Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identifikation af inositol fosfat eller Phosphoinositide interagerende proteiner ved affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59865
Automatic Translation
1
1Institute of Parasitology, McGill University

Summary

Denne protokol fokuserer på identifikation af proteiner, der binder sig til inositol phosphater eller phosphoinositides. Det bruger affinitets kromatografi med biotinylerede inositol phosphater eller phosphoinositides, der er immobiliseret via streptavidin til agopstået eller magnetiske perler. Inositol fosfat eller phosphoinositide binding proteiner er identificeret ved Western blotting eller massespektrometri.

Abstract

Inositol phosphater og phosphoinositides regulere flere cellulære processer i eukaryoter, herunder genekspression, vesikelprotein handel, signaltransduktion, metabolisme, og udvikling. Disse metabolitter udfører denne regulerings aktivitet ved at binde sig til proteiner og derved ændre protein konformationen, katalytisk aktivitet og/eller interaktioner. Den beskrevne metode bruger affinitets kromatografi koblet til massespektrometri eller Western blotting til at identificere proteiner, der interagerer med inositol phosphater eller phosphoinositides. Inositol phosphater eller phosphoinositides er kemisk mærket med biotin, som derefter fanges via streptavidin konjugeret til agopstået eller magnetiske perler. Proteiner isoleres ved deres affinitet af binding til metabolitten, derefter elueres og identificeres ved massespektrometri eller Western blotting. Metoden har en enkel arbejdsgang, der er følsom, ikke-radioaktiv, liposome-fri, og tilpasselig, støtte analyse af protein og metabolit interaktion med præcision. Denne fremgangsmåde kan anvendes i label-fri eller i aminosyre-mærkede kvantitative massespektrometri metoder til at identificere protein-metabolit interaktioner i komplekse biologiske prøver eller ved hjælp af rensede proteiner. Denne protokol er optimeret til analyse af proteiner fra Trypanosoma brucei, men det kan tilpasses til beslægtede protozoer parasitter, gær eller pattedyrceller.

Introduction

Inositol phosphater (IPS) og phosphoinositides (pi'er) spiller en central rolle i eukaryote biologi gennem regulering af cellulære processer såsom kontrol af genekspression1,2,3, vesikle handel 4, signaltransduktion5,6, metabolisme7,8,9, og udvikling8,10. Den regulerende funktion af disse metabolitter skyldes deres evne til at interagere med proteiner og dermed regulere protein funktion. Ved binding af proteiner kan IPs og Pi'er ændre protein konformationen11, katalytisk aktivitet12eller interaktioner13 og dermed påvirke cellulær funktion. IPS og pi'er distribueres i flere subcellulære rum, såsom Nucleus2,3,14,15, endoplasmatiske reticulum16,17, plasma membran1 og cytosol18, enten associeret med proteiner3,19 eller med RNAs20.

Spaltningen af membranen-associeret PI (4,5) P2 ved fosfolipase C resulterer i frigivelse af ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforyleres eller defosforyleres ved henholdsvis IP-kinaser og fosfataser. IPs er opløselige molekyler, der kan binde sig til proteiner og udøve regulerende funktioner. For eksempel, ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungere som en anden budbringer ved binding til IP3 receptorer, som inducerer receptoren konformationsmæssige ændringer og dermed frigivelse af ca2 + fra intracellulære butikker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder sig til Histon deacetylase-komplekset og regulerer protein kompleks montage og aktivitet13. Andre eksempler på IPS reguleringsfunktion omfatter kontrol af kromatin organisation21, RNA transport22,23, RNA redigering24, og transkriptionen1,2,3 . I modsætning hertil er pi'er ofte forbundet med rekruttering af proteiner til plasma membranen eller organelle membraner25. Men en ny ejendom af pi'er er evnen til at associere med proteiner i et ikke-membranøs miljø3,15,19,26. Dette er tilfældet med den nukleare receptor akut faktor, som transkriptional kontrolfunktion er reguleret af PI (3, 4, 5) P319, og poly-A polymerase hvilken enzymatisk aktivitet er reguleret af nukleare PI (4,5) P226. En regulerende rolle for IPS og pi'er er blevet vist i mange organismer, herunder gær22,27, pattedyrceller19,23, Drosophila10 og Worms28. Af betydning er disse metabolitters rolle i trypanosomer, som afveg tidligt fra den eukaryotiske afstamning. Disse metabolitter spiller en væsentlig rolle i Trypanosoma brucei transkriptional Control1,3, Development8, organelle Biogenese og protein Traffic29,30 , 31 , 32, og er også involveret i at kontrollere udvikling og infektion i patogener T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 og Plasmodium 5 , 37. derfor kan forståelse af IPS ' og pi's rolle i trypanosomer bidrage til at belyse nye biologiske funktioner for disse molekyler og identificere nye narkotikaprækursorer.

Specificiteten af protein og IP eller PI binding afhænger af protein interagere domæner og fosforylering tilstand af inositol13,38, selv om interaktioner med lipiddelen af pi'er også forekommer19. Variationen af IPs og Pi'er og deres modificerende kinaser og fosfataser giver en fleksibel cellulær mekanisme til kontrol af protein funktion, som påvirkes af metabolitten tilgængelighed og overflod, fosforylering tilstand af inositol, og protein affinitet af interaktion1,3,13,38. Selv om nogle protein domæner er velkarakteriserede39,40,41, fx pleckstrin homologi Domain42 og SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domæner43 ,44,45, nogle proteiner interagerer med IPS eller pi'er af mekanismer, der forbliver ukendte. For eksempel mangler den repressor-aktivator protein 1 (RAP1) af T. brucei CANONICAL pi-binding domæner, men INTERAGERER med PI (3, 4, 5) P3 og kontrol transkriptionen af gener involveret i antigen variation3. Affinitets kromatografi og massespektrometri-analyse af IP-eller PI-interagerende proteiner fra trypanosome, gær eller pattedyrsceller identificerede flere proteiner uden kendte IP-eller PI-bindings domæner8,46, 47. dataene tyder på yderligere ukarakteriserede protein domæner, der binder sig til disse metabolitter. Derfor, identifikation af proteiner, der interagerer med IPs eller Pi'er kan afsløre nye mekanismer af protein-metabolit interaktion og nye cellulære regulerende funktioner for disse små molekyler.

Den beskrevne metode beskæftiger sig med affinitets kromatografi koblet til Western blotting eller massespektrometri for at identificere proteiner, der binder sig til IPs eller Pi'er. Det bruger biotinylerede IPs eller Pi'er, der enten er tværbundet til streptavidin konjugeret til aganerede perler eller alternativt, fanget via streptavidin-konjugeret magnetiske perler (figur 1). Metoden giver en enkel arbejdsgang, der er følsom, ikke-radioaktiv, liposome-fri og er egnet til påvisning af binding af proteiner fra celle lysater eller renset proteiner3 (figur 2). Metoden kan anvendes i etiket-fri8,46 eller koblet til aminosyre-mærket kvantitativ massespektrometri47 til at identificere IP eller PI-bindende proteiner fra komplekse biologiske prøver. Derfor er denne metode et alternativ til de få metoder til rådighed til at studere samspillet mellem IPs eller Pi'er med cellulære proteiner og vil hjælpe med at forstå den regulerende funktion af disse metabolitter i trypanosomes og måske andre eukaryoter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. analyse af IP-eller PI-bindende proteiner ved affinitets kromatografi og Western blotting

  1. Cellevækst, lysis og affinitets kromatografi
    1. Grow T. brucei celler til mid-log fase og overvåge cellelevedygtighed og tæthed. I alt 5,0 x 107 celler er tilstrækkelig til en bindende analyse.
      1. For blodbanen former, dyrke celler i HMI-9 medier suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS) ved 37 °C og 5% CO2. Hold celletætheden mellem 8,0 x 105 til 1,6 x 106 celler/ml.
        Bemærk: densitet højere end 1,8 x 106 celler/ml kan påvirke cellens levedygtighed. Fordoblingen-tidspunktet for T. brucei 427 stamme dyrket in vitro er mellem 5,5 og 6,5 h.
      2. For procyklisk former, dyrke celler i SDM-79 medium suppleret med 10% FBS ved 27 °c og holde celletæthed mellem 1,0 x 107 og 3,0 x 107 celler/ml.
      3. For rensede proteiner (f. eks. rekombinante proteiner) tages 0,5 til 1 μg protein og fortyndes i 450 μL bindings buffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl phenyl-polyethylenglycol, pH 7,4). Hold 5% af det fortyndede protein (input) til Western blot-analyse. Fortsæt til trin 1.1.7.
    2. Centrifuge cellerne ved 1.600 x g i 10 minutter ved stuetemperatur (RT). Kassér supernatanten.
      Bemærk: Se trin 2.1.2 for yderligere information om centrifugering af store kultur volumener.
    3. Forsigtigt resuspension af pellet i 10 mL fosfat bufferet saltvand pH 7,4 suppleret med 6 mM glukose (PBS-G) og forvarmet ved 37 °C for at vaske cellerne. Derefter centrifugeres cellerne ved 1.600 x g i 5 minutter ved rt. Gentag proceduren to gange.
    4. Resuspension af pellet i 1 mL PBS-G. Derefter overføres lydstyrken til et 1,5 mL rør og centrifugeres ved 1.600 x g i 5 min. kassér supernatanten.
      Bemærk: celle pellets kan blinke frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C eller flydende nitrogen.
    5. Resuspension af pellet i 0,5 mL lysis buffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol, pH 7,4) suppleret med 1.5 x proteasehæmmer cocktail og 1x fosfatasehæmmer cocktail (tabel over materialer) præ-kølet i is til lysere cellerne. Inkuber lysat i 10 min. ved 50 rpm ved 4 °C.
      Bemærk: Dette er et kritisk skridt, fordi proteiner kan nedbrydes, hvis de ikke håndteres som indikerede. Kontroller integriteten af proteinlysat med natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS/side), hvis det er nødvendigt.
      Forsigtig: T-octylphenoxypolyethoxyethanol er giftigt og kan forårsage irritation af hud og øjne. Brug handsker, Eyeshield og faceshield beskyttelse.
    6. Du centrifugeres lysbilledet ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 °c. Supernatanten opsamles i et nyt 1,5 mL rør til bindende assays. Hold 5% af total lysat (input) for Western blotting analyse. Supernatanten indeholder parasi-proteiner ekstraheret med lyse buffer.
    7. Saml 50 μL af IPs eller PI konjugeret til agerede perler (dvs. 50 μL gylle) eller 50 μL agerede perler, og centrifuge i 1 min ved 1.000 x g. Supernatanten kasseres og resuspenderes i 50 μL bindings buffer for at ækvibrere perlerne. Brug ikke-konjugeret perler som en kontrol. Brug IP/PI-perler med forskellige fosfat konfiguration, herunder ikke-phosphorylated former til kontrol for uspecifikke interaktioner.
    8. Tilsæt 50 μL IP-eller PI-perler til celle lysatet eller rensede proteiner (hver 1 mL perler indeholder 10 nmol konjugerede IPs eller pi'er). Opbevar mængden af IP-eller PI-perler inden for 10% af det totale lysat, og Juster om nødvendigt bindings reaktions volumen med bindings buffer.
      1. For konkurrence assays tilsættes til den bindende reaktion forskellige koncentrationer af ikke-konjugeret IPs eller pi'er (f. eks. 1-, 10-, 100-fold molær overskud sammenlignet med IP-eller PI-perler).
    9. Reaktionen inkubates i 1 time eller natten over ved 4 °C og roterer ved 50 rpm.
      Bemærk: bindende reaktioner med oprensede proteiner kan ske på RT afhængigt af proteinets stabilitet. Hvis du bruger IPs eller Pi'er konjugeret til biotin kun gå videre til trin 1.1.9.1, ellers gå videre til trin 1.1.10.
      1. Tilsæt 50 μL streptavidin-konjugeret til magnetiske perler til bindings reaktionen og Inkuber i 1 time ved 4 °C roterende ved 50 rpm.
    10. Blandingen centrifugeres i 1 min ved 1.000 x g ved 4 °c. Fjern supernatanten (gennemstrømning) og opbevar pellet. Hold 5% af supernatanten for Western blot-analyse.
      Bemærk: Hvis du bruger magnetiske perler, Fjern supernatanter og udføre efterfølgende skylninger ved hjælp af en magnetisk stativ (centrifugationer er ikke nødvendige).
    11. Der tilsættes 1 mL vaskebuffer (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl phenyl-polyethylenglycol, pH 7,4) og resuspension af harpiks ved at tappe eller hvirvlende røret (brug ikke en pipette, da perler kan fastgøres til pipettespidser). Reaktionen centrifugeres i 1 min ved 1.000 x g ved 4 °c, og supernatanten kasseres. Gentag proceduren for i alt fem skyller.
      Forsigtig: 4-nonyl phenyl-polyethylenglycol er giftigt og kan forårsage irritation af hud og øjne. Brug handsker, Eyeshield og faceshield beskyttelse.
    12. Tilsæt 50 μl 2x laemmli buffer suppleret med 710 mm 2-mercaptoethanol til perlerne og bland ved at tappe eller vortex for at elueres proteinerne. Opvarm ved 95 °C i 5 minutter, og centrifuger derefter for 10.000 x g i 1 min. og saml supernatanten (indeholder eluede proteiner). Alternativt elueres proteiner med 8 M urinstof/100 mm glycin pH 2,9 for at undgå at bruge SDS. Eluatet fastfryses ved-80 °C, ellers fortsættes til Western blot-analyse.
      Forsigtig: 2-mercaptoethanol er giftigt og kan forårsage hud-, øjen-og luftvejs irritationer. Brug handsker og arbejde i den kemiske hætte.
  2. Western blotting analyse
    1. Bland 15 μL input (fra trin 1.1.6) eller gennemstrømnings (fra trin 1.1.10) prøver med 5 μL 4X Laemmli buffer. Varmetilførsel og gennemstrømnings prøver i 5 min ved 95 °C. For prøver elueret i 8 M urinstof/100 mM glycin pH 2,9, bland 15 μL eluat med 5 μL 4X Laemmli buffer, og varme i 5 min ved 95 °C.
      Bemærk: dette trin er ikke nødvendigt for prøver elueret i 2x laemmli buffer.
    2. Læg brønde på 4-20% SDS/side gel med 2,5 μl input, 2,5 μl gennemstrømning og 20 μl elueret prøver og belastnings protein stigen i henhold til fabrikantens anbefaling.
      Bemærk: Vælg gel% i henhold til den molekylære vægt af det protein af interesse.
    3. Kør SDS/side på 150 V for 30-45 min i køre buffer, eller indtil den blå farve af Laemmli buffer er i slutningen af gelen.
      Bemærk: tidspunktet for kørslen kan variere alt efter laboratorieudstyr.
    4. Fjern gelen fra glasset (eller plastik) pladerne, og sug i overførselsbufferen i 15 minutter.
    5. Proteiner overføres til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran eller nitrocellulose membran. Bløde membraner og 3 mm filtrerpapir i overførsels buffer. Saml en sandwich med tre ark filtrerpapir, nitrocellulose eller PVDF-membran, gel og yderligere tre ark filtrerpapir. Sørg for, at der ikke er luftbobler fanget i sandwichen. Brug en rulle til at fjerne bobler, hvis det er nødvendigt. Sæt membranen på katoden og gelen på anodesiden af kassetten.
      Bemærk: Kontrollér membran producentens anvisninger for oplysninger om membran aktivering eller blot klargøring.
    6. Placer kassetten, der indeholder sandwichen i overførings beholderen med overførsels buffer. Anbring beholderen i en isspand eller ved 4 °C (f. eks. i kølerummet). Overfør proteiner ved 100 V i 1 time (strøm varierer mellem 200-400 mA). Alternativt kan du overføre natten til en konstant strøm på 15 mA ved 4 °C.
    7. Fjern membranen fra kassetten. Membranen skal inkubere i 6% ikke-fedtet tørmælk fortyndet i PBS med 0,05% Polysorbat 20 (PBS-T) eller kompatibel blokerende opløsning i 1 time ved RT for at blokere membranen.
      Bemærk: før du blokerer membranen, kan kvaliteten af overførslen kontrolleres ved hjælp af Ponceau S plet. Inkuber membranen i 1 min i 15 mL Ponceau S, skyl i vand og Visualiser bånd.
    8. Fjern blokerings opløsningen, og Inkuber membranen i 1 time ved RT med 50 rpm rotation i primære antistoffer fortyndet i 6% ikke-fedt tørret mælk fortyndet i PBS-T. Alternativt Inkuber membranen natten over ved 4 °C med 50 rpm rotation.
      Bemærk: inkubationstiden kan variere alt efter kvaliteten af antistofferne; de fleste antistoffer vil dog arbejde med inkubationer på 1-3 h ved RT. Følg producentens anbefaling for antistoffer koncentration eller fortynding.
    9. Vask blottet ved at inkube membranen i PBS-T i 5 min med 50 rpm rotation ved RT. Gentag proceduren 3-5 gange. Flere skyller kan være nødvendige afhængigt af kvaliteten af antistoffer.
    10. Membranen i peberrod-peroxidase (HRP)-konjugeret sekundære antistoffer i 1 time ved RT i 6% ikke-fedt tørret mælk fortyndet i PBS-T med 50 rpm rotation.
      Bemærk: Følg producentens anbefaling for antistoffer koncentration eller fortynding.
    11. Vask blottet som angivet i trin 1.2.9.
    12. Tilsæt kemiluminescerende substrat til at dække membranen. Fjern overskydende substrat og Inkuber i 5 min ved RT i mørket.
      Bemærk: Se producentens anvisninger for anbefalinger vedrørende kemiluminescens reagenser.
    13. Optag det chemiluminescerende signal ved hjælp af en Kamerabaseret Imager. Alternativt kan du bruge en røntgenfilm til at opfange kemiluminescens signalet.

2. analyse af IP/PI-bindende proteiner ved affinitets kromatografi og massespektrometri

  1. Cellevækst, lysis og affinitets kromatografi
    1. Grow T. brucei celler til mid-log fase og overvåge cellelevedygtighed og tæthed.
      Bemærk: i alt 1,0 x 1010 celler er nok til to bindende assays. Brug af færre celler end angivet her kan påvirke påvisning af lav forekomst af proteiner ved massespektrometri.
      1. For T. brucei Blood Stream former, dyrke celler i Mid-log fase (8,0 x 105-1,6 x 106 celler/ml) i HMI-9 medier suppleret med 10% FBS ved 37 °c og med 5% Co2. For 427 stamme, 5 L af kultur vil give 0,5-1,0 x 1010 celler. Overvåg cellevæksten for at undgå tæthed højere end 1,8 x 106 celler/ml, hvilket kan påvirke cellens levedygtighed. Hold cellekulturen volumen til 1/10 af kolbens volumen; ellers vil vækstraten af cellerne blive påvirket på grund af dårlig beluftning.
        Bemærk: 427-stammen har en fordoblings tid på 5,5-6,5 h.
      2. For procyklisk former, dyrke celler i SDM-79 medium suppleret med 10% FBS ved 27 °c og holde celletæthed mellem 1,0 x 107 og 3,0 x 107 celler/ml. 500 mL kultur vil give 0,5-1.5 x 1010 celler.
    2. Cellerne centrifugeres ved 1.600 x g i 15 minutter ved rt. kassér supernatanten, og resuspender pellet i 200 ml PBS-g forvarmet ved 37 °c. Brug runde bund Centrifugerings slanger (tabel over materialer) fordi T. brucei Blood Stream form pellets er let forstyrret, når du bruger fast vinkel centrifuge rotorer. Centrifuger cellerne igen ved 1.600 x g i 5 minutter ved rt.
    3. Supernatanten fjernes, og pelleten opslæmmes i 10 mL PBS-G. Cellerne centrifugeres ved 1.600 x g i 5 minutter ved rt. Gentag proceduren og efter den sidste vask, kassér supernatanten.
      Bemærk: pellets kan blinke frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C eller flydende nitrogen.
    4. Celle pellet opslæmmes i 5 mL lysis-buffer, som er forkølet i is og suppleret med cocktail af 1,5 x proteasehæmmer og 1x fosfatasehæmmer cocktail (tabel over materialer). Du inkubere lysatet i 10 minutter ved 4 °C roterende ved 50 rpm.
    5. Du centrifugeres lysbilledet ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °c. Supernatanten (opløseligproteiner) opsamles og fortyndes i 20 mL bindings buffer.
    6. Indsaml 400 μL af IPs eller Pi'er, som er konjugeret med agaterede perler (dvs. 400 μL gylle) eller 400 μL kontrol perler, og centrifuge i 1 min ved 1.000 x g ved rt. kassér supernatanten, og resuspender i 400 μl bindings buffer for at ækvibrere perlerne. Brug agaded perler som en negativ kontrol til at bestemme specifik berigelse af protein-metabolit interaktioner sammenlignet med uspecifikke interaktioner (f. eks proteiner, der binder nonspecifikt til perlerne). Brug IPs eller Pi'er med forskellige fosfat konfigurationer, herunder ikke-phosphorylerede former til at kontrollere for uspecifikke interaktioner på grund af fosfat afgifter eller binding til biotin.
    7. Tilsæt 400 μL IP/PI-perler eller kontrol perler til 10 mL lysat og inkuberet i 1 time, eller natten, ved 4 °C roterende ved 50 rpm. Hvis du bruger IPs eller Pi'er konjugeret med biotin kun (uden perler) gå videre til trin 2.1.7.1, ellers gå videre til trin 2.1.8.
      1. Tilsæt 100 μL streptavidin-konjugeret til magnetiske perler og Inkuber i 1 time ved 4 °C roterende ved 50 rpm.
    8. Den bindende reaktion centrifugeres i 1 min ved 1.000 x g ved 4 °c. Fjern supernatanten (gennemstrømning) og opbevar pellet. Hold 5% af supernatanten for Western blot-analyse.
    9. Tilsæt 5 mL vaskebuffer til pellet, bland forsigtigt ved at hvirvlende røret, og centrifuger derefter i 1 min ved 1.000 x g ved 4 °c. Kassér supernatanten. Gentag vask fem gange. Hvis du bruger magnetiske perler, indsamle supernatanter og udføre skylninger ved hjælp af en magnetisk stativ (centrifugationer er ikke nødvendige).
    10. Tilsæt 50 μL 2x Laemmli buffer (eller 8 M urinstof/100 mM glycin pH 2,9, for at undgå at bruge SDS) til perlerne og bland ved at tappe eller vortex (undgå pipettering, fordi perler kan fastgøres til pipettespidser), og Opvarm derefter ved 95 °C i 5 min. centrifuge til 10.000 x g i 1 min. og indsamle supernatanten (eluted proteiner). Gentag proceduren to gange for at samle i alt tre fraktioner.
    11. Eluatet fastfryses ved-80 °C, ellers adskilles proteiner i SDS/side eller opbevares i opløsning til trypsinisering og massespektrometri analyse.
  2. Trypsin fordøjelse af proteiner til massespektrometri
    Bemærk: to variationer af denne procedure er vist for afsnit 2.2.1 (i gel) eller afsnit 2.2.2 (i opløsning) fordøjelse af proteiner. Protein lav binding rør anbefales for at forhindre prøve tab. Rådfør dig med en analytisk kemiker på proteomics-anlægget om protokollens egnethed til de tilgængelige prøver og massespektrometer instrumenter.
    1. In-gel trypsinisering af proteiner
      1. Efter protein separation i SDS/PAGE skylles gelen kortvarigt i vand med høj renhed. Overføres gelen på en ren glasplade. Punktafgifts protein bånd med et rent blad og undgå at skære ekstra gel uden for båndene. Skær gelstykkerne i små stykker (dvs. ca. 1 mm kvadrat) og overfør dem til et 1 mL rør. Brug en pipettespids, hvis det er nødvendigt, men sørg for, at pipettespidsen skylles i ethanol før brug.
        Bemærk: brug handsker for at undgå gel-kontaminering. Gel-stykker kan opbevares ved-20 °C.
      2. Tilsæt 100 μL høj renhed eller højtydende væskekromatografi kvalitet vand til rør til at skylle gel stykker. Kassér vandet.
        1. For Coomassie eller ruthenium-baserede fluorescerende bejdsede gel stykker, Inkuber gel stykker i affarvningsopløsning (25 mM NH4HCO3 i 50% acetonitril) i 1 time, og kassér derefter opløsningen. Gentag proceduren, indtil farvning ikke er synlig.
          Bemærk: Forbered opløsninger, der indeholder NH4HCO3 , ved fortynding fra en stamopløsning på 100 mm NH4HCO3, pH 7,8.
          Forsigtig: acetonitril er et flygtigt opløsningsmiddel, brandfarligt og giftigt. NH4HCO3 kan forårsage irritation af hud eller øjne. Brug handsker og arbejde under en kemisk hætte.
        2. For gel stykker af sølv bejdset, Inkuber gel stykker i 50 μL affarvningsopløsning for sølv bejdsning (15 mM K3[Fe (cn)6], 50 mm na2S2O3) i vand i 30 min. kassér opløsningen og vask gel stykker med 200 μl af vand. Gentag vask fem gange, eller indtil gel gul farve ikke er synlig.
          Forsigtig: K3[Fe (cn)6] kan forårsage hud-eller øjenirritation. Brug handsker.
      3. Dehydrat gelstykkerne med 200 μL acetonitril i 10 minutter ved RT. Kassér derefter opløsningen.
        Bemærk: dehydrerede gel stykker er mindre i volumen, uigennemsigtige og klæbrine. Hvis flere stykker gel kombineres i et rør, gentages proceduren for effektiv dehydrering af gel stykker.
      4. Tilsæt 50 μl (eller nok volumen til at dække gelens stykker) til at reducere opløsningen (10 mm ditiotreitol [DTT] i 100 mm NH4HCO3) og Inkubér ved 56 °c i 1 time. bagefter afkøles rørene til RT og kassere overskydende reduktions opløsning.
      5. Tilsæt 50 μL (eller nok volumen til at dække gel stykker) alkylerings opløsning (50 mM iodoacetamid i 100 mM NH4HCO3) og Inkubér i 30 min ved rt i mørket. Bagefter kasseres overskydende alkylerings opløsning.
      6. Dehydrat gelstykkerne med 200 μL acetonitril i 10 minutter ved RT. Fjern acetonitril og fugt gelstykkerne med 100 mM NH4HCO3 i 10 minutter ved rt.
      7. Dehydrat gelstykkerne igen med 200 μL acetonitril i 10 minutter ved RT og kassér overskydende opløsning.
      8. Tilsæt 15 μL massespektrometri-kvalitet trypsin fortyndet i 50 mM NH4HCO3 buffer, eller nok volumen til at dække hydrerede gel stykker og inkubere i 4 h, eller natten, ved 37 °c. De samlede trypsin-mængder skal være mellem 100 og 500 ng (eller 20 ng trypsin/μg protein).
      9. Afkøl prøven til RT, og centrifugeres i 1 min ved 2.000 x g i en mikrocentrifuge. Tilsæt 10-20 μL 5% myresyre fortyndet i vand og Inkuber i 10 min ved RT.
        Forsigtig: myresyre er brandfarlig, ætsende og giftig. Brug handsker og arbejde under en kemisk hætte.
      10. Centrifugeres som angivet i trin 2.2.1.9, og saml derefter supernatanten (indeholder ekstraherede peptider) til et andet rør. Tilsæt 20 μL 5% myresyre fortyndet i 50-60% acetonitril til røret og Inkuber i 10 min ved RT. Saml ekstraherede peptidfraktioner i det samme rør.
      11. Prøven tørres i en vakuum koncentrator og rekonstruere i 10 μL 0,5% eddikesyre og 2% acetonitril til analyse af massespektrometri. Centrifugeres og opsamles opløsningen i bunden af røret; Opbevar opløsningen ved-20 °C eller-80 °C.
    2. I opløsning trypsinisering af proteiner
      1. Bundfælde proteiner for at reducere prøvevolumen, afsaltningog buffer udveksling. Tilsæt seks volumener af kølet (-20 °C) acetone til prøven, f. eks. 600 μL acetone til 100 μL af prøven. Vortex og Inkuber ved-20 °C i 15 min til 1 time. Opløsningen vil blive uklar eller danne et bundfald.
        Forsigtig: acetone er giftig og brandfarlig. Brug handsker og arbejde under en kemisk hætte.
      2. Centrifugerings prøverne ved 4 °C i 30 min. den acetone og lufttørre pellet i 15 min.
      3. Tilsæt 10 μL 6-8 M urea eller 1% SDS i 50 mM NH4HCO3 for at opløse pellet og vortex for at blande. For større mængder af proteiner (> 10 μg) anvendes op til 20 μL opløsnings buffer.
      4. Tilsæt 5 μL reduktions opløsning og vortex. Skru ned for lydstyrken ved hjælp af en mikrocentrifuge. Hvis prøverne fortyndes i urinstof, skal der inkubates i 1 time ved RT. Hvis prøverne fortyndes i SDS, inkuberet derefter i 1 time ved 56 °C.
      5. Skru ned for lydstyrken ved hjælp af en mikrocentrifuge. Tilsæt 3 μL alkylerings opløsning og vortex. Drej derefter lydstyrken ned og Inkuber i mørket i 30 minutter ved RT.
      6. Tilsæt 3 μL reduktions opløsning for at neutralisere reaktionen. Prøven fortyndes langsomt til 1 M urinstof eller 0,05% SDS ved brug af 50 mM NH4HCO3.
        Bemærk: trypsin-fordøjelses bufferen skal have vaskemiddel eller denaturerende. Koncentrationsgrænser for denatureringsmidler er: 0,05% SDS; 0,1% octyl B-D-glucopyranosid; 0,1% 4-nonylphenyl-polyethylenglycol; 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol; 0,1% Polysorbat 20; 0,1% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat; < 1 M urinstof eller thiourea.
      7. Tilsæt 5 μL massespektrometrisk grad trypsin fortyndet i 50 mM NH4HCO3 buffer og Inkubér i 4 timer eller natten over ved 37 °c. De samlede trypsin-mængder holdes på mellem 100 og 500 ng (eller 20 ng trypsin/μg protein).
      8. Afkøl prøven til RT, og drej lydstyrken ned ved hjælp af en mikrocentrifuge. Tilsæt 5% eddikesyre (eller 5% myresyre i 50% acetonitril) for at slukke for reaktionen.
      9. Prøverne tørres i en vakuum koncentrator som angivet i trin 2.2.1.11. Opbevar prøverne ved-80 °C. Desalt og koncentrere peptider ved hjælp af en omvendt fase kolonne som C18 zip-tip og derefter analysere ved massespektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse af RAP1 og PI (3, 4, 5) P3 interaktion ved affinitets kromatografi og Western blotting
Dette eksempel illustrerer anvendelsen af denne metode til at analysere bindingen af pi'er ved RAP1 fra t. brucei lysat eller ved rekombinant T. brucei RAP1 protein. Lysates af T. brucei blodbanen former, der udtrykker hemagglutinin (ha)-Tagged RAP1 blev brugt i bindende assays. RAP1 er et protein, der er involveret i transkriptional kontrol af variant overflade glykoprotein (VSG) gener3,48, som indkode for overflade proteiner involveret i parasit immun unddragelse ved antigene variation49. RAP1 interagerer inden for et telomerisk protein kompleks med phosphatidylinositol 5-phosphatase (PIP5Pase) enzym3, som også fungerer i kontrollen af VSG gen transkriptionen1,3. RAP1 har en N-terminal brystkræft 1 carboxyl-Terminal (brct) domæne, som er efterfulgt af en myeloblastose (myb) DNA-binding domæne og en C-Terminal myb-lignende domæne3,48. Men det mangler Canonical PI binding domæner. Bindende assays blev udført med pi'er, der er ikke-fosforyleres eller fosforyleret på forskellige positioner af inositol ring, og med ikke-konjugeret agopstået perler. Vestlige analyse viser, at RAP1 binder fortrinsvis til PI (3, 4, 5) P3-perler (figur 3A), men det binder sig også i mindre grad til PI (4,5) P2-perler. Det var dog ikke binde sig til nogen andre pi eller agopstået perler. Da RAP1 er en del af et multi protein kompleks3, kan dets interaktion med nogle pi'er ikke være direkte og dermed resultatet af RAP1-ha interaktion med andre cellulære proteiner, der binder sig til pi'er.

Derfor, at teste, om RAP1 binder direkte til pi'er, en C-terminalt Tagged 6x-hans rekombinante RAP1 (rRAP1) protein blev udtrykt og renset til homogenitet fra E. coli3. Proteinet blev anvendt i bindende assays med PI (3, 4, 5) P3-perler i nærværelse af konkurrerende koncentrationer af PI (3, 4, 5) P3 eller PI (4,5) P2. Western blotting viser, at stigende koncentrationer af PI (3, 4, 5) P3, men ikke PI (4,5) P2 hæmmer samspillet mellem rRAP1 med PI (3, 4, 5) P3 (figur 3B). Desuden, tilsætning af T. brucei renset PIP5Pase enzym til reaktionen restaureret PI (3, 4, 5) P3-bindende ved rRAP1, hvilket skyldes PIP5Pase defosforylering af fri PI (3, 4, 5) P33 og dermed indikerer, at fosforylering mønster af denne metabolitten er essentiel for rRAP1 binding. Derfor interagerer rRAP1 med PI (3, 4, 5) P3, som det gør RAP1-HA fra T. brucei lysates. Desuden viser dataene, at binding af RAP1-HA fra lysat til PI (4,5) P2 sandsynligvis skyldes RAP1 interaktion med andre proteiner i komplekset (f. eks. PIP5Pase)3. Dataene illustrerer komplementariteten af bindende assays med celle lysater og rekombinante proteiner. Det viser også nytten af konkurrencedygtige bindende assays at bestemme specificiteten af interaktioner mellem proteiner og pi'er.

Identifikation af ins (1, 4, 5) P3-bindende proteiner ved affinitets kromatografi og massespektrometri
I dette eksempel blev der anvendt affinitets kromatografi efterfulgt af massespektrometri til at identificere T. brucei proteiner, der binder sig til ins (1, 4, 5) P3; eksperimentet under søgelser derfor potentielle ins (1, 4, 5) P3 bindende proteiner fra T. brucei blodbanen former. T. brucei lysat blev inkuberet med ins (1, 4, 5) P3 konjugeret til agopstået perler eller med ikke-konjugeret perler (anvendes som en kontrol), og bundne proteiner blev elueret med laemmli prøve buffer. SDS/Page-analyse viser tilsætning i proteiner elueret fra ins (1, 4, 5) P3-perler sammenlignet med proteiner elueret fra kontrol agede perler (figur 4A). Massespektrometri analyse af eluede proteiner identificeret over 250 proteiner, hvoraf 84 blev beriget med ins (1, 4, 5) P3 perler sammenlignet med kontrol perler (figur 4B, fold ændring [FC] ≥ 2, p < 0,05). Tilsætning af proteiner bundet til ins (1, 4, 5) P3 sammenlignet med kontrol perler korrelerer med protein signalet detekteret af SDS/PAGE. Dataene omfatter proteiner, der blev valideret til at binde ins (1, 4, 5) P3 og proteiner, som mekanismer til binding til ins (1, 4, 5) P3 er ukendt8. Desuden varierede ins (1, 4, 5) P3-bindende proteom meget fra ins (1, 3, 4, 5) P4 og andre pi'er8, hvilket antyder, at nogle af disse proteiner genkender den specifikke fosfat konfiguration af ins (1, 4, 5) P3. Derfor kan biotin-mærkede ins (1, 4, 5) P3 anvendes til affinitets kromatografi koblet til massespektrometri for at identificere proteiner, der binder sig til ins (1, 4, 5) P3. Tilgangen kan udforskes for at identificere proteiner, der binder sig til andre IPS eller pi'er3,8,46,47.

Figure 1
Figur 1 : Affinitets reagenser til bindende assays. (A) PI (3, 4, 5) P3 (top) og ins (1, 4, 5) P3 (bund) konjugeret til biotin på SN1 position af inositol. I PI (3, 4, 5) P3 er biotin konjugeret til lipid-kæden på SN1-positionen af inositol, mens in ins (1, 4, 5) P3 biotin konjugeres til fosfat på position SN1. (B) ins (1, 4, 5) P3 er konjugeret med biotin og fanget via binding til streptavidin konjugeret til perler (f. eks. aganerede eller magnetiske perler). Variationer af disse reagenser ved hjælp af brugerdefinerede syntetiserede linkers, der erstatter Biotin er også muligt46. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Arbejdsprocessen af protokoller beskriver trinene for analysen af IP eller PI affinitet interaktion med proteiner af T. brucei og påvisning af (A) Western blotting eller (B) massespektrometri. AC-WB, affinitets kromatografi og vestlig blotting; AC-MS, affinitets kromatografi og massespektrometri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Binding af T. brucei RAP1 til phosphoinositides. (A) lysates af T. brucei (5,0 x 107 parasitter), der udtrykker ha-Tagged RAP1 blev inkuberet i 2 timer ved 4 °c med 50 μl af pi'er (hver 1 ml agaserede perler indeholdende 10 nmol af konjugeret PI) eller agrose (AG) perler. Den bindende reaktion blev vasket og elueret med 2 x Laemmli prøve buffer og opvarmet ved 95 °C i 5 min. proteiner blev udskilt i 4-20% SDS/side, overført til en PVDF-membran, og probed med monoklonale antistoffer anti-HA (1:5000, fortyndet i 6% PBS-mælk) fulgt ved anti-mus IgG-HRP (1:5000, fortyndet i 6% PBS-mælk), og påvist ved kemo luminescens. B) en μg rRAP1 blev inkuberet i 1 time ved RT med 50 μl PI (3, 4,5) P3-agopstået perler i nærværelse af eller fravær af 5 til 50 μM dioctanoylglycerol (DIC8) PI (3, 4, 5) P3, 20 til 50 ΜM diC8 PI (4,5) P2, eller 50 ΜM diC8 PI (3, 4, 5) p3 og 250 ng PIP5Pase renset fra T. brucei blodbanen former3. Binding blev analyseret af Western blotting med mus anti-hans HRP monoklonale antistoffer (1:2000, fortyndet i 6% PBS-mælk) og udviklet af chemiluminescens. Dette tal er blevet ændret fra Cestari et al.3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Affinitets kromatografi og massespektrometri-analyse af T. brucei -proteiner, der binder til ins (1, 4, 5) P3. A) 10% SDS/Sideanalyse af T. brucei proteiner, der binder sig til ins (1, 4, 5) P3-perler eller agopstået perler. Lysates af 5,0 x 109 parasitter blev inkuberet ved 4 °c i 2 timer med 400 ΜL af ins (1, 4, 5) P3 konjugeret til agerede perler eller med agerede perler uden ins (1, 4, 5) P3 [1 ml perler indeholder 10 nmol konjugerede ins (1, 4, 5) P3]. Den bindende reaktion blev vasket, elueret i 2 x Laemmli prøve buffer og kogt i 5 min ved 95 °C. Proteiner blev separeret i 10% SDS/side og plettet med Coomassie farvning (tabel over materialer). Arrowheads viser proteiner, der er beriget i ins (1, 4, 5) P3-perler i forhold til agrose perler; cirkler indikerer proteiner til stede i begge ins (1, 4, 5) P3-perler og aganerede perler, og beslaget angiver proteiner, der er til stede i begge, men er beriget i ins (1, 4, 5) P3-perler i forhold til aganerede perler. (B) prik-plot viser proteiner identificeret ved massespektrometri, der er beriget i ins (1, 4, 5) P3-perler i forhold til agopstået perler. Som defineret i FC > 2 og p-værdi < 0,05. Fire biologiske replikater blev anvendt til agopstået-perler AC-MS, og tre biologiske replikater for IP3-perler AC-MS. Fold-ændring af proteiner identificeret i IP3-perler vs agopstået-perler blev beregnet ved hjælp af peptid Spectra intensitet ved hjælp af MSstat50. Detaljerede resultater og liste over peptider er tilgængelige8. Massespektrometri rå data er også tilgængelige med identifikator PXD005907 gennem ProteomeXchange konsortiet via PRIDE partner repository. Dette tal er blevet modificeret fra Cestari et al.8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifikationen af proteiner, der binder sig til IPs eller Pi'er, er afgørende for at forstå disse metabolitters cellulære funktion. Affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri giver mulighed for at identificere IP-eller PI-interagerende proteiner og dermed få indsigt i deres reguleringsfunktion. IPS eller pi'er, der er kemisk mærkede [f. eks. ins (1, 4, 5) P3 kemisk forbundet med biotin] og tværbundet til aganerede perler via streptavidin eller fanget af streptavidin magnetiske perler tillader isolering af interagerende proteiner, som derefter kan identificeres ved masse SPEKTROMETRI eller Western blot. De her beskrevne protokoller er blevet brugt til at identificere proteiner fra T. brucei3,8 og pattedyrsceller47 , der binder sig til disse metabolitter. Variationer af tilgangen, der brugertilpassede tags (bortset fra biotin) er også blevet brugt i gær46. En vigtig overvejelse af denne fremgangsmåde er brugen af kontroller til at diskriminere specifikt fra ikke-specifikke interaktioner. Ikke-konjugeret perler er en væsentlig kontrol, men yderligere kontrol kan omfatte ikke-phosphorylated pi'er eller inositol konjugeret til perler3. IPS eller pi'er med forskellige fosfat kombinationer3,8 kan også anvendes, fordi proteinbinding til disse metabolitter kan involvere domæner, der diskriminerer fosfat konfigurationen af inositol38, 39,40,41. Desuden kan prøve kompleksitet påvirke følsomheden af tilgangen, og dermed faldende prøve kompleksitet ved prøve fraktionering kan hjælpe påvisning af lav rigelige proteiner i cellen. Der er veletablerede protokoller for celle fraktionering og isolering af betyder51, Nucleus52, glycosome53, og flagel54,55 fra trypanosomes. Bemærk, at buffere og reagenser, der anvendes i subcellulære fraktioneringer, muligvis skal justeres for kompatibilitet med buffere og reagenser, der anvendes i denne protokol. Især identifikationen af proteiner, der binder til IPs eller Pi'er ved affinitets kromatografi som angivet her, afhænger af interaktionen mellem protein og metabolit, og dermed kan proteiner, der har en svag affinitet for IPs eller Pi'er, ikke let påvises.

Analysen af IP-eller PI-interaktion med proteiner fra celle lysat kan også resultere i identifikation af proteiner, der ikke binder direkte til disse metabolitter, men som interaktion resultater fra protein Association i kompleks med andre proteiner, der binder sig til IPs eller pi'er. Denne funktion er eksemplificeret i figur 3A, hvor RAP1-ha fra T. brucei lysat synes at binde sig til PI (3, 4, 5) P3-perler og PI (4,5) P2-perler. Bindende assays med hans mærkede rRAP1 viser imidlertid, at dette protein binder sig til PI (3, 4, 5) P3 og ikke PI (4,5) P23. Dette illustreres i figur 3B, hvor konkurrencemæssige analyser viser, at gratis PI (3, 4, 5) P3, men ikke gratis PI (4,5) P2 konkurrerer om rRAP1-hans interaktion med PI (3, 4, 5) P3-perler. Den RAP1 tilsyneladende interaktion med PI (4,5) P2-perler skyldes RAP1 forening i et kompleks med proteiner, der binder PI (4,5) P2 (f. eks. PIP5Pase)3. Derfor kan bindende assays fra celle lysater identificere proteiner, der binder direkte eller indirekte til IPS eller pi'er. Indirekte interaktioner adskiller sig især fra uspecifikke interaktioner, da førstnævnte kan have en biologisk funktion (i forbindelse med protein komplekset), der påvirker eller påvirkes af metabolitten binding. For eksempel binder ins (1, 4, 5, 6) P4 sig til multi-subunit Co-repressor deacetylase Complex og styrer den komplekse samling og aktivitet13. Derfor er det vigtigt at validere IP/PI interaktioner med proteiner. Validering af interaktion kan indebære konkurrenceanalyser med et overskud af IPS eller pi'er (som i figur 3B)3,8, mutationer af potentielle protein domæner56eller anvendelse af rensede proteiner til Bestem direkte interaktioner (figur 3A, B)3.

Andre metoder til undersøgelse af protein-og IP-eller PI-interaktioner omfatter binding af proteiner til radioaktivt mærkede IPs-eller pi'er, anvendelse af IPs eller vand, der er bundet til hydrofobe membraner som matricer til protein opsamling, eller binding af proteiner til Pier indarbejdet i Liposomer 42 , 57 , 58. vigtigt, hvis protein interaktion med pi'er kræver membran strukturer38, liposome-baserede assays kan anvendes som en supplerende tilgang. Begrænsninger af disse tilgange omfatter lav gennemløb, lav følsomhed, den ukendte kemiske orientering af IPs eller PI Association til matricer58, eller brugen af radioaktive materialer42. Den beskrevne metode er følsom, liposome-fri, ikke-radioaktiv, og IP/PI-perler er kommercielt tilgængelige, og dermed de ikke kræver skræddersyet kemisk syntese. Desuden er positionen af biotin forbundet med IPS eller pi'er veldefinerede, og det kan også ændres46,58, som giver mulighed for præcis analyse af protein-og metabolit interaktion. Den metode, der beskrives her, kan også kombineres med kvantitative massespektrometri tilgange såsom stabil isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC)47, som kan bruges til at identificere dynamiske interaktioner under forskellige cellulære behandlinger eller betingelser. Affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri har medvirket til at identificere talrige IP-eller PI-bindende proteiner fra T. brucei, pattedyrsceller og gær3,8,46, 47, herunder proteiner, der ikke har karakteriseret IP-eller PI-binding domæner, og det har også bidraget til identifikation af nye bindende domæner, f. eks PI (3, 4, 5) P3 bindende domæne47.

Samlet set kan de protokoller, der er beskrevet her, bruges til at undersøge potentielle IP-eller PI-interagerende proteiner fra T. bruceiog til at studere proteiners molekylære interaktion med disse metabolitter. Protokollen kan let tilpasses til at identificere IP-eller PI-bindende proteiner fra andre unicellulære parasitter eller fra andre organismer såsom pattedyrsceller47 og gær46, og det vil bidrage til yderligere at forstå den biologiske funktion af IPS og I eukaryoter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Canadas naturvidenskabs-og ingeniør Forskningsråd (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch supplement til Early Career forskere (DGECR-2019-00081) og af McGill University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent - control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Denne måned i JoVE inositol phosphater phosphatidylinositol phosphoinositide protein interaktion Trypanosoma metabolitter massespektrometri Western blotting affinitet kromatografi
Identifikation af inositol fosfat eller Phosphoinositide interagerende proteiner ved affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cestari, I. Identification of… More

Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter