Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59865
Automatic Translation
1
1Institute of Parasitology, McGill University

Summary

يركز هذا البروتوكول على تحديد البروتينات التي تربط فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات. ويستخدم الكروماتوغرافيا تقارب مع فوسفات الإينوزيتول biotinylated أو فوسفوينوسيتيدات التي يتم تعطيلها عن طريق streptavidin إلى أغاروز أو الخرز المغناطيسي. يتم تحديد فوسفات الإينوزيتول أو البروتينات الملزمة phosphoinositide عن طريق النشاف الغربية أو قياس الطيف الكتلي.

Abstract

ينظم فوسفات الإينوزيتول وفوسفينيوسيتيدس العديد من العمليات الخلوية في eukaryotes، بما في ذلك التعبير الجيني، والاتجار بين الحويصلات، ونقل الإشارة، والتمثيل الغذائي، والتنمية. هذه الأيض أداء هذا النشاط التنظيمي عن طريق ربط للبروتينات، وبالتالي تغيير المطابقة البروتين، والنشاط الحفاز، و / أو التفاعلات. الطريقة الموصوفة هنا تستخدم الكروماتوغرافيا تقارب إلى جانب قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربية لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات. يتم تمييز فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات كيميائيا مع البيوتين، الذي يتم التقاطه بعد ذلك عن طريق streptavidin مترافقمع مع أغاروز أو الخرز المغناطيسي. يتم عزل البروتينات من خلال تقاربها من ملزمة للالمستقلب، ثم تُقطَّع وتُحدَّد عن طريق قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربي. هذه الطريقة لديها سير عمل بسيط حساس، غير مشع، خاليمن الدهون، وقابل للتخصيص، ودعم تحليل تفاعل البروتين والمستقلب بدقة. ويمكن استخدام هذا النهج في أساليب قياس الطيف الكتلي الكمي التي تحمل علامة الأحماض الأمينية لتحديد تفاعلات البروتين المستقلب في العينات البيولوجية المعقدة أو باستخدام البروتينات النقية. تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل البروتينات من التريبانوسوما بروسي، ولكن يمكن تكييفه مع الطفيليات البروتوزوان ذات الصلة ، الخميرة أو خلايا الثدييات.

Introduction

الفوسفات الإينوزيتول (IPs) وفوسفوينوسيتيدات (PIs) تلعب دورا مركزيا في علم الأحياء eukaryote من خلال تنظيم العمليات الخلوية مثل السيطرة على التعبير الجيني1،2،3، الاتجار الحويصلة 4، إشارة transduction5،6، التمثيل الغذائي7،8،9، والتنمية8،10. الوظيفة التنظيمية لهذه الأيض ينتج عن قدرتها على التفاعل مع البروتينات وبالتالي تنظيم وظيفة البروتين. عند الربط بواسطة البروتينات، قد تغير التأثيرات الدولية وPIs مطابقة البروتين11، النشاط الحفاز12، أو التفاعلات13 وبالتالي تؤثر على وظيفة الخلوية. يتم توزيع الـ IPs وPIs في مقصوراتدون خلوية متعددة، مثل النواة 2،3،14،15،الشبكية الإندوبلازمية16،17، البلازما غشاء1 وسيتوسول18، إما المرتبطة البروتينات3،19 أو مع RNAs20.

يؤدي انشقاق PI المرتبط بالغشاء (4,5)P2 بواسطة phospholipase C إلى إطلاق Ins(1,4,5)P3، والتي يمكن أن تكون فوسفورية أو منزوعة الفوسفور بواسطة كيناز IP وفوسفاتاس، على التوالي. الـ IPs هي جزيئات قابلة للذوبان يمكن ربطها بالبروتينات وممارسة الوظائف التنظيمية. على سبيل المثال، Ins(1,4,5)P3 في ميتازوان يمكن أن تكون بمثابة رسول الثاني عن طريق ربط مستقبلات IP3، مما يحفز التغيرات المطابقة مستقبلات وبالتالي الإفراج عن Ca2+ من مخازن داخل الخلايا11. Ins(1,3,4,5)P4 يربط إلى مجمع deacetylase الهيستون وينظم تجميع البروتين معقدة والنشاط13. وتشمل الأمثلة الأخرى على الوظيفة التنظيمية IPs السيطرة على منظمة الكروماتين21،RNA النقل22،23،RNA التحرير24،والنسخ1،2،3 . وعلى النقيض من ذلك ، غالبا ما ترتبط مؤشرات ببس مع توظيف البروتينات إلى غشاء البلازما أو أغشية الجهازية25. ومع ذلك، فإن خاصية الناشئة من PIs هو القدرة علىربط مع البروتينات في بيئة غير membranous 3،15،19،26. هذا هو الحال بالنسبة للعامل الستيرويدوجينيك مستقبلات النووية، والتي يتم تنظيم وظيفة التحكم النسخي من قبل PI (3،4،5) P319، وبوليميراز بولي-A التي يتم تنظيم النشاط الأنزيمي من قبل PI النووية (4،5) P226. وقد تبين دور تنظيمي للإيبي وPIs في العديد من الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة22،27، خلايا الثدييات19،23، Drosophila10 والديدان28. من المهم دور هذه الأيض في التربانوسوم، التي تختلف في وقت مبكر من النسب eukaryotic. هذه الأيض تلعب دورا أساسيا في تريبانوسوما بروسي التحكم النسخي1,3, تطوير8, التكوين الحيوي العضوي وحركة البروتين29,30 , 31 , 32، وتشارك أيضا في السيطرة على التنمية والعدوى في مسببات الأمراض T. كروزي33،34،35،توكسوبلازما36 والبلازموديوم 5 , 37- ومن ثم، فإن فهم دور الملوثات العضوية المُسَوِّعين والـ "بي آي آي" في التربانوسوم قد يساعد على توضيح الوظيفة البيولوجية الجديدة لهذه الجزيئات وتحديد أهداف جديدة للمخدرات.

خصوصية البروتين والملكية الفكرية أو ربط PI يعتمد على مجالات تفاعل البروتين وحالة الفوسفور من الإينوزيتول13،38، على الرغم من أن التفاعلات مع الجزء الدهني من PIs يحدث أيضا19. توفر مجموعة متنوعة من الـ IPs وPIs وكيناز وتعديلها وفوسفاتاتآلية خلوية مرنة للتحكم في وظيفة البروتين التي تتأثر بتوافر المستقلب ووفرة، وحالة الفسفور من الإينوزيتول، والبروتين تقارب التفاعل1،3،13،38. على الرغم من أن بعض مجالات البروتين تتميز بشكل جيد39،40،41،على سبيل المثال، مجال الهومولوجيا pleckstrin42 وSPX (S YG1 / P ho81 /XPR1) مجالات43 ،44،45، بعض البروتينات تتفاعل مع IPs أو PIs بواسطة الآليات التي لا تزال غير معروفة. على سبيل المثال، البروتين المقمع المنشط 1 (RAP1) من T. بروسي يفتقر إلى المجالات الملزمة PI الكنسية ولكن يتفاعل مع PI (3,4,5)P3 والنسخ التحكم في الجينات المشاركة في الاختلاف المضادة للجينات3. الكروماتوغرافيا التقاربية وتحليل الطيف الكتلي للبروتينات المتفاعلة IP أو PI من الخلايا التربانوسومأو الخميرة أو الثدييات حددت العديد من البروتينات دون مجالات مُعرفة ببروتوكول IP أو PI8،46، 47. وتشير البيانات مجالات البروتين غير مميزة إضافية التي تربط هذه الأيض. وبالتالي، فإن تحديد البروتينات التي تتفاعل مع الملوثات العضوية المُسَوِّقة أو الـ "بي آي" قد يكشف عن آليات جديدة للتفاعل بين البروتين والمستقلب والوظائف التنظيمية الخلوية الجديدة لهذه الجزيئات الصغيرة.

تستخدم الطريقة الموضحة هنا الكروماتوغرافيا المتقاربة إلى جانب النشاف الغربي أو قياس الطيف الكتلي لتحديد البروتينات التي ترتبط بـ IPs أو PIs. ويستخدم الإيماء في الكائنات الحية أو PIs التي هي إما مرتبطة عبر streptavidin مترافقة مع حبات أغاروز أو بدلا من ذلك، التي تم التقاطها عن طريق الخرز المغناطيسي streptavidin المترافقة (الشكل1). توفر هذه الطريقة سير عمل بسيط حساس وغير مشع وخال ٍ من الدهون ومناسب للكشف عن ربط البروتينات من الليسات الخلوية أو البروتينات النقية3 (الشكل2). ويمكن استخدام هذه الطريقةفي 8أو46 أو إلى جانب قياس الطيف الكتلي الكمي المسمى بالأحماض الأمينية47 لتحديد البروتينات الملزمة للملكية الفكرية أو PI من العينات البيولوجية المعقدة. وبالتالي، فإن هذه الطريقة هي بديل للأساليب القليلة المتاحة لدراسة تفاعل النقاط التنفيذية أو مؤشرات ويب مع البروتينات الخلوية، وسوف تساعد في فهم الوظيفة التنظيمية لهذه الأيض في التربانوسوم وربما eukaryotes أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحليل البروتينات IP- أو PI ملزمة عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب والنشاف الغربية

  1. نمو الخلايا والخلايا والكروماتوغرافيا المتقاربة
    1. تنمو خلايا T. بروسي إلى مرحلة منتصف السجل ورصد صلاحية الخلية وكثافتها. يكفي ما مجموعه 5.0 × 107 خلايا لفاكس واحد ملزم.
      1. لأشكال مجرى الدم، تنمو الخلايا في وسائل الإعلام HMI-9 تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. الحفاظ على كثافة الخلية بين 8.0 × 105 إلى 1.6 × 106 خلايا / مل.
        ملاحظة: قد تؤثر الكثافة أعلى من 1.8 × 106 خلايا/مل على قدرة الخلية على البقاء. مضاعفة الوقت من T. بروسي 427 سلالة نمت في المختبر بين 5.5 و 6.5 ساعة.
      2. بالنسبة للأشكال البروجسية، تنمو الخلايا في SDM-79 المتوسطة مع 10٪ FBS في 27 درجة مئوية والحفاظ على كثافة الخلايا بين 1.0 × 107 و 3.0 × 107 خلايا / مل.
      3. بالنسبة للبروتينات النقية (على سبيل المثال، البروتينات المؤتلفة)، خذ 0.5 إلى 1 ميكروغرام من البروتين وتمييعفي في 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم (25 مليون متر من حمض الهيدروكلوريك، 150 مل كلوريد الفينيل، 0.2٪ 4-nonyl-البولي ايثيلين غليكول، pH 7.4). احتفظ بـ 5% من البروتين المخفف (الإدخال) لتحليل اللطخة الغربية. انتقل إلى الخطوة 1-1-7.
    2. خلايا الطرد المركزي في 1600 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تجاهل الـ supernatant.
      ملاحظة: راجع الخطوة 2.1.2 للحصول على معلومات إضافية حول الطرد المركزي لأحجام الثقافة الكبيرة.
    3. بلطف إعادة تعليق بيليه في 10 مل من الفوسفات المخزنة المالحة درجة الحموضة 7.4 تستكمل مع الجلوكوز 6 MM (PBS-G) وتسخينها مسبقا في 37 درجة مئوية لغسل الخلايا. ثم، الطرد المركزي الخلايا في 1600 × ز لمدة 5 دقائق في RT. كرر الإجراء مرتين.
    4. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من PBS-G. ثم، نقل حجم إلى أنبوب 1.5 مل والطرد المركزي في 1600 × ز لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: الكريات الخلية يمكن فلاش المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل.
    5. إعادة تعليق بيليه في 0.5 مل من اللليس العازلة (25 مل HEPES، 150 مل NaCl، 1٪ تي أوكتيلفينوكسيبوليميثيثانول، درجة الحموضة 7.4)تستكمل مع 1.5X كوكتيل مثبطات البروتياز و1X كوكتيل مثبطات الفوسفاتتاز (جدول المواد) قبل المبردة في الجليد إلى الجليد lyse الخلايا. حضانة lysate لمدة 10 دقيقة الدورية في 50 دورة في الدقيقة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه خطوة هامة لأن البروتينات يمكن أن تتحلل إذا لم يتم معالجتها كما هو موضح. تحقق من سلامة lysate البروتين من قبل كبريتات الصوديوم دوديسيل-بولياكريلاميد جل الكهربائي (SDS / PAGE) إذا لزم الأمر.
      تحذير: T-octylphenoxypolyethoxyethanol سامة ويمكن أن يسبب تهيج الجلد والعين. استخدام القفازات، وواقي العين وحماية واقية من الوجه.
    6. الطرد المركزي lysate في 14،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. جمع supernatant في أنبوب جديد 1.5 مل لتجارب ملزمة. الحفاظ على 5٪ من مجموع lysate (المدخلات) لتحليل النشاف الغربية. يحتوي الـ supernatant على بروتينات طفيلية مستخرجة مع مخزن الليسات الاحتياطي.
    7. جمع 50 ميكرولتر من الـ IPs أو PIs المترافقة مع حبات الأجاروز (أي 50 ميكرولتر من الطين) أو 50 ميكرولتر من حبات الأجاروز، والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1000 × ز. تخلص من التراكب واعيد تعليقه في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم لمعادلة الخرز. استخدام الخرز غير المترافق كعنصر تحكم. استخدام IP / PI-الخرز مع تكوين الفوسفات مختلفة بما في ذلك أشكال غير فوسفورية للسيطرة على التفاعلات غير محددة.
    8. إضافة 50 ميكرولتر من IP- أو PI-الخرز إلى الخلية lysate أو البروتينات النقية (كل 1 مل من الخرز يحتوي على 10 نمول من Ipps المترافقة أو PIs). الحفاظ على حجم IP- أو PI-الخرز ضمن 10٪ من lysate مجموع وإذا لزم الأمر، وضبط حجم رد فعل ملزم مع العازلة ملزمة.
      1. وفيما يتعلق بتجارب المنافسة، تضاف إلى ردود الفعل الملزمة تركيزات مختلفة من النقاط ipات أو مؤشرات الأداء غير المترافقة (على سبيل المثال، 1-، 10-، 100 أضعاف الفائض المولي مقارنة بالخرز IP- أو PI).
    9. احتضان رد الفعل لمدة 1 ساعة، أو بين عشية وضحاها، في 4 درجة مئوية والدورية في 50 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: يمكن أن يتم ردود الفعل ملزمة مع البروتينات النقية في RT اعتمادا على استقرار البروتين. وإذا كان استخدام الملوثات المتّصية أو PIs المترافقة مع البيوتين لا يؤدي إلا إلى الخطوة 1-1-9-1، فانتقل إلى الخطوة 1-1-10.
      1. إضافة 50 درجة مئوية من streptavidin-المترافقة إلى الخرز المغناطيسي إلى رد فعل ملزم وحضانة لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية الدورية في 50 دورة في الدقيقة.
    10. الطرد المركزي المزيج لمدة دقيقة واحدة في 1000 × ز في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant (تدفق من خلال) والحفاظ على بيليه. احتفظ بـ 5% من الـ"سوبرناينت" لتحليل اللطخة الغربية.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم الخرز المغناطيسي، قم بإزالة المواد الخارقة وتنفيذ عمليات الشهاد اللاحقة باستخدام حامل مغناطيسي (الطرد المركزي ليست ضرورية).
    11. إضافة 1 مل من العازلة الغسيل (25 M HEPES، 300 مل كلوريد الفينيل، 0.2٪ 4-nonyl فينيل البولي ايثيلين غليكول، درجة الحموضة 7.4) وإعادة تعليق الراتنج عن طريق التنصت أو دوامة الأنبوب (لا تستخدم ماصة لأن الخرز يمكن أن نعلق على نصائح ماصة). طرد مركزي رد الفعل لمدة دقيقة واحدة في 1000 × ز في 4 درجة مئوية وتجاهل supernatant. كرر الإجراء لما مجموعه خمسة عمليات النفاية.
      تحذير: 4-nonyl فينيل البولي ايثيلين غليكول سامة ويمكن أن يسبب تهيج الجلد والعين. استخدام القفازات، وواقي العين وحماية واقية من الوجه.
    12. إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli العازلة تستكمل مع 710 مل 2-mercaptoethanol إلى الخرز ومزيج عن طريق التنصت أو دوامة لelute البروتينات. الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم الطرد المركزي لمدة 10،000 × ز لمدة 1 دقيقة وجمع supernatant (تحتوي على البروتينات المنسوب). بدلا من ذلك، البروتينات elute مع 8 M اليوريا / 100 مل غليسين الحموضة 2.9 لتجنب استخدام SDS. تجميد eluate في -80 درجة مئوية، وإلا المضي قدما في تحليل وصمة عار الغربية.
      تحذير: 2-mercaptoethanol سامة ويمكن أن يسبب تهيج الجلد والعين والجهاز التنفسي. استخدام القفازات والعمل في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
  2. تحليل النشاف الغربي
    1. امزج 15 ميكرو لتر من الإدخال (من الخطوة 1.1.6) أو من خلال التدفق (من الخطوة 1.1.10) عينات مع 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت Laemmli 4x. مدخلات الحرارة وتدفق من خلال عينات لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية. بالنسبة للعينات التي يتم تناولها في 8 M urea/100 mM الجلايسين درجة الحموضة 2.9، مزيج 15 ميكرولتر من eluate مع 5 ميكرولتر من 4X Laemmli العازلة، والحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية للعينات eluted في المخزن المؤقت Laemmli 2x.
    2. تحميل الآبار من 4-20٪ SDS / PAGE هلام مع 2.5 ميكرولتر من المدخلات، 2.5 ميكرولتر من خلال التدفق، و 20 ميكرولتر من العينات eluted، وتحميل سلم البروتين وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
      ملاحظة: اختيار هلام٪ وفقا للوزن الجزيئي للبروتين من الفائدة.
    3. تشغيل SDS/PAGE في 150 V لمدة 30-45 دقيقة في تشغيل المخزن المؤقت، أو حتى الصبغة الزرقاء من المخزن المؤقت Laemmli في نهاية الجل.
      ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل وفقًا لمعدات المختبر.
    4. إزالة هلام من الزجاج (أو البلاستيك) لوحات، ونقع في العازلة نقل لمدة 15 دقيقة.
    5. نقل البروتينات إلى غشاء ثنائي الفينيل الدين (PVDF) أو غشاء النيتروسيلولوز. نقع الأغشية وورقة فلتر 3 مم في المخزن المؤقت للنقل. تجميع شطيرة مع ثلاث أوراق من ورقة فلتر، نيتروسيلولوز أو غشاء PVDF، هلام، وثلاث أوراق إضافية من ورقة التصفية. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين في شطيرة. استخدام الأسطوانة لإزالة فقاعات إذا لزم الأمر. تعيين الغشاء على الكاثود والجل على الجانب الأنود من كاسيت.
      ملاحظة: تحقق من تعليمات الشركة المصنعة للغشاء للحصول على معلومات حول تنشيط الغشاء أو إعداد وصمة عار.
    6. ضع الدرج الذي يحتوي على الساندويتش في خزان النقل مع مخزن مؤقت للنقل. ضع الخزان في دلو ثلج أو عند درجة حرارة 4 درجة مئوية (على سبيل المثال، في الغرفة الباردة). نقل البروتينات في 100 V لمدة 1 ساعة (الحالية تتراوح بين 200-400 مالا). بدلا من ذلك، نقل بين عشية وضحاها في تيار ثابت من 15 مأ عند 4 درجة مئوية.
    7. إزالة الغشاء من الكاسيت. احتضان الغشاء في 6٪ الحليب الجاف غير الدهون المخففة في PBS مع 0.05٪ من بوليسوربات 20 (PBS-T)، أو متوافقة حل حجب، لمدة 1 ساعة في RT لمنع الغشاء.
      ملاحظة: قبل حجب الغشاء، يمكن التحقق من جودة نقل باستخدام وصمة عار بونساو S. احتضان الغشاء لمدة دقيقة واحدة في 15 مل من Ponceau S، شطف في الماء وتصور العصابات.
    8. إزالة محلول حظر واحتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في RT مع دوران 50 دورة في الدقيقة في الأجسام المضادة الأولية المخففة في 6٪ الحليب الجاف غير الدهون المخففة في PBS-T. بدلا من ذلك، احتضان غشاء بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع دوران 50 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة وفقا لنوعية الأجسام المضادة؛ ومع ذلك، فإن معظم الأجسام المضادة تعمل مع الحضانة من 1-3 ح في RT. اتبع توصية الشركة المصنعة لتركيز الأجسام المضادة أو التخفيف.
    9. غسل وصمة عار عن طريق احتضان الغشاء في PBS-T لمدة 5 دقائق مع دوران 50 دورة في الدقيقة في RT. كرر الإجراء 3-5 مرات. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الغسل اعتمادا على نوعية الأجسام المضادة.
    10. احتضان الغشاء في peroxidase الفجل (HRP) - المترافق الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في RT في 6٪ الحليب الجاف غير الدهون المخففة في PBS-T مع دوران 50 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: اتبع توصية الشركة المصنعة لتركيز الأجسام المضادة أو التخفيف.
    11. اغسل اللطخة كما هو موضح في الخطوة 1.2.9.
    12. إضافة الركيزة chemiluminescent لتغطية الغشاء. إزالة الزائدة من الركيزة وحضانة لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
      ملاحظة: تحقق من إرشادات الشركة المصنعة للحصول على توصيات حول الكواشف chemiluminescence.
    13. التقط الإشارة الكيميائية باستخدام صورة تستند إلى الكاميرا. بدلا من ذلك، استخدم فيلم الأشعة السينية لالتقاط إشارة chemiluminescent.

2- تحليل البروتينات الملزمة ببروتوكول الملكية الفكرية/PI بواسطة الكروماتوغرافيا المتقاربة والقياس الطيفي الكتلي

  1. نمو الخلايا والخلايا والكروماتوغرافيا المتقاربة
    1. تنمو خلايا T. بروسي إلى مرحلة منتصف السجل ورصد صلاحية الخلية وكثافتها.
      ملاحظة: ما مجموعه 1.0 × 1010 خلايا كافية لاثنين من الاختبارات ملزمة. استخدام خلايا أقل مما هو مبين هنا قد يؤثر على الكشف عن البروتينات وفرة منخفضة عن طريق قياس الطيف الكتلي.
      1. لأشكال مجرى الدم T. بروسي, تنمو الخلايا في مرحلة منتصف السجل (8.0 × 105-1.6 × 106 خلايا / مل) في وسائل الإعلام HMI-9 تستكمل مع 10% FBS في 37 درجة مئوية ومع 5% CO2. لسلالة 427، 5 L من الثقافة سوف تسفر عن 0.5-1.0 × 1010 الخلايا. مراقبة نمو الخلية لتجنب كثافة أعلى من 1.8 × 106 خلايا / مل التي قد تؤثر على قدرة الخلية على البقاء. الحفاظ على حجم ثقافة الخلية إلى 1/10 من حجم قارورة؛ وإلا، فإن معدل نمو الخلايا سوف تتأثر بسبب ضعف التاءير.
        ملاحظة: سلالة 427 لديه وقت مضاعفة من 5.5-6.5 ساعة.
      2. بالنسبة للأشكال البروجسية، تنمو الخلايا في SDM-79 المتوسطة مع 10٪ FBS في 27 درجة مئوية والحفاظ على كثافة الخلايا بين 1.0 × 107 و 3.0 × 107 خلايا / مل. 500 مل من الثقافة سوف تسفر عن 0.5-1.5 × 1010 الخلايا.
    2. طرد مركزي الخلايا في 1600 × ز لمدة 15 دقيقة في RT. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في 200 مل من PBS-G ساخنة مسبقا في 37 درجة مئوية. استخدام أنابيب الطرد المركزي أسفلجولة (جدول المواد) لأن T. بروسي شكل الكريات يتم إزعاج بسهولة عند استخدام الدوارات الطرد المركزي ذات الزاوية الثابتة. طرد مركزي الخلايا مرة أخرى في 1600 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    3. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 10 مل من PBS-G. طرد مركزي الخلايا في 1600 × ز لمدة 5 دقائق في RT. كرر الإجراء وبعد الغسيل النهائي، وتجاهل supernatant.
      ملاحظة: قد تكون الكريات فلاش المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل.
    4. إعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل من الليسات العازلة قبل المبردة في الجليد وتستكمل مع 1.5X كوكتيل مثبطات البروتياز و1X كوكتيل مثبطات الفوسفاتيز (جدولالمواد). احتضان lysate لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية الدورية في 50 دورة في الدقيقة.
    5. الطرد المركزي lysate في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. جمع supernatant (البروتينات الذوبان) وتخفيفه في 20 مل من العازلة ملزمة.
    6. جمع 400 ميكرولتر من النقاط الايكونالأوبية أو PIs المترافقة مع حبات الأجاروز (أي 400 ميكرولتر من الطين) أو 400 ميكرولتر من حبات التحكم، والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 1000 × ز في RT. تجاهل supernatant وإعادة تعليق في 400 ميكرولتر من العازلة ملزمة لمعادلة الخرز. استخدام حبات أغاروز كسيطرة سلبية لتحديد إثراء معين من تفاعلات البروتين المستقلب مقارنة مع التفاعلات غير محددة (على سبيل المثال، البروتينات التي تربط غير محددة إلى الخرز). استخدام الملوثات العضوية بها أو PIs مع تكوينات الفوسفات المختلفة بما في ذلك الأشكال غير الفوسفورية للسيطرة على التفاعلات غير المحددة بسبب رسوم الفوسفات أو ملزمة لالبيوتين.
    7. إضافة 400 درجة مئوية من IP / PI-الخرز أو حبات التحكم إلى 10 مل من lysate وحضانة لمدة 1 ساعة، أو بين عشية وضحاها، في 4 درجة مئوية الدورية في 50 دورة في الدقيقة. وإذا استمر استخدام الملوثات التي تكون مزودة بعلامات iPs أو PIs المترافقة مع البيوتين فقط (بدون حبات) في الخطوة 2-1-7-1، انتقل إلى الخطوة 2-1-8.
      1. إضافة 100 درجة مئوية من streptavidin-المترافقة إلى الخرز المغناطيسي وحضانة لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية الدورية في 50 دورة في الدقيقة.
    8. طرد مركزي رد فعل ملزم لمدة دقيقة واحدة في 1000 × ز عند 4 درجة مئوية. إزالة supernatant (تدفق من خلال) والحفاظ على بيليه. احتفظ بـ 5% من الـ"سوبرناينت" لتحليل اللطخة الغربية.
    9. إضافة 5 مل من العازلة الغسيل إلى بيليه، مزيج بلطف عن طريق دوامة الأنبوب، ومن ثم الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 1000 × ز في 4 درجة مئوية. تجاهل الـ supernatant. كرر الغسيل خمس مرات. إذا كنت تستخدم الخرز المغناطيسي، وجمع supernatants وأداء الششد باستخدام موقف المغناطيسي (الطرد المركزي ليست ضرورية).
    10. إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli العازلة (أو 8 M اليوريا / 100 مل غليسين درجة الحموضة 2.9، لتجنب استخدام SDS) إلى الخرز ومزيج عن طريق التنصت أو دوامة (تجنب الأنابيب لأن الخرز يمكن أن نعلق على نصائح ماصة)، ومن ثم الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وجمع supernatant (البروتينات eluted). كرر الإجراء مرتين لجمع ما مجموعه ثلاثة كسور.
    11. تجميد eluate في -80 درجة مئوية، وإلا البروتينات منفصلة في SDS / PAGE أو الاحتفاظ في حل للtrypsinization وتحليل الطيف الكتلي.
  2. هضم التربسين للبروتينات لقياس الطيف الكتلي
    ملاحظة: يظهر اختلافان من هذا الإجراء للقسم 2-2-1 (بالهلام) أو القسم 2-2-2 (في الحل) من هضم البروتينات. ينصح أنابيب البروتين منخفضة ملزمة لمنع فقدان العينة. التشاور مع كيميائي تحليلي في مرفق البروتيوميات ملاءمة البروتوكول للعينات وأدوات مطياف الكتلة المتاحة.
    1. في هلام التربسيين من البروتينات
      1. بعد فصل البروتين في SDS / PAGE، شطف لفترة وجيزة هلام في المياه عالية النقاء. نقل الجل على لوحة زجاجية نظيفة. أشرطة البروتين المكوس مع شفرة نظيفة وتجنب قطع هلام اضافية خارج العصابات. قطع قطع هلام إلى قطع صغيرة (أي، ما يقرب من 1 ملم مربع) ونقلها إلى أنبوب 1 مل. استخدم طرف ماصة إذا لزم الأمر، ولكن تأكد من شطف طرف الماصة في الإيثانول قبل الاستخدام.
        ملاحظة: استخدام القفازات لتجنب التلوث هلام. يمكن تخزين قطع هلام في -20 درجة مئوية.
      2. إضافة 100 درجة مئوية من عالية النقاء أو عالية الأداء السائل الكروماتوغرافيا الصف المياه إلى أنابيب لشطف قطع هلام. تخلص من الماء
        1. لكوماسي أو الروثينيوم القائم على قطع هلام الفلورسنت الملون، واحتضان قطع هلام في حل destaining (25 mM NH4HCO3 في 50٪ acetonitrile) لمدة ساعة، ثم تجاهل الحل. كرر الإجراء حتى لا يكون تلطيخ مرئي.
          ملاحظة: إعداد الحلول التي تحتوي على NH4HCO3 عن طريق التخفيف من محلول الأسهم في 100 m NH4HCO3،والحموضة 7.8.
          تحذير: Acetonitrile هو مذيب متطاير، قابل للاشتعال وسامة. NH4HCO3 يمكن أن يسبب تهيج الجلد أو العين. استخدام القفازات والعمل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
        2. لقطع الجل الملون الفضي، قطع جل الحضانة في 50 ميكرولتر من محلول إزالة البقع للبقع الفضية (15 mM K3[Fe(CN) 6]، 50 mM Na2S2O3)في الماء لمدة 30 دقيقة. من الماء. كرر غسل خمس مرات أو حتى هلام اللون الأصفر غير مرئية.
          تحذير: K3[Fe(CN)6] قد يسبب تهيج الجلد أو العين. استخدام القفازات.
      3. تجفيف قطع هلام باستخدام 200 ميكرولتر من الأسيتونيتريل لمدة 10 دقيقة في RT. ثم تجاهل الحل.
        ملاحظة: قطع هلام المجففة هي أصغر في الحجم، مبهمة، ومبتذل. إذا تم الجمع بين عدة قطع من هلام في أنبوب واحد، كرر الإجراء لكفاءة الجفاف من قطع هلام.
      4. إضافة 50 درجة مئوية (أو حجم كاف لتغطية قطع هلام) من الحد من الحل (10 mdithiothreitol [DTT] في 100 mM NH4HCO3)وحضانة في 56 درجة مئوية لمدة 1 ح. بعد ذلك، تبريد الأنابيب إلى RT وتجاهل الزائدة من الحد من الحل.
      5. إضافة 50 درجة مئوية (أو ما يكفي من حجم لتغطية قطع هلام) من محلول الألكيلية (50 مل يودواسيتاميد في 100 mM NH4HCO3)واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. بعد ذلك، تجاهل الزائدة من محلول الألكيلية.
      6. تجفيف قطع هلام مع 200 درجة مئوية من acetonitrile لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة acetonitrile وترطيب قطع هلام مع 100 mM NH4HCO3 لمدة 10 دقيقة في RT.
      7. تجفيف قطع هلام مرة أخرى مع 200 درجة مئوية من acetonitrile لمدة 10 دقيقة في RT وتجاهل الزائدة من الحل.
      8. إضافة 15 ميكرولتر من قياس الطيف الكتلي الصف التربسين المخفف في 50 mM NH4HCO3 العازلة، أو حجم ما يكفي لتغطية قطع هلام رطب وحضانة لمدة 4 ساعة، أو بين عشية وضحاها، في 37 درجة مئوية. الحفاظ على إجمالي كميات التربسين بين 100 إلى 500 نانوغرام (أو 20 نانوغرام تريبسين / ميكروغرام من البروتين).
      9. تبريد العينة إلى RT، والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 2000 × ز في جهاز طرد مركزي دقيق. إضافة 10-20 درجة مئوية من حمض الفورميك 5٪ المخففة في الماء والحضانة لمدة 10 دقيقة في RT.
        تحذير: حمض الفورميك قابل للاشتعال والتآكل والسامة. استخدام القفازات والعمل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
      10. الطرد المركزي كما هو مبين في الخطوة 2.2.1.9، ثم جمع supernatant (تحتوي على الببتيدات المستخرجة) إلى أنبوب مختلف. إضافة 20 ميكرولتر من 5٪ حمض الفورميك المخفف في 50-60٪ acetonitrile إلى الأنبوب وحضانة لمدة 10 دقيقة في RT. جمع الكسور الببتيد المستخرجة في نفس الأنبوب.
      11. تجفيف العينة في المكثف فراغ وإعادة تشكيل في 10 ميكرولتر من حمض الخليك 0.5٪ و 2٪ acetonitrile لتحليل الطيف الكتلي. الطرد المركزي وجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب؛ تخزين الحل في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
    2. في حل التجرب من البروتينات
      1. يعجل البروتينات للحد من حجم العينة، وإزالة الأملاح، وتبادل العازلة. إضافة ستة مجلدات من الأسيتون المبردة (-20 درجة مئوية) إلى العينة، على سبيل المثال، 600 ميكرولتر من الأسيتون إلى 100 ميكرولتر من العينة. دوامة وحضانة في -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة. الحل سوف تتحول غائمة أو تشكل عجل.
        تحذير: الأسيتون سام وقابل للاشتعال. استخدام القفازات والعمل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
      2. عينات الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة Decant الأسيتون والهواء الجاف بيليه لمدة 15 دقيقة.
      3. إضافة 10 ميكرولتر من 6-8 M اليوريا أو 1٪ SDS في 50 M NH4HCO3 لإذابة بيليه ودوامة لخلط. لكميات أكبر من البروتينات (> 10 ميكروغرام)، استخدم ما يصل إلى 20 ميكرولتر من الانحلال الاحتياطي.
      4. إضافة 5 ميكرولتر من الحد من الحل ودوامة. قم بتدوير مستوى الصوت باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. إذا تم تخفيف العينات في اليوريا، ثم حضانة لمدة 1 ساعة في RT. إذا تم تخفيف العينات في SDS، ثم احتضن لمدة 1 ساعة عند 56 درجة مئوية.
      5. قم بتدوير مستوى الصوت باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. إضافة 3 ميكرولتر من محلول الألكلة والدوامة. ثم، تدور وحدة التخزين إلى أسفل وحضانة في الظلام لمدة 30 دقيقة في RT.
      6. إضافة 3 ميكرولتر من الحد من الحل لتحييد رد الفعل. تخفيف ببطء العينة إلى 1 M اليوريا أو 0.05٪ SDS باستخدام 50 M NH4HCO3.
        ملاحظة: يجب أن يكون التربسين التخزين المؤقت الهضم المنظفات أو denaturant. حدود التركيز للمزيلات هي: 0.05٪ SDS; 0.1٪ أوتيل B-D-غلوكوكورانوسيد؛ 0.1٪ 4-nonylphenyl-البولي ايثيلين غليكول؛ 0.1٪ تي أوكتيلفينوكسيبوليثوكسيثانول؛ 0.1٪ بوليسوربات 20؛ 0.1% 3-[(3-تشولاميدوبروبيل) ثنائي ميثيل الأمونيو]-1-بروبانسولفونات؛ < 1 M اليوريا أو الثيويوريا.
      7. إضافة 5 ميكرولتر من قياس الطيف الكتلي الصف التربسين المخفف في 50 mM NH4HCO3 العازلة وحضانة لمدة 4 ساعة، أو بين عشية وضحاها، في 37 درجة مئوية. الحفاظ على إجمالي كميات التربسين بين 100 و 500 نانوغرام (أو 20 نانوغرام تريبسين / ميكروغرام من البروتين).
      8. تبريد العينة إلى RT، وتدور خفض مستوى الصوت باستخدام جهاز طرد مركزي. إضافة 5٪ حمض الخليك (أو 5٪ حمض الفورميك في 50٪ أسيتوتريل) لإرواء رد الفعل.
      9. تجفيف العينات في مكثف فراغ كما هو مبين في الخطوة 2.2.1.11. تخزين العينات في -80 درجة مئوية. إزالة الملح والتركيز الببتيدات باستخدام عمود المرحلة العكسية مثل C18 الرمز البريدي طرف ثم تحليل هافسي الكتلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحليل RAP1 و PI(3,4,5)P3 التفاعل بواسطة الكروماتوغرافيا التقارب ية والنشاف الغربي
يوضح هذا المثال تطبيق هذا الأسلوب لتحليل ربط PIs بواسطة RAP1 من T. بروسي lysate أو عن طريق البروتين T. brucei RAP1 المؤتلف T. brucei. Lysates من T. بروسي أشكال مجرى الدم التي تعبر عن الهيماغلوتينين (HA) الموسومة RAP1 استخدمت في الاختبارات ملزمة. RAP1 هو بروتين تشارك في السيطرة النسخية من مختلف الجينات البروتين السكري السطحي (VSG)3،48، والتي ترميز للبروتينات السطحية المشاركة في التهرب المناعي الطفيلي عن طريق الاختلاف المضادة للجينات49. RAP1 يتفاعل داخل مجمع البروتين التيلوميريك مع فوسفاتيديلينوسيتيول 5-فوسفاتيز (PIP5Pase) إنزيم3، والذي يعمل أيضا في السيطرة على نسخ الجينات VSG1،3. RAP1 لديه N-الطرفية سرطان الثدي 1 carboxyl الطرفية (BRCT) المجال الذي يتبعه مجال myeloblastosis (myb) الحمض النووي ملزمة وC-محطة myb مثل المجال3،48. ومع ذلك، فإنه يفتقر إلى مجالات ربط PI الكنسية. تم إجراء الاختبارات الملزمة مع PIs التي هي غير فوسفورية أو فوسفورية في مواقع مختلفة من حلقة الإينوزيتول، ومع حبات أغاروز غير مترافقة. ويبين التحليل الغربي أن RAP1 يربط بشكل تفضيلي إلى PI (3,4,5)P3-الخرز (الشكل3A)، ولكنه يربط أيضا إلى حد أقل إلى PI (4,5) P2-الخرز. ومع ذلك، فإنه لا يرتبط أي PIs أخرى أو الخرز agarose. لأن RAP1 هو جزء من مجمع متعدد البروتين3، قد لا يكون تفاعله مع بعض PIs مباشراً وبالتالي ينتج عن تفاعل RAP1-HA مع البروتينات الخلوية الأخرى التي تربط بـ PIs.

وبالتالي، لاختبار ما إذا كان RAP1 يربط مباشرة إلى PIs، تم التعبير عن C-terminalagged 6X-له المؤتلف RAP1 (rRAP1) البروتين وتنقية إلى التجانس من E. القولونية3. تم استخدام البروتين في الاختبارات الملزمة مع PI (3,4,5) P3-الخرز في وجود تركيزات المتنافسة من PI (3,4,5)P3 أو PI (4,5)P2. النشاف الغربية تبين أن زيادة تركيزات PI (3,4,5)P3، ولكن ليس PI (4,5)P2 يمنع تفاعل rRAP1 مع PI (3,4,5)P3 (الشكل3B). وعلاوة على ذلك، فإن إضافة T. بروسي تنقية PIP5Pase الإنزيم إلى رد فعل استعادة PI (3,4,5)P3-binding بواسطة rRAP1، والذي يرجع إلى PIP5Pase إزالة الفوسفور من PI الحرة (3,4,5)P33 وبالتالي يشير إلى أن نمط الفوسفور من هذا المستقلب ضروري لربط rRAP1. وبالتالي، rRAP1 يتفاعل مع PI (3,4,5)P3 كما يفعل RAP1-HA من T. بروسي lysates. وعلاوة على ذلك، تظهر البيانات أن ربط RAP1-HA من lysate إلى PI(4,5)P2 من المرجح أن ينتج عن تفاعل RAP1 مع البروتينات الأخرى في المجمع (على سبيل المثال، PIP5Pase)3. وتوضح البيانات تكامل الاختبارات الملزمة مع الليسات الخلوية والبروتينات المؤتلفة. كما أنه يبين فائدة الاختبارات الملزمة التنافسية لتحديد خصوصية التفاعلات بين البروتينات وPIs.

تحديد البروتينات الملزمة P3 (1,4,5) P3 بواسطة الكروماتوغرافيا المتقاربة والقياس الطيفي الكتلي
في هذا المثال، تم استخدام الكروماتوغرافيا المتقاربة التي يتبعها قياس الطيف الكتلي لتحديد بروتينات T. بروسي التي تربط Ins(1,4,5)P3; لذلك، فإن التجربة الدراسات الاستقصائية المحتملة Ins (1,4,5)P3 البروتينات ملزمة من أشكال مجرى الدم T. بروسي. تم احتضان T. بروسي ليسات مع Ins(1,4,5)P3 مترافقمع مع حبات أجاروز أو مع الخرز غير المترافق (تستخدم كقاعدة)، وكانت البروتينات ملزمة مع العازلة عينة Laemmli. يظهر تحليل SDS/PAGE الإثراء في البروتينات من Ins(1,4,5)P3-beads مقارنة بالبروتينات التي تُنتَج من حبات أغاروز الخاضعة للمراقبة (الشكل4A). حدد تحليل قياس الطيف الكتلي للبروتينات المنهوبة أكثر من 250 بروتينًا، منها 84 بروتينًا تم إثراؤها باستخدام الخرز Ins(1,4,5) P3 مقارنة ً بحبات التحكم (الشكل4B،تغيير الطي [FC] ≥ 2, p < 0.05). يرتبط إثراء البروتينات المرتبطة بـ Ins(1,4,5)P3 مقارنة بحبات التحكم بإشارة البروتين التي تم اكتشافها بواسطة SDS/PAGE. وتشمل البيانات البروتينات التي تم التحقق من صحتها لربط Ins(1,4,5)P3 والبروتينات التي آليات ملزمة لIns(1,4,5)P3 غير معروف8. وعلاوة على ذلك، فإن Ins(1,4,5)P3 البروتيوم ملزمة تختلف اختلافا كبيرا عن ذلك من Ins (1,3,4,5)P4 وغيرها من PIs8, مما يشير إلى أن بعض هذه البروتينات تعترف تكوين الفوسفات محددة من Ins (1,4,5)P3. وبالتالي، يمكن استخدام الـ Ins(1,4,5)P3 ذات العلامات الحية (1,4,5) P3 للكروماتوغرافيا المتقاربة المقترنة بالقياس الطيفي الكتلي لتحديد البروتينات التي تربط Ins(1,4,5)P3. ويمكن استكشاف هذا النهج لتحديد البروتينات التي ترتبط بالأجهزة الإيبيبالية الأخرى أو PIs3و8و46و47.

Figure 1
الشكل 1 الكواشف التقاربية للتجارب الملزمة. (أ) PI (3,4,5)P3 (أعلى) وIns (1,4,5)P3 (أسفل) مترافقة إلى البيوتين في موقف sn1 من الإينوزيتول. في PI (3,4,5)P3، يتم ربط البيوتين بسلسلة الدهون في موقف sn1 من الإينوزيتول، في حين أن في Ins(1,4,5)P3 يتم تترافق البيوتين إلى الفوسفات في موقف sn1. (ب) Ins(1,4,5) P3 هو مترافق مع البيوتين ويتم التقاطها عن طريق ملزمة إلى streptavidin مترافقة مع الخرز (على سبيل المثال، أغاروز أو الخرز المغناطيسي). الاختلافات من هذه الكواشف باستخدام الوصلات توليفها مخصصة التي تحل محل البيوتين ممكن أيضا46. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 يصف سير عمل البروتوكولات خطوات تحليل تفاعل تقارب IP أو PI مع بروتينات T. brucei والكشف عن طريق (A) النشاف الغربي أو (B) قياس الطيف الكتلي. AC-WB، والكروماتوغرافيا تقارب والنشاف الغربية؛ AC-MS، والكروماتوغرافيا تقارب والقياس الطيفي الكتلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 ربط T. بروسي RAP1 إلى فوسفيينوسيتيدات. (أ) تم احتضان الليسات من T. بروسي (5.0 × 107 طفيليات) التي تعبر عن HA الموسومة RAP1 لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية مع 50 ميكرولتر من مؤشر يب (كل 1 مل من حبات الأجروز التي تحتوي على 10 نمول من PIs المترافقة) أو الخرز أغاروز (Ag). تم غسل رد الفعل الملزم وملعّفه مع 2 × Laemmli عينة العازلة وتسخينها في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم فصل البروتينات في 4-20٪ SDS /PAGE، ونقلها إلى غشاء PVDF، وبحثت مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لها (1:5000، المخففة في 6٪ PBS-الحليب) تليها بواسطة المضادة للماوس IgG-HRP (1:5,000, المخففة في 6% PBS-الحليب), وكشف من قبل chemiluminescence. (B) تم احتضان ميكروغرام واحد من rRAP1 لمدة ساعة واحدة في RT مع 50 ميكرولتر من PI (3,4,5)P3-agarose الخرز في وجود أو عدم وجود 5 إلى 50 μM dioctanoylglycerol (diC8) PI (3,4,5)P3, 20 إلى 50 درجة مئوية DIC8 PI (4,5)P2, أو 50 μM diC8 PI (3,4,5) P3 و 250 ng PIP5Pase تنقية من T. بروسي شكل مجرى الدم3. تم تحليل الربط من قبل النشاف الغربية مع الماوس المضادة له HRP الأجسام المضادة أحادية النسيلة (1:2000، المخففة في 6٪ PBS-الحليب) وتطويرها من قبل chemiluminescence. تم تعديل هذا الرقم من Cestari et al.3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 : الكروماتوغرافيا التقاربية وتحليل قياس الطيف الكتلي لبروتينات T. بروسي التي تربط Ins(1,4,5)P3. (A) 10٪ SDS / PAGE تحليل البروتينات T. بروسي التي تربط Ins (1،4،5) P3 الخرز أو حبات أغاروز. تم احتضان اللمعات من 5.0 × 109 طفيليات في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع 400 ميكرولتر من Ins (1,4,5) P3 مترافق مع حبات أجاروز أو مع حبات أجاروز دون Ins(1,4,5)P3 [1 مل من الخرز تحتوي على 10 نمول من Ins المترافقة (1,4,5)P3]. تم غسل رد الفعل ملزمة، وeluted في 2 × Laemmli عينة العازلة والمغلي لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية. تم فصل البروتينات في 10٪ SDS / PAGEوملطخة بقع Coomassie (جدول المواد). تظهر رؤوس الأسهم البروتينات التي يتم إثراؤها في Ins(1,4,5) P3-الخرز مقارنة مع حبات أغاروز. تشير الدوائر إلى البروتينات الموجودة في كل من Ins(1,4,5)P3-beads and agarose beads، وتشير القوس إلى البروتينات الموجودة في كليهما ولكنها غنية في Ins(1,4,5) P3-beads مقارنة بحبات أغاروز. (ب) تُظهر النقاط البروتينات التي تم تحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي التي يتم إثراؤها في Ins(1,4,5) P3-beads مقارنة بحبات الآغاروز. التخصيب المحدد من قبل FC > 2 و p-value <0.05. وقد استخدمت أربعة عمليات تكرار بيولوجية لالخرز الأجاروز AC-MS، وثلاثة نسخ بيولوجية لIP3 الخرز AC-MS. تم حساب أضعاف التغيير من البروتينات المحددة في IP3 الخرز مقابل الخرز أغاروز باستخدام كثافة الأطياف الببتيد باستخدام MSstat50. النتائج التفصيلية وقائمة الببتيدات متوفرة8. كما تتوفر البيانات الأولية لقياس الطيف الكتلي مع معرّف PXD005907 من خلال اتحاد بروتيومإكستشانج عبر مستودع شريك PRIDE. تم تعديل هذا الرقم من Cestari et al.8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحديد البروتينات التي تربط إلى IPs أو PIs أمر بالغ الأهمية لفهم الوظيفة الخلوية من هذه الأيض. يوفر التصوير اللوني المتقارب المقترن باللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي فرصة لتحديد البروتينات المتفاعلة بين بروتوكول الإنترنت وPI وبالتالي اكتساب رؤى حول وظيفتها التنظيمية. IPs أو PIs الموسومة كيميائيا [على سبيل المثال، Ins(1,4,5)P3 مرتبطة كيميائيا بالبيوتين] وكروسلينكد إلى حبات الأجاروس عن طريق streptavidin أو القبض عليها بواسطة الخرز المغناطيسي streptavidin يسمح العزلة من البروتينات المتفاعلة التي يمكن بعد ذلك التعرف عليها عن طريق الكتلة قياس الطيف أو وصمة عار الغربية. وقد استخدمت البروتوكولات الموصوفة هنا لتحديد البروتينات من T. بروسي3و8 وخلايا الثدييات47 التي تربط هذه الأيض. كما تم استخدام الاختلافات في النهج الذي يستخدم العلامات المخصصة (غير البيوتين) في الخميرة46. ومن الاعتبارات الهامة لهذا النهج استخدام الضوابط للتمييز بين تفاعلات غير محددة. الخرز غير المترافق هي عنصر تحكم أساسي، ولكن قد تشمل الضوابط الإضافية PIs غير الفوسفورية أو الإينوزيتول المترافقة مع الخرز3. كما يمكن استخدام الـ IPs أو PIs مع تركيبات الفوسفات المختلفة3,8 لأن ربط البروتين بهذه الأيض قد يتضمن مجالات تميز تكوين الفوسفات من الإينوزيتول38, 39،40،41. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤثر تعقيد العينة على حساسية النهج، وبالتالي قد يساعد تقليل تعقيد العينة عن طريق تجزئة العينة على اكتشاف البروتينات الوفيرة المنخفضة في الخلية. هناك بروتوكولات راسخة لتجزئة الخلايا وعزل ميتوتشوندريون51، نواة52، غلينوم53، وflagellum54،55 من التربانوسوم. لاحظ أنه قد يلزم ضبط المخازن المؤقتة والكواشف المستخدمة في الكسور دون الخلوية للتوافق مع المخازن المؤقتة والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. وتجدر الإشارة إلى أن تحديد البروتينات التي ترتبط بـ IPs أو PIs بواسطة الكروماتوغرافيا المتقاربة كما هو مبين هنا يعتمد على تقارب البروتين والمستقلب في التفاعل، وبالتالي قد لا يتم الكشف بسهولة عن البروتينات التي لديها تقارب ضعيف مع الـ IPs أو PIs.

تحليل تفاعل IP أو PI مع البروتينات من lysate الخلية قد يؤدي أيضا إلى تحديد البروتينات التي لا ترتبط مباشرة إلى هذه الأيض، ولكن الذي ينتج التفاعل من ارتباط البروتين في مجمع مع البروتينات الأخرى التي تربط إلى البرامج IP أو PIs. وتتمثل هذه الميزة في الشكل 3أ، الذي RAP1-HA من T. بروسي lysate يبدو لربط PI (3،4،5) P3 الخرز وPI (4،5) P2 الخرز. ومع ذلك، فإن الاختبارات الملزمة مع rRAP1 الموسومة له تظهر أن هذا البروتين يربط PI (3,4,5)P3 وليس PI (4,5)P23. ويتضح ذلك في الشكل 3باء، حيث تظهر الاختبارات التنافسية أن PI مجانا (3،4،5) P3 ولكن ليس PI الحرة (4،5) P2 تتنافس على rRAP1-تفاعله مع PI (3،4،5) P3 الخرز. وRAP1 التفاعل على ما يبدو مع PI (4,5) P2 الخرز يرجع إلى جمعية RAP1 داخل مجمع مع البروتينات التي تربط PI (4,5)P2 (على سبيل المثال، PIP5Pase)3. وبالتالي، فإن الاختبارات الملزمة من الليسات الخلوية قد تحدد البروتينات التي ترتبط بشكل مباشر أو غير مباشر بـ IPs أو PIs. وتجدر الإشارة إلى أن التفاعلات غير المباشرة تختلف عن التفاعلات غير المحددة لأن الأولى قد تكون لها وظيفة بيولوجية (في سياق مجمع البروتين) تؤثر على ربط المستقلب أو تتأثر به. على سبيل المثال، يربط Ins(1,4,5,6)P4 إلى مجمع deacetylase الكبت المشترك متعدد الوحدات الفرعية ويتحكم في التجميع المعقد والنشاط13. وبالتالي، فمن الضروري التحقق من صحة تفاعلات IP/PI مع البروتينات. قد ينطوي التحقق من التفاعل على اختبار المنافسة مع زيادة من الـ IPs أو PIs (كما هو الحال في الشكل 3B)3،8، الطفرات في مجالات البروتين المحتملة56، أو استخدام البروتينات النقية إلى تحديد التفاعلات المباشرة (الشكل3ألف،باء)3.

وتشمل الطرق الأخرى لدراسة البروتين وتفاعل الملكية الفكرية أو PI ربط البروتينات بـ IPs أو PIs المُصنّع لاسلكيًا، واستخدام الـ IPs أو PIs المرتبطة بالأغشية الكارهة للماء كمصفوفات لالتقاط البروتين، أو ربط البروتينات بـ PIs المدمجة في liposomes 42 , 57 , 58.الأهم من ذلك، إذا كان تفاعل البروتين مع PIs يتطلب هياكل الغشاء38،يمكن استخدام الاختبارات المستندة إلى liposome كنهج تكميلي. وتشمل قيود هذه النهج انخفاض الإنتاجية، وانخفاض الحساسية، والاتجاه الكيميائي غير المعروف للأهداف البيئية أو ارتباط مؤشرات أسعار الفائدة بالمصفوفات58،أو استخدام المواد المشعة42. الطريقة الموصوفة هنا حساسة، خالية من الدهون، غير المشعة، وIP / PI-الخرز متاحة تجاريا، وبالتالي فإنها لا تتطلب توليف كيميائي مخصص. وعلاوة على ذلك، فإن موقف البيوتين المرتبط بـ IPs أو PIs محدد بشكل جيد، ويمكن تعديله أيضًا46و58 ، مما يسمح بإجراء تحليل دقيق للتفاعل بين البروتين والمستقلب. ويمكن أيضا الجمع بين الطريقة الموصوفة هنا مع نُهُج قياس الطيف الكتلي الكمي مثل وضع العلامات على نظائر الأحماض الأمينية المستقرة في زراعة الخلايا (SILAC)47،والتي يمكن استخدامها لتحديد التفاعلات الدينامية في ظل مختلف الخلايا الخلوية العلاجات أو الشروط. وقد ساعد الكروماتوغرافيا تقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي لتحديد العديد من البروتينات IP- أو PI ملزمة من T. بروسي، خلايا الثدييات، والخميرة3،8،46، 47، بما في ذلك البروتينات التي لم تتميز نطاقات الملكية الفكرية أو PI ملزمة، وساعدت أيضا على تحديد مجالات ملزمة جديدة، على سبيل المثال، PI (3،4،5) P3 نطاق ملزم47.

عموما، يمكن استخدام البروتوكولات الموصوفة هنا لمسح البروتينات المحتملة IP أو PI التفاعل من T. بروسي، ودراسة التفاعل الجزيئي للبروتينات مع هذه الأيض. ويمكن تكييف البروتوكول بسهولة لتحديد البروتينات الملزمة للملكية الفكرية أو PI من الطفيليات أحادية الخلية الأخرى أو من كائنات أخرى مثل خلايا الثدييات47 والخميرة46،وسوف يساعد على زيادة فهم الوظيفة البيولوجية للكائنات الحية والمؤشرات على الإنترنت (بي إي) في (إيوكاريوتس)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل مجلس بحوث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC, RGPIN-2019-04658)؛ NSERC اكتشاف إطلاق الملحق للباحثين الوظيفي المبكر (DGECR-2019-00081) وجامعة ماكغيل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent - control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

هذا الشهر في JoVE العدد 149 فوسفات الإينوزيتول فوسفاتيديلينوستول فوسفوينوسيتيد تفاعل البروتين تريبانوسوما,الأيض قياس الطيف الكتلي النشاف الغربي الكروماتوغرافيا التقارب
تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cestari, I. Identification of… More

Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter