteksin ayrıntılı nöronal ağların sinaptik organizasyonu, bilgisayarları oluşan, moleküler tabaka internöronlar (sepet ve stellat hücreleri), Golgi hücreleri, granül hücrelerinden PFs, yosunlu lifler ve tırmanma lifleri (CFs), aydınlatılmış edilmiştir uyarma / inhibisyon ve divergence / yakınsama açısından, ve iyi organize devre diyagramı beyincik bir "nöronal makine"1olduğunu ileri sürmüştür , bu "makine" amacı hakkında daha önce hiçbir fikrim olmamasına rağmen. Daha sonra Marr, PC'lere yapılan PF'lerin üçlü kat bir çözümleme ağı2oluşturduğunu ileri sürüler. Ayrıca her CF elemental hareket2için bir serebral talimat ilettiğini önerdi. O PFs ve CF eşzamanlı aktivasyonu PF-PC sinaps aktivitesini artırmak ve PF-PC sinaps uzun vadeli potentiation (LTP) neden olacağını varsaydı. Öte yandan, Albus PFs ve CF senkron aktivasyon PF-PC sinaps3LTD sonuçlandı varsayılır. Yukarıdaki çalışmaların her ikisi de serebellum benzersiz bir bellek cihazı olarak yorumlamak, hangi serebellar kortikal ağ içine dahil Marr-Albus modeli öğrenme makinesi modelioluşumuna yol açar.

Bu teorik tahminlere göre, iki satır lık kanıt sinajik plastisitenin beyincikte varlığını göstermektedir. İlk kanıt satırı flocculus anatomik organizasyonu tarafından önerildi; Burada vestibüler organ kökenli MF yolları ve retina kökenli CF yolları 4' tebirleşir. Bu eşsiz yakınsama deseni, flocculus'ta meydana gelen bir sinaptik plastisitenin vestibulo-oküler refleksin dikkat çekici adaptasyonuna neden olduğunu göstermektedir. İkinci olarak, flocculus'taki PK'ların yanıtının kaydedilmesi ve flocculus'un lezyonunun da desteklediği yukarıdaki hipotez5,6,7. Ayrıca, bir maymunun el hareketi8 adaptasyon sırasında PC deşarj desen sinaptik plastisite hipotezi, özellikle Albus's LTD-hipotezimaj 3destekledi.

Doğrudan sinaptik plastisite doğasını belirlemek için, tekrarlanan konjonktif stimülasyon (Cjs) PFs bir paket ve cf özellikle in vivo PC innerve PF-PC sinapsların iletim etkinliği için LTD ikna gösterilmiştir9, 10,11. Bir serebellar dilim12 ve kültürlü bilgisayarları kullanarak sonraki in vitro keşiflerde, co-kültürlü granül hücre stimülasyon ve zeytin hücresi stimülasyon13 veya iyontophoretically uygulanan glutamat ve somatik birlikte depolarizasyon14,15 LTD neden oldu. LTD-indüksiyonun altında yatan sinyal iletim mekanizması da in vitro preparatlar kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır16,17.

VOR ve OKR adaptasyonları genellikle serebellar motor öğrenme gen manipülasyon etkilerinin kantitatif değerlendirilmesi için kullanılmıştır, vestibüle-serebellar korteks VOR adaptif öğrenme temel kökeni olduğu kanıtlanmıştır çünkü18 ,19,20 ve OKR19,21 LTD-indüksiyon başarısızlığı ve davranışsal motor öğrenme bozukluğu arasındaki korelasyon, LTD motor önemli bir rol oynadığını kanıt olarak alınmıştır öğrenme mekanizmaları22. Bu görüşler topluca motor öğrenme LTD hipotezi veya Marr-Albus-Itohipotezi 23,24,25,26olarak adlandırılır .

Göz hareketinin adaptif öğrenme benzer protokoller kullanılarak ölçülür, çeşitli deneysel koşullar dilimhazırlanmasındaLTD ikna etmek için kullanılmıştır 27,28,29,30,31 . Son zamanlarda, Schonewille ve ark.26 bazı gen manipüle fareler normal motor öğrenme gösterdi bildirdi, ama serebellar dilimleri LTD göstermedi, ve bu nedenle LTD motor öğrenme için gerekli olmadığı sonucuna vardı. Ancak, LTD indüksiyon sadece oda sıcaklığında protokol bir tür kullanılarak denendi. Bu nedenle, yaklaşık 30 °C'de kayıt koşullarında çeşitli LTD-indükleme protokolleri kullandık ve LTD'nin bu protokolleri fizyolojik sıcaklıklarda kullanarak genle manipüle edilen farelerde güvenilir bir şekilde indüklendiğini doğruladık32.

Ancak, konjonktif stimülasyontemel özellikleri ile ilgili bazı sorular kalır. İlk karmaşık başak şekli ve LTD genliği arasındaki ilişkidir. İkinci olarak, PF-stimülasyon ve somatik depolarizasyon ile birlikte, kullanılan uyaran ların sayısıgerekli olup olmadığı zor du. Bu çalışmada, bu sorular yabani tip (WT) fareler kullanılarak araştırılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler, deneylerde hayvanların bakımı ve kullanımı konusunda RIKEN komitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler, RIKEN Beyin Bilimi Merkezi'nin hayvan tesisinde iyi kontrollü sıcaklık (23-25 °C) ve nem (%45-%65) altında tutuldu. Koşul -ları. Hem erkek hem de dişi WT fareler (C57BL/6, 3-6 ay) kullanıldı.

1. Deneylerde Kullanılan Çözümlerin Hazırlanması

NOT: Tüm çözümler metaliçermeyen ultra saf suda (direnç > 18,2 MΩ) ve diğer kirlerde (toplam organik karbon (TOC) < 5,0 ppb) yapılmalıdır. Dilim kesme ve kayıt için yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çalışma ACSF 10 kez (x10) stok deney gününde taze yapılır. Kullanmadan önce %5 CO2/ %95 O2 gaz karışımı ile çözeltileri kabar. ACSF'nin pH'ı 7.4 ± 0.1'e, ozmolarite ise 315 ± 5 mOsm/kg'a ultra saf su eklenerek ayarlanır.

  1. 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4ve 260 mM NaHCO3içeren 10 x ACSF stoku hazırlayın. Bu çözelti 4 °C'de saklanabilir.
  2. 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2,1 mM Mg2SO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 ve 20 mM glikoz içeren acsf çalışmaya hazırlayın.
    1. İlk olarak, yağış önlemek için yaklaşık 800 mL ultrasaf suya 1 mL 1 ML 1 M Mg2SO4 çözeltisi ile 1 mL ekleyin. Sonra 100 mL 10x ACSF ve glikoz ekleyin. Son olarak, ultra saf su ekleyerek toplam 1.000 mL hacim yaratın.
  3. Beyin işleme için% 3.3 agar hazırlayın. 30 mL'lik 1 g agarı %0,9 NaCl çözeltisinde çözünve kaynayana kadar mikrodalgafırında ısıtın. Karıştırmak için karıştırın, sonra steril bir 4 cm x 10 cm plastik kutu içine dökün ve katılaşmak için izin. Agar plakasını(yaklaşık8 mm kalınlığında) buzdolabında saklayın.
  4. Dahili çözümü hazırlayın.
    1. 60 mM KCl, 60 mM K-glukonat, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2,4 mM ATP, 0,4 mM GTP ve 30 mM HEPES içeren K+bazlı dahili solüsyonu hazırlayın (pH 7.2).
      NOT: Düşük konsantrasyon (0.3 mM) EGTA, yavaş bir Ca2 +-şelatör, saf suda muhtemelen kontamine Ca2 + şelat eklenir, ancak iç çözeltide EGTA bu düşük konsantrasyonu asla LTD indüksiyon engeller ( Şekil3, Şekil 4, Şekil 5) tüm hücre kaydı sırasında. Ölçülen ozmotik basınç 285 mOsm/kg'dır.
    2. 60 mM CsCl, 46 mM D-glukonat, 27 mM tetraethylamonnium klorür (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2,4 mM ATP, 0,4 mM GTP ve 30 mM HEPES (pH 7.2, CsOH kullanılarak ayarlanmış) içeren Cs+bazlı dahili solüsyonu hazırlayın.
      NOT: Cs+ voltaj bağımlı K-kanallarını engeller ve uzunluk sabitini artırarak uzak dendritlerde yer kıskaç koşullarını iyileştirir. Ölçülen ozmotik basınç 285 mOsm/kg'dır.
    3. Çözeltilerin 200 μL aliquot'larını hazırlayın ve -30 °C'de saklayın.

2. Beyin Diseksiyonu ve Kırpma

  1. Sıcaklık 4 °C'den az olana kadar buzüzerinde iki 50 mL ACSF gagasını soğutun ve oksijenverin. ACSF'nin buz gibi gagalarından birine 50 μL tetrodotoksin (TTX, 1 mM) ekleyin ve dilim kesme için saklayın. FARE serebellar dilim LTD indükleme yeteneği ayırarak elde etmek için, normal ACSF TTX eklenmesi gereklidir.
  2. Dilimleme odasının buz banyosu alanını buzla doldurarak metal numune tepsisini soğutun.
  3. Anestezi kavanozuna 1 mL isofluran(~1000 mL) dökün ve 30-45 s. Farenin mekanik uyarıma yanıt verememesini onaylayarak derinden anestezi olduğundan emin olun.
  4. Cerrahi makas kullanarak farenin kafasını koparın. Baş tutun ve bir oftalmolojik makas kullanarak orta hat boyunca yüzeysel deri kesti. Kafatasının yüzeyini yaygın olarak ortaya çıkarmak için parmaklarınızla tutarak deriyi çekin.
  5. Bir oftalmolojik makas kullanarak kulak ve göz hemen üzerinde büyük spinocerebellar delikten bir çizgi boyunca yatay kafatası kesin. Kafatasını iki gözün üstündeki bir çizgi boyunca kesin ve kafatasını izole etmek için çıkarın.
  6. Bir neşter kullanarak beyin ortasında beyin kesin, sonra kafatasından beyincik de dahil olmak üzere beynin kaudal kısmını izole. ACSF buz gibi bir kabın içine batırın. Genellikle, beyin bloğunun beyin bloğunun acsf öncesi soğutulmuş kabına daldırma için decapitation toplam süre az 60 s olmalıdır.
  7. Buklayan borunun konumu, kabın içinde beyin bloğunu karıştırmamak için ayarlanmalıdır. Mekanik hasar kayıt sırasında dilimin şişmesine neden olabilir. En az 7 dakika bekletin ve beynin soğumasını bekleyin.
  8. Beyin bloğunu kesmek için, büyük bir agar plakasından (4 cm x 10 cm) dikdörtgen bir agar parçası (2 cm x 2 cm) kesin ve fazla sıvıyı emmek için bir filtre kağıdına koyun.
  9. Agar parçasını filtre kağıdına ters çevirin, ardından agar parçasını önceden soğutulmuş metal numune tepsisi (16 cm x 20 cm) üzerine bir filtre kağıdına yerleştirin. Bir spatula kullanarak beyin bloğu pick up ve filtre kağıdı bir parça ile etrafında aşırı sıvı absorbe.
  10. Tutkal (tıbbi siyanoakrilat anlık yapıştırıcı) kullanarak agar blok üzerine beyin bloğu monte. Agar için beyin bloğunun alt (ventral tarafı) eklemek için emin olun.
  11. Sağ yarımküreyi bıçakla kesin. Kesme düzleminin tarafının PC'nin dendritik düzlemine mümkün olduğunca paralel olduğundan emin olun, çünkü bu taraf numune tepsisinin yüzeyine bağlı. Kesme ve yarımkürenin diğer tarafında kaldırın. Sonra, üst ve alt koliküli arasındaki beyni kesip, ve omuriliği kes.
  12. Önceden soğutulmuş numune tepsisine agar bloğu ile kesilmiş beyincik sağ tarafında tutkal. Spatulanın düz kısmıyla serebellumun etrafına aşırı tutkal yayın ve aşırı tutkalın serebellar yüzeye bağlanmasını önleyin. Metal tepsiyi yatırın ve tutkaldüzeltmek ve fazla tutkal yıkayın için ACSF dökün.

3. Beyin Dilimleme

  1. Serebellumun dorsal tarafı ön tarafta olacak şekilde örneği yönlendirin. 1 μM TTX içeren buz gibi kesme ACSF dökün, beyincik tamamen batırmak için yeterli. ACSF içine bir gaz tüpü yerleştirin ve O2/ CO2 gaz karışımı ile köpürme başlar.
  2. Dürbün altında ince bir cızırtı kullanarak araknoid mater çıkarın. Serebellar peduncle bir bıçakla kesin ve beyin sapı ve agar blok kaldırın. Tepsiyi 180°döndürün, böylece beyincik sırt yüzeyi bir jiletle karşı karşıya.
  3. Bıçağı ayarlayın ve ilk kesme yerini ayarlayın. Vibratom dilimleme parametrelerini aşağıdakilere ayarlayın: genlik 5,5'e, frekans85 Hz'e, hız 3-4'e ve dilim kalınlığı nı 300 μm'ye ayarlayın.
  4. Naylon ağdaki serebellar dilimi bir akrilik kuvöze aktarın ve dilimi oksijenli ACSF'ye tamamen batırın. Kuluçka makinesi 26 °C sıcaklık taslayan bir su banyosuna yerleştirilmelidir.
  5. Dilimleme sırasında oluşan hasarın geri kazanımı için dilimleri en az 1 saat saklayın.

4. Tüm hücreli Patch-clamp Kayıt

NOT: Bir yama-kelepçe kaydı aşağıdaki ekipman gerektirir: kızılötesi diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) optik, yama-kelepçe amplifikatör, veri sayısallaştırıcı, dijital uyarıcı, izolatör, bilgisayar, veri toplama için yazılım ile dik bir mikroskop ve analiz, motorlu manipülatör, mikroskop platformu, titreşim izolasyon tablosu, Faraday kafes, solüsyon ısıtma sistemi, peristaltik pompalar ve elektrot çekmece.

  1. ACSF'ye pikrotoksin (0,1 mM) ekleyin ve 3 dakika boyunca ultra-sonication kullanarak çözün.
  2. 2 mL/dk. Kayıt odasının sıcaklığınıyaklaşık30 °C'de koruyun.
  3. 4 adımlı bir çekmece kullanarak filament (dış çap = 1,5 mm) ile borosilikat cam kılcal çekerek bir kayıt elektrot olun. Uç çapı 1 μm civarında olmalıdır.
  4. 2 adım ile çekmece kullanarak aynı kılcal çekerek uyarıcı bir elektrot yapmak, sonra dürbün mikroskobu altında bir demir blok karşı ucu vurarak ince bir ipucu üretmek için kırmak. Son çapı 3-5 μm olmalıdır.
  5. Serebellar dilimi kayıt odasına aktarın ve naylon ipliklerle pt-ağırlık ile düzeltin. Acsf ile uyarıcı bir elektrot doldurun.
  6. PF'lerin uyarılması için, uyarıcı elektrotun purkinje hücre tabakasından yaklaşık 50 m uzakta, moleküler tabakanın yüzeyine yerleştirin.
  7. CF'nin uyarılması için, uyarıcı elektrotpurkinje hücre tabakasının altına yerleştirin (adım 5.3, 5.4).
  8. Filtre K+tabanlı veya Cs+tabanlı dahili çözelti 0,45 μm filtre ile. Bir kayıt elektrotunu 8 μL dahili çözeltiile doldurmak için bir mikro yükleyici kullanın.
  9. ACSF'ye sokmadan önce kayıt elektrobuna zayıf bir pozitif basınç uygulayın. Direnci 2-4 MΩ olmalı ve sıvı bağlantı potansiyeli düzeltilmelidir.
  10. Kayıt elektrotu ile bilgisayarın sağlıklı, parlak hücre gövdesine yaklaşın. Purkinje hücresinin yüzeyini hafifçe itin, pozitif basınç uygulamayı bırakın, bir sonraki giga-ohm mührü oluşturana kadar negatif basınç uygulayın. Sonra negatif basınç kullanarak tüm hücre yapılandırmasını kurun.
  11. Membran potansiyelini -70 mV'da tutun ve giriş direncini, seri direncini ve giriş kapasitansını sürekli olarak izlemek için 0,1 Hz'de -2 mV darbe (süre, 100 ms) uygulayın. Seri direnç telafisini kullanmayın. Seri direnci %15'ten fazla değiştiğinde verileri atın.

5. LTD'nin indüksiyonu

  1. Bir darbe (süre, 0.1 ms) ile moleküler tabaka uyarın. 50 ms'lik çift darbe liansi (interspike interval (ISI) uygulayarak PF-uyarıcı postsinaptik akımları (EPSC) tanımlayın. PF-EPSC, stimülasyon yoğunluğunu artırmak için eşleştirilmiş nabız kolaylaştırılması ve genlikte kademeli bir artış göstermelidir.
  2. 0.1 Hz.'de tek bir darbe uygulayarak PF-EPSC'nin test yanıtını kaydedin. Voltaj bağımlı iyonik kanal üzerinden akım kirlenmesini önleyin.
  3. Purkinje hücre tabakasının altındaki CF'yi uyarın ve CF aktivasyonu nun ortaya çıkan EPSC'yi tanımlayın (çift darbe liyakat uygulayarak). CF-EPSC eşleştirilmiş nabız depresyon ve stimülasyon yoğunluğundaki artışa göre bir all-or-none şekilde göstermelidir. LTD indüksiyonu için tek bir uyarıcı kullanılmalıdır.
  4. LTD-indükleme protokolü 1
    1. Akım kelepçesi koşullarında K+bazlı dahili solüsyon içeren bir elektrot kullanarak, tek bir PF-uyarıcı ve tek bir CF-uyarıcıaynı anda 1 Hz 5 dakika (300 darbe)(Şekil 1A)uygulayın.
  5. LTD-indükleme protokolü 2
    1. Akım kelepçesi koşullarında elektrot içeren K+bazlı dahili solüsyon kullanarak, ikinci PF-uyarıcı 1 Hz 5 dakika(Şekil 1B)ile tesadüfi olduğu için çift PF uyaran (50 ms ISI) ve tek CF-uyarıcı uygulayın.
  6. LTD-indükleme protokolü 3
    1. Voltaj-kelepçe koşullarında Cs+bazlı iç solüsyon içeren bir elektrot kullanarak, 1 Hz'de 3 dk soma'ya çift PF-stimul (50 ms ISI) ve tek bir depolarize voltaj adımı (-70-0 mV, 50 ms) uygulayın, böylece ikinci PF-uyarıcı depolarizasyon gerilim adımının başlangıcına eşdeğerdir (Şekil 1C).
  7. LTD-indükleme protokolü-4
    1. Voltaj-kelepçe koşullarında Cs+bazlı iç solüsyon içeren bir elektrot kullanarak, PF-uyaranlarını (100 Hz'de 5x) ve tek bir depolarize voltaj adımını (-70-0 mV, 50 ms) soma 0,5 Hz'de 3 dk boyunca uygulayın (Şekil 1D ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmada serebellar LTD.'yi ikna etmek için dört protokol kullanılmıştır. İlk iki protokolde (protokol 1 ve 2), pf-stimülasyon ve CF-stimülasyon un birleşimi akım kelepçesi koşullarında uygulandı. Diğer iki protokolde (protokol 3 ve 4), somatik depolarizasyon gerilim-kelepçe koşullarında CF-stimülasyon yerine geçildi. Konjonktif stimülasyon sırasında gerilim-iz veya akım izleri karşılaştırıldı (Şekil 2).

1 PF-stimülasyon ve 1 CF-stimülasyon akım-kelepçe koşulları altında (protokol-1) birleşimi geleneksel dilim hazırlanması için kullanılmıştır26,27. Cj tarafından ortaya çıkan karmaşık başak şekli cf-stimülasyon tek başına ortaya benzer, ilk dik spikelet 2-3 spikelets takip(Şekil 2A). Protokol 2 ile stimülasyon sırasında benzer şekilli kompleks başak gözlendi, yani, 1 PF-stimülasyon 50 ms sonra konjonktif ikinci PF- ve CF-stimülasyon takip edildi(Şekil 2B). Cs+bazlı iç çözelti kullanılarak gerilim-klemp koşullarında 2 PF stimülasyon ve somatik depolarizasyon birleşimi uygulandı (protokol 3)(Şekil 2C). İlk PF-stimülasyon 50 ms sonra ikinci bir PF-stimülasyon ve somatik depolarizasyon eşlik eden bir uygulama izledi. Somatik depolarizasyon da -70'den 0 mV'ye kadar içe doğru akım elde edildi. Bir kuyruk akımı da repolarizasyon sonra uyarılmış oldu. Bazen, bir cs+tabanlı iç çözelti (rağmen membran potansiyeli yeterince kenetlenmiş değildi uzak dendritik bölgede Ca-spike aktivitesi yansıtacak bir içe akım tekrarlayan nesil gözlenmiştir ( Şekil 2C). Son olarak, voltaj-kıskaç koşullarında somatik depolarizasyon ile 100 Hz'de 5 PF-uyaran aynı anda verildi (protokol 4). Yine de depolarizasyon sırasında tekrarlayan içe akımlar ortaya çıkarve repolarizasyon dan sonra kuyruk akımı ortaya çıkar. İç akımın tekrarlayan neslinin zamanlaması PF-uyaranlarla senkronize edilmedi (Şekil 2D). Bazen, içe akımın tekrarlayan nesil repolarizasyon sonra devam etti.

LTD protokolleri-1 ve -2 tarafından indüklenen gelince, Cj başlangıcı ndan sonra 25-dk sırasında ölçülen EPSC-genlik azaltılması nispeten geniş bir aralık32üzerinde dağınık oldu . PF-EPSP'nin kararlı şekliyle karşılaştırıldığında, karmaşık başak şekli hücreden hücreye oldukça değişkendi. Karmaşık bir başak çivisi Ca2 +kanal aktivasyon33yansıttığı için, karmaşık bir başak şekli, genlik veya sivri gibi diklik, LTD genliğini etkileyen karmaşık başak protokolü 1 tarafından ortaya çıkarılmıştır. Protokol 2'nin ortaya çıkardığı karmaşık dikenlerin şekli PF-EPSP ile kontamine olduğundan, bu verileri analiz etmedik. İlk olarak, tüm spikelets toplamı (1-4)-genlik LTD genliği ile korelasyon oldu (-ΔEPSC%) (Şekil 3A,B). Korelasyon katsayısı (r) 0.28 idi, ancak istatistiksel olarak anlamlı değildi (p > 0.5). Spikelets 2-4 Ca 2+-bileşen34daha fazla içerdiğinden, spikelet toplamı (2-4)-genlik LTD-genlik ile ilişkiliydi. Korelasyon daha güçlü görünüyordu (r = 0.67), ama yine de istatistiksel olarak anlamlı değildi (p > 0.1)(Şekil 3C). Daha sonra, her bir çivinin dVm/dt maksimum değeri (maksimum artış hızı [MRR]) hesaplandı(Şekil 3D),membran kapasitansi (Cm) ve dVm/dt'nin ürünü membran akımlarını kabaca yansıttığı için35. Cm'nin çarpımı ile ani etkenlerin MR'larının toplamı (1-4) ile LTD-genliği arasındaki korelasyon incelenmiştir(Şekil 3E),r ise 0.18 (p > 0.9) idi. Cm'nin çarpımı ile ani lerin MRR toplamı (2-4) arasındaki korelasyon biraz daha güçlü r (0.36) gösterdi ancak anlamlı değildi (p > 0 .6)(Şekil 3F).

Voltaj kelepçesi koşullarında, 180 Cjs ile protokol 3 verimli BIR ŞEKILDE LTD (Şekil 4B)32indüklenen . Ancak, uyaranların daha az sayıda etkili LTD neden olup olmadığı bilinmemektedir. Böylece, 60 Cjs 1 dk. Cj sonra yaklaşık 10 dk 1 Hz uygulandı, EPSC genliği bastırıldı, ancak Cj-başlangıçlı sonra 15 dakika kurtarıldı. Bu 1 Hz de 60 kez Cjs LTD (Şekil 4A)ikna etmek için yetersiz olduğunu göstermektedir. Ayrıca, somatik depolarizasyon tekrarı tek başına (180 kez) LTD neden vermedi (Şekil 4B)32.

Protokol 4 ilk olarak Steinberg ve ark.30 tarafından genç fareler için kullanılmıştır (P14-21). LTD bildirildi 30 Cjs tarafından 0.5 Hz RT vahşi tip beyincik indüklenen oldu. Ancak, 30 °C civarında erişkin farelerin serebellar dilimine (3-6 ay) 30 Cj uygulandığında, hiçbir LTD indüklenmedi(Şekil 5A). Buna karşılık, 90 Cjs uygulandığında, LTD'nin olağan genliği gözlenmiştir (Şekil 5B)32. Yine, somatik depolarizasyon tek başına (0.5 Hz 90 kez) LTD neden vermedi (Şekil 5B).

Figure 1
Şekil 1: PF-PC sinapsında LTD'yi ikna etmek için protokollerin şematik çizimi. (A) Protokol 1 Cj. 1 PF ve 1 CF uyaranları, mevcut kelepçe koşullarında 1 Hz 'de (5 dk) 300 kez aynı anda uygulanır. Tüm hücre kaydı için elektrot K+tabanlı iç çözelti içerir. (B) Protokol 2 Cj. 2 PF ve 1 CF uyaranları 1 Hz (5 dk) akım kelepçesi altında aynı anda 300 kez uygulanır. Elektrot K+bazlı iç çözelti içerir. (C) Protokol 3 Cj. 2 PF ve somatik depolarizasyon (-70-0 mV, 50 ms) 1 Hz 'de 1 Hz (3 dk) voltaj-kelepçe durumunda 180 kez uygulanır, böylece ikinci PF uyaran somatik depolarizasyonun başlamasıyla eş zamanlı olarak uygulanır. Elektrot Cs+bazlı iç çözelti içerir. (D). Protokol 4 Cj. 5 PF 100 Hz ve somatik depolarizasyon 90 kez 0.5 Hz (3 dk) voltaj-kelepçe durumu altında, aynı anda uygulanır. Elektrot Cs+bazlı iç çözelti içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Conjunction stimülasyon sırasında PC'nin gerilim veya akım izleri. (A) Protokol 1 Cj. (B) Protokol 2 Cj. (C) Protokol 3 Cj. (D) Protokol 4 Cj tarafından ortaya konan membran akım izi ile ortaya çıkarılalı membran potansiyel izi. Dikey çubuklar = 10 mV (A ve B), 1 nA (C ve D). Yatay çubuk = 20 ms. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Karmaşık bir başak ve LTD-genlik spikelet arasındaki ilişki. (A) Protokol 1 tarafından ortaya çıkarılanın karmaşık bir başak temsilcisi izi. Oklar sivri uçlara işaret eder (1-4). Ölçek çubuğu = 20 mV. (B) Başakların genlik toplamı (1-4) ile LTD-genliği (-ΔEPSC%) arasındaki ilişki (r = 0,28, p > 0,5). (C) Başakların genlik toplamı (2-4) ve LTD-genlik (r = 0,67, p > 0,1) arasındaki ilişki. (D) A. Oklarda gösterilen farklılaşmış kompleks sivri lerin temsili izi, sivri lerin dVm/dt tepelerini gösterir. Ölçek çubukları = 5 ms, 50 V/s. (E) Cm ürünleri ile ani sapıkların MRR toplamı (1-4) ve LTD genliği (-ΔEPSC%) arasındaki ilişki (r = 0.18, p > 0.7). (F) Cm'nin ürünü ile ani lerin MRR toplamı (2-4) ve LTD genliği (r = 0,36, p > 0,4) arasındaki ilişki. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Tekrar sayısının protokol-3 Cj kullanarak LTD-indüksiyonüzerine etkisi. (A) Protokol-3 Cj tarafından LTD indüksiyonuna geçilmemesi, tekrarı 1 Hz. Ortalama PF-EPSC genliği protokol-3 Cj 'den önce ve sonra (alttaki siyah sütun) 60 idi. PF-EPSC genliği Cj. Dolgulu sembol ortalama EPSC genliğini göstermeden önce kaydedilenler tarafından normalleştirildi. Hata çubukları SEM. Inset'i gösterir: üst üste PF-EPSC izleri (üstte) Cj-stim başlangıcından (2 işaretli) sonra (1 işaretli) ve 25-29 dakika önce kaydedildi. Her izleme 6 kaydın ortalamasını temsil eder. Ölçek çubukları = 100 pA, 10 ms. (B) Kırmızı sembol: LTD protokol 3 Cj tarafından indüklenen, tekrarı 1 Hz. Mavi sembolde 180 kez oldu: 1 Hz. LTD'de 180 kez bağlaç stimülasyonu yapılmadı ama somatik depolarizasyon uygulanmadı. Inset: üst üste PF-EPSC izleri (üstte) Cj-stim başlangıcından (4 işaretli) sonra (3 işaretli) ve 25-29 dakika önce kaydedildi. Her izleme 6 kaydın ortalamasını temsil eder. Ölçek çubukları = 100 pA, B'de gösterilen 10 ms. Yamaguchi ve ark.32'ninŞekil 3B'sinde kullanılan veriler aynıdır. (C). Cj. Depol'ün başlangıcından 25-29 dakika sonra kaydedilen ortalama PF-EPSC genliği özet çizimi: depolarizasyon. Parantez içinde sayısal karakter hücre sayısını temsil eder. x60 = 60 kez, x180 = 180 kez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tekrar sayısının 4 Cj protokolü kullanılarak LTD-indüksiyona etkisi. (A) Protokol 4 Cj ile LTD indüksiyonuna geçilmemesi, tekrarlama 0,5 Hz.'de 30 kez oldu. Dolgulu sembol ortalama EPSC genliğini gösterir. Hata çubukları SEM. Inset'i gösterir: üst üste PF-EPSC izleri (üstte) Cj-stim başlangıcından (2 işaretli) sonra (1 işaretli) ve 25-29 dakika önce kaydedildi. Her izleme 6 kaydın ortalamasını temsil eder. Ölçek çubukları = 100 pA, 10 ms. (B) Kırmızı sembol: LTD protokol 4 Cj., mavi sembol tarafından indüklenen: hiçbir bağlaç stimülasyon ama somatik depolarizasyon uygulanmadı 180 kez 0.5 Hz. LTD indüklenmedi. Inset: üst üste PF-EPSC izleri (üstte) Cj-stim başlangıcından (4 işaretli) sonra (3 işaretli) ve 25-29 dakika önce kaydedildi. Ölçek çubukları = 100 pA, B'de gösterilen 10 ms. Yamaguchi veark.'nın Şekil 4B'sinde kullanılan veriler le aynıdır. 32. (C). Cj. Depol'ün başlangıcından 25-29 dakika sonra kaydedilen ortalama PF-EPSC genliği özeti: depolarizasyon. Parantez içinde sayısal karakter hücre sayısını temsil eder. x30 = 30 kez, x90 = 90 kez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dört protokol arasındaki farklar

LTD-inducing protokolleri 1 ve 2, Cjs 300 kez 1 Hz serebellar LTD stimülasyon frekansı ikna etmek için yeterli dir. Cf stimülasyon frekansı fizyolojik bir aralıkta gibi görünüyordu, uyarı yetişkin farelerde karmaşık başak atış hızı olduğu bildirilmiştir çünkü (P60) 1.25 Hz36olduğu bildirilmiştir . Ancak, CF stimülasyon tek başına PF-CF sinaps uzun vadeli plastisite neden olmadı, protokol1 ve 2 kullanılan gibi(Şekil 4, Şekil 5), CF-stimülasyon tek başına yüksek frekansta indüklenen LTD24. Protokol 1'de ortaya alınan karmaşık başak şeklinin, LTD-genliği ile de önemli bir ilişkisi yoktur (Şekil 3). Belki karmaşık başak şekli ortalama Ca2 +konsantrasyonu yansıtır, ancak LTD indüklenen bir şube yerel Ca2 +konsantrasyonu temsil etmedi.

PF stimülasyon ile ilgili olarak, her ne kadar 1 PF stimülasyon geleneksel serebellar LTD 26, 27 in vivo37patlama modunda ateş eğilimindedir in in serebellar ltd26,27in in patlama modunda ateş eğilimindedir. Bu nedenle, PF'nin birden fazla aktivasyonu fizyolojik ateşleme paterni taklit etmek için tek bir PF stimülasyon daha iyi olurdu ve mGluR1 aktivasyonu PF ateşleme sayısı ve sıklığına bağlı38. Böylece, protokol-2, PKC'yi protokol-1'den daha yoğun bir şekilde etkinleştirir. Bazı mutasyona uğramış GluA2 knock-in farelerde (K882A), sadece protokol-2 protokol 132ile karşılaştırıldığında LTD ikna etmek için yeterli oldu , aktif PKC daha yüksek bir konsantrasyon bu özel GluA2 mutasyonu için LTD neden gerekli olduğunu düşündürmektedir.

PF'nin birden fazla stimülasyon uymuş LTD-indüksiyon insidansını artıracaktır, ancak CF stimülasyon veya somatik depolarizasyon yoluyla voltaj bağımlı Ca2+kanalının aktivasyonu hala gereklidir. PF'nin uyarıldığı PC dendit'teki voltaj bağımlı Ca2+kanalının aktivasyonunu artırmak için, PC'nin hücre gövdesi voltaj-kelepçe koşulları altında depolarize edildi30. Cs+tabanlı dahili çözelti kullanırken, giriş direnci belirgin bir şekilde artmıştır32, kablo sabitinde bir artış düşündüren. Sonuç olarak, PC dendrite distal alanında aktif Ca2 +-kanalların sayısı artacaktı. Bazı GluA2 mutant farelerde (Δ7), 2PF stimülasyon + somatik depolarizasyon (protokol 3) veya 5 PF stimülasyon + somatik depolarizasyon (protokol 4) LTD. Tersine, protokol 1 veya 2 stimülasyon ile hiçbir LTD fenomeni gözlenmedi. Cs+-iç çözeltiaktif voltaj bağımlı Ca2+kanalları ile voltaj-klemp koşulları altında somatik depolarizasyon, akım-kelepçe koşulları altında CF-stimülasyon tarafından aktivasyon daha etkili oluşur olabilir K+tabanlı dahili çözelti ile ve bu39 [Ca2 +]ve sonraki sağlam PKC-aktivasyon LTD için gerekli bir katkı dışı artışa neden olabilir.

Gen manipüle hayvanlarda LTD için olası telafi mekanizması

Teorik çalışma LTD indüksiyon40üzerine PKC bir all-or-none tip aktivasyonu varsayar, ancak GluA2 knock-in fareler gibi bazı gen manipüle hayvanlar kullanılarak deneysel sonuçlar PKC aktivasyonu LTD indüksiyon bağlı olarak çeşitli olduğunu göstermiştir protokoller32. 4 farklı protokol arasında PKC'yi aktive eden en etkili indüksiyon protokolü 3 ve 4 protokolleri, ardından protokol 2 ve en zayıf protokol 1 idi. Gen leğenli hayvanlarda, telafi edici mekanizmalar LTD32'yeneden olabilir. Bu tür telafi mekanizmaları aktif PKC'ye karşı daha düşük duyarlılığa sahip olabilir. Eğer öyleyse, pkc'yi geleneksel protokollerden daha güçlü etkinleştirebilen birden fazla LTD-indükleme protokolü kümesi, gene manipüle edilmiş hayvanlarda LTD indüksiyon yeteneğini değerlendirmek için gereklidir. Cs+tabanlı iç çözelti ile LTD normal indüksiyon dilim30kültürlü PCs15 veya pCs rapor olmasına rağmen, bir Cs+tabanlı iç solüsyon fizyolojik değildir. Ancak, uzak bir denditte voltaj bağımlı ca2+-kanalın aktivasyonu, dilimde somatik depolarizasyon kullanılarak zordur, çünkü hazırlama ve kayıt sırasında ki bu da uzunluk-sabit. Bu nedenle, PF uyarıcı dendritik bölgede Ca2+kanallarının aktivasyonunu sağlamak için Cs+-iç çözeltisi kullanarak uzunluk sabitini artıran bir protokol kullanmak gerekir.

Diğer deneysel koşullar

Sinyal iletim hızı sabitleri ve reseptör ticareti nedeniyle sinaptik plastisite ve hayvan davranışı hayvan yaşının eşleştirilmesi ve in vitro sıcaklık kayıt gibi paralel olarak incelendiğinde diğer faktörler de göz önünde bulundurulmalıdır. yüksek ısıya duyarlıdır. Aslında, in vivo motor öğrenme yüzey ampa tipi glutamat reseptörlerinin sayısını azalttı41 ve PF-PC sinaps42de asenkron mini-EPSC boyutu . İdeal olarak, tam hücreli yama kelepçesi kaydı 37 °C'de yapılmalıdır, ancak 37 °C'de istikrarlı uzun süreli kayıt zordur. Bu nedenle bu çalışmada yer alan tüm elektrofizyolojik kayıtlar yaklaşık 30 °C'de yapılmıştır. Bu sıcaklık fizyolojik sıcaklıktan daha düşük olmasına rağmen, in vitro analiz edilen sinaptik özellikleri davranışsal öğrenme yeteneği ile karşılaştırmak için daha uygun koşullar sağlayacaktır. Kayıt sıcaklıklarındaki bu fark, bu sonuçların önceki rapor26'danfarklı olması için başka bir faktör olabilir. Buna ek olarak, pasif membran özellikleri nin sürekliliğinin değerlendirilmesi32 ve içsel uyarılabilirlik43,44 sinaptik plastisite çalışmalarında da önemlidir.

Sonuç olarak, gen manipüle hayvanlarda sinaptik plastisite ve hayvan davranışı arasındaki nedensel ilişkiyi araştırmak için, in vitro sinaptik plastisite nin değerlendirilmesi, sıcaklık kullanımı gibi deneysel koşulların dikkatli bir şekilde kontrol edilmesini gerektirir. düzenleme ve protokoller çeşitli türleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

A. Oba'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Bilimsel Araştırma Hibe-in-Aid (C) 17K01982 k.y tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. The Cerebellum as a Neuronal Machine. , Springer. New York. (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

Tags

Nörobilim Sayı 152 Sinaptik plastisite LTD beyin dilimi tüm hücre kayıt fare Purkinje hücre beyincik paralel lif tırmanma fiber
Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of … More

Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter