Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59865
Automatic Translation
1
1Institute of Parasitology, McGill University

Summary

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Abstract

Inositol fosfaten en fosfoinositides reguleren verschillende cellulaire processen in eukaryoten, met inbegrip van genexpressie, blaasje handel, signaaltransductie, metabolisme, en ontwikkeling. Deze metabolieten voeren deze regelgevende activiteit uit door binding aan eiwitten, waardoor het veranderen van eiwit conformatie, katalytische activiteit, en/of interacties. De hier beschreven methode maakt gebruik van affiniteits chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie of westerse blotting om te identificeren van eiwitten die interactie met inositol fosfaten of fosfoinositides. Inositol fosfaten of fosfoinositides zijn chemisch gelabeld met biotine, die vervolgens wordt gevangen via streptavidine geconjugeerd aan agarose of magnetische kralen. Eiwitten worden geïsoleerd door hun affiniteit van binding aan de metaboliet, vervolgens geellueerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie of westerse blotting. De methode heeft een eenvoudige workflow die gevoelig, niet-radioactieve, Liposome-vrij, en aanpasbare, ondersteuning van de analyse van de interactie van eiwitten en metaboliet met precisie. Deze aanpak kan worden gebruikt in etiket vrije of in aminozuur-gelabelde kwantitatieve massaspectrometrie methoden om interacties van eiwit metaboliet in complexe biologische monsters of met behulp van gezuiverde eiwitten te identificeren. Dit protocol is geoptimaliseerd voor de analyse van eiwitten van Trypanosoma brucei, maar kan worden aangepast aan verwante protozoaanse parasieten, gist of zoogdiercellen.

Introduction

Inositol fosfaten (IPS) en fosfoinositides (pi's) spelen een centrale rol in de eukaryote biologie door de regulering van cellulaire processen zoals de beheersing van genexpressie1,2,3, blaasje handel 4, signaaltransductie5,6, metabolisme7,8,9, en ontwikkeling8,10. De regelgevende functie van deze metabolieten is het gevolg van hun vermogen om te interageren met eiwitten en zo de eiwit functie te reguleren. Na binding door eiwitten, IPs en Pi's kunnen eiwit conformatie wijzigen11, katalytische activiteit12, of interacties13 en dus beïnvloeden cellulaire functie. IPS en pi's worden verdeeld in meerdere subcellulaire compartimenten, zoals Nucleus2,3,14,15, endoplasmatisch reticulum16,17, plasma membraan1 en cytosol18, ofwel geassocieerd met eiwitten3,19 of met RNAS20.

Het decolleté van de membraan-geassocieerde PI (4, 5) P2 door fosfolipase C resulteert in de afgifte van ins (1, 4, 5) P3, die kan worden gefosforyleerd of gedefosforyleerd door respectievelijk IP-kinasen en fosfatasen. IPs zijn oplosbare moleculen die kunnen binden aan eiwitten en regelgevende functies uitoefenen. Bijvoorbeeld, ins (1, 4, 5) P3 in metazoan kan fungeren als een tweede boodschapper door binding aan IP3 receptoren, die receptor conformationale veranderingen induceert en dus vrijlating van CA2 + van intracellulaire winkels11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 bindt aan het histon deacetylase complex en reguleert het eiwit complex assemblage-en activiteit13. Andere voorbeelden van IPS regulerende functie zijn onder andere de controle van chromatine organisatie21, RNA transport22,23, RNA Editing24, en transcriptie1,2,3 . In tegenstelling, worden pi's vaak geassocieerd met de werving van eiwitten aan het plasma membraan of organel membranen25. Een opkomende eigenschap van pi's is echter het vermogen om te associëren met eiwitten in een niet-membraneuze omgeving3,15,19,26. Dit is het geval van de nucleaire receptor steroidogenic factor, welke transcriptionele controlefunctie wordt gereguleerd door PI (3, 4, 5) P319, en poly-A polymerase welke enzymatische activiteit wordt gereguleerd door Nuclear PI (4, 5) P226. Een regelgevende rol voor IPS en pi's is aangetoond in vele organismen, waaronder gist22,27, zoogdiercellen19,23, Drosophila10 en Worms28. Van betekenis is de rol van deze metabolieten in trypanosomes, die vroeg van de eukaryotische afstamming afwijken. Deze metabolieten spelen een essentiële rol in Trypanosoma brucei Transcriptionele controle1,3, ontwikkeling8, Organel biogenese en eiwit verkeer29,30 , 31 , 32, en zijn ook betrokken bij het beheersen van de ontwikkeling en infectie in de pathogenen T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 en Plasmodium 5 , 37. Vandaar dat het begrijpen van de rol van IPS en pi's in trypanosomen kan helpen om nieuwe biologische functie voor deze moleculen te verhelden en om te bepalen nieuwe geneesmiddel doelen.

De specificiteit van eiwitten en IP of pi binding hangt af van de eiwit-interactie domeinen en de fosforylatie toestand van de inositol13,38, hoewel interacties met het lipide deel van pi's ook voorkomt19. De verscheidenheid van IPs en Pi's en hun modificerende kinases en fosfatasen biedt een flexibele cellulaire mechanisme voor het beheersen van de eiwit functie die wordt beïnvloed door de beschikbaarheid van de metaboliet en overvloed, de fosforylering staat van de inositol, en eiwitten affiniteit van interactie1,3,13,38. Hoewel sommige eiwit domeinen goed gekarakteriseerd zijn39,40,41, bijvoorbeeld, pleckstrin homologie domein42 en SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domeinen43 ,44,45, sommige eiwitten interactie met IPS of pi's door mechanismen die onbekend blijven. Bijvoorbeeld, de repressor-Activator proteïne 1 (RAP1) van T. brucei mist canonieke Pi-bindende domeinen maar communiceert met PI (3, 4, 5) P3 en controle transcriptie van genen die betrokken zijn bij antigene variatie3. Affiniteits chromatografie en massaspectrometrie analyse van IP-of pi-interactie eiwitten van trypanosome, gist of zoogdiercellen identificeerden verschillende eiwitten zonder bekende IP-of pi-bindende domeinen8,46, 47. de gegevens suggereren aanvullende niet-gekarakteriseerde proteïne-domeinen die aan deze metabolieten binden. Vandaar dat de identificatie van eiwitten die interageren met IPs of Pi's nieuwe mechanismen van eiwit-metaboliet interactie en nieuwe cellulaire regelgevende functies voor deze kleine moleculen kunnen onthullen.

De hier beschreven methode maakt gebruik van affiniteits chromatografie gekoppeld aan westerse blotting of massaspectrometrie om eiwitten te identificeren die aan IPs of Pi's binden. Het maakt gebruik van biotinyleerd IPS of pi's die ofwel kruislings gekoppeld aan streptavidine geconjugeerd aan agarose kralen of als alternatief, gevangen via streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen (Figuur 1). De methode biedt een eenvoudige workflow die gevoelig, niet-radioactief, liposoom vrij en is geschikt voor het opsporen van de binding van eiwitten uit cel lysaten of gezuiverde eiwitten3 (Figuur 2). De methode kan worden gebruikt in etiket vrij8,46 of gekoppeld aan aminozuur-gelabelde kwantitatieve massaspectrometrie47 om IP-of pi-bindende eiwitten van complexe biologische monsters te identificeren. Vandaar, deze methode is een alternatief voor de weinige methoden die beschikbaar zijn voor het bestuderen van de interactie van IPS of pi's met cellulaire eiwitten en zal helpen bij het begrijpen van de regelgevende functie van deze metabolieten in trypanosomen en misschien andere eukaryoten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. analyse van IP-of PI-bindende eiwitten door affiniteits chromatografie en Western blotting

  1. Celgroei, lysis en affiniteits chromatografie
    1. Groeien T. brucei cellen naar mid-log fase en bewaken cel levensvatbaarheid en dichtheid. Een totaal van 5,0 x 107 cellen is voldoende voor één bindende assay.
      1. Voor bloedstroom vormen, kweekcellen in HMI-9 Media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 °C en 5% CO2. Houd de celdichtheid tussen 8,0 x 105 tot 1,6 x 106 cellen/ml.
        Opmerking: dichtheid hoger dan 1,8 x 106 cellen/ml kan invloed hebben op de levensvatbaarheid van de cel. De verdubbelingstijd van T. brucei 427 stam geteeld in vitro is tussen 5,5 en 6,5 h.
      2. Voor procyclische vormen, kweekcellen in SDM-79 medium aangevuld met 10% FBS bij 27 ° c en houd de celdichtheid tussen 1,0 x 107 en 3,0 x 107 cellen/ml.
      3. Voor gezuiverde eiwitten (bijv. recombinante eiwitten), neem 0,5 tot 1 μg eiwit en Verdun in 450 μL bindende buffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl-fenyl-Polyethyleenglycol, pH 7,4). Houd 5% van het verdunde eiwit (input) voor de Western Blot-analyse. Ga verder naar stap 1.1.7.
    2. Centrifugeer cellen bij 1.600 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatant weg.
      Opmerking: Zie stap 2.1.2 voor aanvullende informatie over het centrifugeren van grote kweek volumes.
    3. Breng de pellet voorzichtig over in 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing pH 7,4 aangevuld met 6 mM glucose (PBS-G) en voorverwarmd bij 37 °C om de cellen te wassen. Centrifugeer vervolgens de cellen op 1.600 x g gedurende 5 minuten bij RT. Herhaal de procedure tweemaal.
    4. Respendeer de pellet in 1 mL PBS-G. Breng het volume vervolgens over naar een buis van 1,5 mL en centrifugeer bij 1.600 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg.
      Opmerking: Celpellets kunnen in vloeibare stikstof worden bevroren en bij-80 °C of vloeibare stikstof worden bewaard.
    5. Respendeer de pellet in 0,5 mL lysisbuffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-octylphenoxypolyexyethanol, pH 7,4) aangevuld met 1.5 x proteaseremmer cocktail en 1x fosfatase remmer cocktail (tafel van materialen) voorgekoeld in ijs tot Lyse de cellen. Inincuberen lysaat gedurende 10 minuten bij een rotatie van 50 rpm bij 4 °C.
      Opmerking: dit is een kritieke stap omdat eiwitten kunnen afnemen als ze niet worden behandeld zoals aangegeven. Controleer de integriteit van eiwit lysaat door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel elektroforese (SDS/PAGE) indien nodig.
      Let op: T-octylphenoxypolyethoxyethanol is giftig en kan huid-en oogirritatie veroorzaken. Gebruik handschoenen, Eyeshield en gelaatschermen bescherming.
    6. Centrifugeer het lysaat bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Verzamel de supernatant in een nieuwe 1,5 mL tube voor bindende assays. Houd 5% van het totale lysaat (input) voor Western blotting analyse. Het supernatant bevat parasieteiwitten geëxtraheerd met lysisbuffer.
    7. Verzamel 50 μL IPs of Pi's die zijn geconjugeerd met agarose-parels (d.w.z. 50 μL slurry) of 50 μL agarose-parels en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g. Gooi de supernatant weg en regeer in 50 μL bindings buffer om de kralen te equilibreren. Gebruik niet-geconjugeerde kralen als een controle. Gebruik IP/PI-kralen met verschillende fosfaat configuratie, inclusief niet-gefosforyleerde vormen om te controleren op niet-specifieke interacties.
    8. Voeg 50 μL IP-of PI-kralen toe aan het celllysaat of de gezuiverde eiwitten (elke 1 mL kralen bevat 10 nmol geconjugeerd IPs of Pi's). Houd het volume van IP-of pi-kralen binnen 10% van het totale lysaat en pas indien nodig het bindings reactievolume aan met de bindings buffer.
      1. Voor concurrentie testen, voeg toe aan de bindende reactie verschillende concentraties van niet-geconjugeerde IPs of Pi's (bijvoorbeeld 1-, 10-, 100-voudige molaire overmaat in vergelijking met IP-of PI-kralen).
    9. Inincuberen de reactie gedurende 1 uur, of 's nachts, bij 4 °C en draaiend bij 50 rpm.
      Opmerking: bindende reacties met gezuiverde eiwitten kunnen bij RT worden gedaan, afhankelijk van de stabiliteit van het eiwit. Als het gebruik van IPs of Pi's geconjugeerd aan biotine alleen doorgaan naar stap 1.1.9.1, ga dan verder naar stap 1.1.10.
      1. Voeg 50 μL streptavidine-geconjugeerd aan magnetische kralen toe aan de bindings reactie en incuberen gedurende 1 uur bij 4 °C, draaibaar bij 50 rpm.
    10. Centrifugeer de mix gedurende 1 minuut bij 1.000 x g bij 4 °c. Verwijder de supernatant (doorstroom) en houd de pellet. Houd 5% van de supernatant voor de Western Blot-analyse.
      Opmerking: als u magnetische kralen gebruikt, verwijdert u supernatanten en voert u daaropvolgende wassingen uit met behulp van een magnetische standaard (centrifugaties zijn niet nodig).
    11. Voeg 1 mL wasbuffer (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl fenyl-Polyethyleenglycol, pH 7,4) toe en hervat de hars door op de buis te tikken of te zwenken (gebruik geen pipet omdat kralen aan pipetpunten kunnen worden bevestigd). Centrifugeer de reactie 1 minuut bij 1.000 x g bij 4 °c en gooi het supernatant weg. Herhaal de procedure voor een totaal van vijf wast.
      Let op: 4-nonyl-fenyl-polyethyleenglycol is giftig en kan huid-en oogirritatie veroorzaken. Gebruik handschoenen, Eyeshield en gelaatschermen bescherming.
    12. Voeg toe 50 μL 2x Laemmli buffer aangevuld met 710 mM 2-mercaptoethanol aan de kralen en meng door te tikken of Vortex om de eiwitten te elzen. Verwarm gedurende 5 minuten tot 95 °C en Centrifugeer gedurende 1 minuut voor 10.000 x g en verzamel het supernatant (bevat elerekende eiwitten). Als alternatief, Elueer eiwitten met 8 M ureum/100 mm Glycine pH 2,9 om te voorkomen dat het gebruik van SDS. Vries het eluaat op-80 °C, ga verder naar de Western Blot analyse.
      Let op: 2-mercaptoethanol is giftig en kan huid, oog en respiratoire irritaties veroorzaken. Gebruik handschoenen en werk in de chemische afzuigkap.
  2. Westerse blotting analyse
    1. Meng 15 μL input (vanaf stap 1.1.6) of doorstroom (vanaf stap 1.1.10) met 5 μL 4x Laemmli-buffer. Warmte-inbreng en doorstroom monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C. Meng voor monsters van 8 M ureum/100 mM Glycine pH 2,9, 15 μL eluaat met 5 μL 4x Laemmli-buffer en Verwarm gedurende 5 minuten bij 95 °C.
      Opmerking: deze stap is niet nodig voor monsters die zijn opgenomen in 2x Laemmli-buffer.
    2. Laad putten van 4-20% SDS/PAGE gel met 2,5 μL input, doorstroming van 2,5 μL en 20 μL van de voorzijde, en de belasting proteïne ladder volgens de aanbeveling van de fabrikant.
      Opmerking: Kies gel% volgens het molecuulgewicht van het eiwit van belang.
    3. Voer SDS/PAGE uit op 150 V voor 30-45 min in lopende buffer, of totdat de blauwe kleurstof van de Laemmli-buffer zich aan het einde van de gel bevindt.
      Opmerking: het tijdstip van uitvoering kan variëren afhankelijk van de laboratoriumapparatuur.
    4. Verwijder de gel van de glas (of plastic) platen, en geniet van de overdrachts buffer gedurende 15 minuten.
    5. Breng de eiwitten over naar polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan of nitrocellulose membraan. Dompel membranen en 3 mm filtreerpapier in overdrachts buffer. Monteer een sandwich met drie vellen filtreerpapier, nitrocellulose of PVDF-membraan, gel en nog drie vellen filtreerpapier. Zorg ervoor dat er geen luchtbelletjes in de sandwich zitten. Gebruik een roller om bubbels te verwijderen indien nodig. Stel het membraan op de kathode en de gel op de anode-zijde van de cassette.
      Opmerking: Raadpleeg de instructies van de membraan fabrikant voor informatie over membraan activering of DEP-voorbereiding.
    6. Plaats de cassette met de sandwich in de overdrachts tank met overdrachts buffer. Plaats de tank in een ijsemmer of bij 4 °C (bijvoorbeeld in de koude ruimte). Overdracht eiwitten op 100 V voor 1 h (stroom varieert tussen 200-400 mA). U ook overnachten bij een constante stroom van 15 mA bij 4 °C.
    7. Verwijder het membraan uit de cassette. Inbroed het membraan in 6% niet-vette droge melk verdund in PBS met 0,05% Polysorbaat 20 (PBS-T), of compatibele blokkerende oplossing, voor 1 uur bij RT om het membraan te blokkeren.
      Opmerking: voordat u het membraan blokkeert, kan de kwaliteit van de overdracht worden gecontroleerd met behulp van Ponceau S Stain. Inbroed het membraan gedurende 1 minuut in 15 mL Ponceau S, spoel in water en visualiseer bands.
    8. Verwijder de blokkerende oplossing en inbroed het membraan gedurende 1 uur bij RT met 50 rpm rotatie in primaire antilichamen verdund in 6% niet-vette droge melk verdund in PBS-T. U het membraan ook 's nachts op 4 °C inbroed met een rotatie van 50 rpm.
      Opmerking: de incubatietijd kan variëren naargelang de kwaliteit van de antilichamen; de meeste antilichamen werken echter met incubaties van 1-3 uur bij RT. Volg de aanbeveling van de fabrikant voor antilichamen concentratie of verdunning.
    9. Was de vlek door het membraan in PBS-T gedurende 5 minuten te bebroed met een rotatie van 50 rpm bij RT. Herhaal de procedure 3-5 keer. Afhankelijk van de kwaliteit van antilichamen kunnen er meer wasstoffen nodig zijn.
    10. Inbroed het membraan in mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen voor 1 uur op RT in 6% niet-vette droge melk verdund in PBS-T met 50 rpm rotatie.
      Opmerking: Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor de concentratie of verdunning van de antilichamen.
    11. Was de vlek zoals aangegeven in stap 1.2.9.
    12. Voeg het chemiluminescentie substraat toe om het membraan te bedekken. Verwijder de overmaat aan substraat en inincuberen gedurende 5 min bij RT in het donker.
      Opmerking: Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor aanbevelingen over de chemiluminescentie reagentia.
    13. Leg het chemiluminescentie signaal vast met behulp van een camera-gebaseerde Imager. U ook een X-ray film gebruiken om het chemiluminescentie signaal vast te leggen.

2. analyse van IP/PI-bindende eiwitten door affiniteits chromatografie en massaspectrometrie

  1. Celgroei, lysis en affiniteits chromatografie
    1. Groeien T. brucei cellen naar mid-log fase en bewaken cel levensvatbaarheid en dichtheid.
      Opmerking: een totaal van 1,0 x 1010 cellen is genoeg voor twee bindende assays. Het gebruik van minder cellen dan hier aangegeven kan invloed hebben op de detectie van lage overvloed eiwitten door massaspectrometrie.
      1. Voor T. brucei bloedstroom vormen, groeicellen in de mid-log fase (8,0 x 105-1,6 x 106 cellen/ml) in HMI-9 Media aangevuld met 10% FBS bij 37 °c en met 5% Co2. Voor 427 stam zal 5 L cultuur 0,5-1,0 x 1010 cellen opleveren. Bewaak de celgroei om dichtheid hoger dan 1,8 x 106 cellen/ml te voorkomen die de levensvatbaarheid van de cel kunnen beïnvloeden. Houd het celkweek volume op 1/10 van het kolf volume; anders zal de groeisnelheid van de cellen worden beïnvloed als gevolg van slechte beluchting.
        Opmerking: de 427-stam heeft een verdubbelingstijd van 5,5-6,5 uur.
      2. Voor procyclische vormen, kweekcellen in SDM-79 medium aangevuld met 10% FBS bij 27 ° c en houd de celdichtheid tussen 1,0 x 107 en 3,0 x 107 cellen/ml. 500 mL cultuur zal 0,5-1,5 x 1010 cellen opleveren.
    2. Centrifugeer de cellen op 1.600 x g gedurende 15 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en breng de pellet in 200 ml PBS-g voorverwarmd bij 37 °c. Gebruik ronde bodem centrifugeren buizen (tabel van materialen) omdat T. brucei bloed vorm pellets zijn gemakkelijk verstoord bij het gebruik van vaste-hoek centrifuge rotors. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 1.600 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    3. Verwijder de supernatant en rebreng de pellet in 10 mL PBS-G. Centrifugeer de cellen op 1.600 x g gedurende 5 minuten bij RT. Herhaal de procedure en na de laatste wasbeurt, gooi het supernatant weg.
      Opmerking: pellets kunnen in vloeibare stikstof worden bevroren en bij-80 °C of vloeibare stikstof worden bewaard.
    4. Respendeer de celpellet in 5 mL lysisbuffer voorgekoeld in ijs en aangevuld met 1,5 x cocktail van proteaseremmers en 1x fosfatase inhibitor cocktail (tafel van materialen). Inbroed het lysaat gedurende 10 minuten bij 4 °C, draaibaar bij 50 TPM.
    5. Centrifugeer het lysaat bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Verzamel de supernatant (opgeloste eiwitten) en Verdun het in 20 mL bindende buffer.
    6. Verzamel 400 μL IPs of Pi's die zijn geconjugeerd met agarose-parels (d.w.z. 400 μL drijfmest) of 400 μL controle kralen, en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g bij RT. Gooi de supernatant weg en resuspendeer in 400 μL van de bindende buffer om de parels te evenwichts- Gebruik agarose-kralen als een negatieve controle om specifieke verrijking van interacties van eiwit metaboliet te bepalen in vergelijking met niet-specifieke interacties (bijv. eiwitten die niet specifiek binden aan de kralen). Gebruik IPs of Pi's met verschillende fosfaat configuraties, inclusief niet-gefosforyleerde vormen om te controleren op niet-specifieke interacties als gevolg van fosfaat heffingen of binding aan biotine.
    7. Voeg 400 μL IP/PI-kralen of controle kralen toe aan 10 mL lysaat en geïnincubeerd voor 1 uur, of 's nachts, bij 4 °C draaibaar bij 50 rpm. Als het gebruik van IPs of Pi's geconjugeerd met biotine alleen (zonder kralen) Ga verder naar stap 2.1.7.1, ga anders naar stap 2.1.8.
      1. Voeg 100 μL streptavidine-geconjugeerd aan magnetische kralen toe en incuberen gedurende 1 uur bij 4 °C, draaibaar bij 50 rpm.
    8. Centrifugeer de bindings reactie 1 minuut bij 1.000 x g bij 4 °c. Verwijder de supernatant (doorstroom) en houd de pellet. Houd 5% van de supernatant voor de Western Blot-analyse.
    9. Voeg 5 mL wasbuffer toe aan de pellet, meng zachtjes door de buis te zwengelen en centrifugeer vervolgens 1 minuut bij 1.000 x g bij 4 °c. Gooi het supernatant weg. Herhaal de wasbeurt vijf keer. Bij gebruik van magnetische kralen, het verzamelen van supernatanten en het uitvoeren van wasmiddelen met behulp van een magnetische standaard (centrifugaties zijn niet nodig).
    10. Voeg 50 μL 2x Laemmli-buffer (of 8 M ureum/100 mM Glycine pH 2,9, om te voorkomen dat u SDS gebruikt) toe aan de kralen en meng door te tikken of Vortex (Vermijd pipetteren omdat kralen aan pipetpunten kunnen worden bevestigd) en verwarm vervolgens gedurende 5 minuten op 95 °C. Centrifugeer gedurende 1 minuut voor 10.000 x g en verzamel de supernatant (eluteerde eiwitten). Herhaal de procedure tweemaal om in totaal drie fracties te verzamelen.
    11. Vries het eluaat op-80 °C, anders worden de eiwitten in SDS/PAGE gescheiden of in de oplossing bewaard voor trypsinoisatie en massaspectrometrie analyse.
  2. Trypsine vertering van eiwitten voor massaspectrometrie
    Opmerking: twee variaties van deze procedure worden weergegeven voor punt 2.2.1 (in gel) of paragraaf 2.2.2 (in oplossing) vertering van eiwitten. Eiwit lage binding buizen worden aanbevolen om te voorkomen dat monster verliezen. Overleg met een analytische scheikundige in de proteomica faciliteit de geschiktheid van het protocol voor monsters en massaspectrometer instrumenten beschikbaar.
    1. In-gel trypsinoisatie van eiwitten
      1. Spoel na eiwit scheiding in SDS/PAGE de gel kort uit in water met hoge zuiverheid. Breng de gel op een schone glasplaat. Accijnzen eiwit banden met een schoon mes en Vermijd snijden extra gel buiten bands. Snijd de gelstukken in kleine stukjes (d.w.z. ongeveer 1 mm vierkant) en breng ze over in een buis van 1 mL. Gebruik indien nodig een pipetpunt, maar zorg ervoor dat de pipetpunt vóór gebruik in ethanol wordt gespoeld.
        Opmerking: gebruik handschoenen om gel besmetting te voorkomen. Gelstukken kunnen bij-20 °C worden bewaard.
      2. Voeg 100 μL high-purity of high-performance vloeibare chromatografie kwaliteit water toe aan buizen om gelstukken te spoelen. Gooi het water weg.
        1. Voor Coomassie of ruthenium-gebaseerde fluorescerende gekleurde gelstukken, inbroed de gelstukken in ontkleurings oplossing (25 mM NH4HCO3 in 50% acetonitril) voor 1 uur, en gooi de oplossing dan weg. Herhaal de procedure totdat de kleuring niet zichtbaar is.
          Opmerking: bereid oplossingen met NH4HCO3 voor door verdunning van een stockoplossing bij 100 mm NH4HCO3, pH 7,8.
          Let op: acetonitril is een vluchtig oplosmiddel, ontvlambaar en giftig. NH4HCO3 kan huid-of oogirritatie veroorzaken. Gebruik handschoenen en werk onder een chemische kap.
        2. Voor zilvergekleurde gelstukken, incuberen gelstukken in 50 μL ontkleurings oplossing voor zilver kleuring (15 mM K3[FE (CN)6], 50 mm na2S2O3) in water gedurende 30 min. Gooi de oplossing weg en was gelstukken met 200 μL van water. Herhaal wassen vijf keer of tot gel gele kleur is niet zichtbaar.
          Let op: K3[FE (CN)6] kan huid-of oogirritatie veroorzaken. Gebruik handschoenen.
      3. Dehydraat de gelstukken met 200 μL acetonitril gedurende 10 minuten bij RT. Gooi de oplossing vervolgens weg.
        Let op: gedehydrateerde gelstukken zijn kleiner in volume, ondoorzichtig en smakend. Als meerdere stukjes gel worden gecombineerd in één buis, herhaalt u de procedure voor efficiënte uitdroging van gelstukken.
      4. Voeg 50 μL (of voldoende volume toe om de gelstukken te bedekken) van de reducerende oplossing (10 mm dithiotreïtol [DTT] in 100 mm NH4HCO3) en inbroed bij 56 °c gedurende 1 uur. daarna, koel de buizen om RT en gooi de overmaat van Reduceer oplossing.
      5. Voeg 50 μL (of voldoende volume om de gelstukken te bedekken) van de alkylatie oplossing (50 mM iodoacetamide in 100 mM NH4HCO3) toe en inbroed gedurende 30 minuten bij RT in het donker. Gooi daarna het teveel aan alkylatie oplossing weg.
      6. Dehydraat de gelstukken met 200 μL acetonitril gedurende 10 min bij RT. Verwijder de acetonitril en hydrateer de gelstukken met 100 mM NH4HCO3 gedurende 10 min bij RT.
      7. Dehydraat de gelstukken opnieuw met 200 μL acetonitril gedurende 10 minuten bij RT en gooi het teveel aan oplossing weg.
      8. Voeg 15 μL massaspectrometrie graad trypsine toe, verdund in 50 mM NH4HCO3 -buffer, of voldoende volume om gehydrateerde gelstukken te bedekken en gedurende 4 uur of 's nachts bij 37 °c te inbrokken. Houd totale trypsine-bedragen tussen 100 tot 500 ng (of 20 ng trypsine/μg eiwit).
      9. Laat het monster afkoelen tot RT en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 2.000 x g in een micro centrifuge. Voeg 10-20 μL van 5% mierenzuur toe, verdund in water, en incuberen gedurende 10 minuten bij RT.
        Let op: mierenzuur is ontvlambaar, corrosief en giftig. Gebruik handschoenen en werk onder een chemische kap.
      10. Centrifugeer zoals aangegeven in stap 2.2.1.9, verzamel dan de supernatant (bevatten geëxtraheerde peptiden) naar een andere buis. Voeg 20 μL van 5% mierenzuur verdund in 50-60% acetonitril toe aan de buis en inincuberen gedurende 10 minuten bij RT. Verzamel geëxtraheerde peptide fracties in dezelfde buis.
      11. Droog het monster in een vacuüm concentrator en reconstitueer in 10 μL van 0,5% azijnzuur en 2% acetonitril voor massaspectrometrie analyse. Centrifugeer en verzamel de oplossing aan de onderkant van de buis; winkel oplossing bij-20 °C of-80 °C.
    2. In oplossing trypsinisatie van eiwitten
      1. Precipitaat eiwitten om monstervolume te verminderen, desalting, en buffer uitwisseling. Voeg zes volumes gekoeld (-20 °C) aceton toe aan het monster, bijvoorbeeld 600 μL aceton tot 100 μL monster. Vortex en incuberen bij-20 °C gedurende 15 minuten tot 1 uur. De oplossing zal troebel worden of een neerslaan vormen.
        VOORZICHTIG: aceton is giftig en ontvlambaar. Gebruik handschoenen en werk onder een chemische kap.
      2. Centrifugeer monsters bij 4 °C gedurende 30 min. Giet de aceton en lucht drogen de pellet gedurende 15 min.
      3. Voeg 10 μL van 6-8 M ureum of 1% SDS in 50 mM NH4HCO3 toe om de pellet en Vortex op te lossen om te mengen. Gebruik voor grotere hoeveelheden eiwitten (> 10 μg) maximaal 20 μL oplos buffer.
      4. Voeg 5 μL reducerende oplossing en Vortex toe. Draai het volume omlaag met een micro centrifuge. Als de monsters in ureum worden verdund, inbroed dan voor 1 uur bij RT. Als de monsters worden verdund in SDS, vervolgens geïnineerd gedurende 1 uur bij 56 °C.
      5. Draai het volume omlaag met een micro centrifuge. Voeg 3 μL alkylatie oplossing en Vortex toe. Draai vervolgens het volume omlaag en inbroed 30 minuten in het donker bij RT.
      6. Voeg 3 μL reducerende oplossing toe om de reactie te neutraliseren. Verdun het monster langzaam tot 1 M ureum of 0,05% SDS met 50 mM NH4HCO3.
        Opmerking: trypsine-vergistings buffer moet detergens of denaturerende middelen hebben. Concentratiegrenzen voor denaturantia zijn: 0,05% SDS; 0,1% octyl B-D-glucopyranoside; 0,1% 4-nonylfenyl-polyethyleenglycol; 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol; 0,1% Polysorbaat 20; 0,1% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonaat; < 1 M ureum of thiourea.
      7. Voeg 5 μL massaspectrometrie graad trypsine toe, verdund in 50 mM NH4HCO3 -buffer en inincuberen gedurende 4 uur of 's nachts bij 37 °c. Houd totale trypsine-bedragen tussen 100 en 500 ng (of 20 ng trypsine/μg eiwit).
      8. Koel het monster af naar RT en draai het volume omlaag met een micro centrifuge. Voeg 5% azijnzuur (of 5% mierenzuur in 50% acetonitril) toe om de reactie te doven.
      9. Droog de monsters in een vacuüm concentrator zoals aangegeven in stap 2.2.1.11. Bewaar samples bij-80 °C. Desalt en concentraat peptiden met behulp van een omgekeerde fase kolom zoals C18 zip-Tip en vervolgens analyseren door massaspectrometrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse van RAP1 en PI (3, 4, 5) P3-interactie door affiniteits chromatografie en Western blotting
Dit voorbeeld illustreert de toepassing van deze methode voor het analyseren van de binding van pi's door RAP1 van t. brucei lysaat of door recombinant t. brucei RAP1 eiwit. Lysates van T. brucei bloedbaan vormen die Express gemaggljutininovuju (ha)-tagged RAP1 werden gebruikt in bindende assays. RAP1 is een eiwit dat betrokken is bij Transcriptionele controle van variant oppervlak glycoproteïne (VSG) genen3,48, die coderen voor oppervlakte-eiwitten die betrokken zijn bij parasiet immuun ontduiking door antigene variatie49. RAP1 interageert binnen een telomerische eiwit complex met de phosphatidylinositol 5-fosfatase (PIP5Pase) enzym3, die ook functioneert in de controle van VSG Gene transcriptie1,3. RAP1 heeft een N-terminale borstkanker 1 carboxyl-Terminal (brct) domein dat wordt gevolgd door een myeloblastose (myb) DNA-bindende domein en een C-Terminal myb-achtige domein3,48. Echter, het mist canonieke PI binding domeinen. Bindende assays werden uitgevoerd met Pi's die niet-fosforyleerd zijn of zijn gefosforyleerd op verschillende posities van de inositol-ring, en met niet-geconjugeerde agarose kralen. Westerse analyse toont aan dat RAP1 bij voorkeur bindt aan PI (3, 4, 5) P3-kralen (Figuur 3A), maar het bindt ook in mindere mate aan PI (4, 5) P2-kralen. Echter, het niet binden aan een andere Pi's of agarose kralen. Omdat RAP1 deel uitmaakt van een multiproteïne complex3, is de interactie met sommige pi's mogelijk niet direct en dus het resultaat van RAP1-ha interactie met andere cellulaire eiwitten die binden aan pi's.

Daarom, om te testen of RAP1 rechtstreeks aan Pi's bindt, werd een C-terminaal gelabeld 6x-zijn recombinant RAP1 (rRAP1) eiwit uitgedrukt en gezuiverd tot homogeniteit van E. coli3. Het eiwit werd gebruikt in bindende assays met PI (3, 4, 5) P3-kralen in aanwezigheid van concurrerende concentraties van PI (3, 4, 5) P3 of PI (4, 5) P2. Western blotting toont aan dat het verhogen van de concentraties van PI (3, 4, 5) P3, maar niet PI (4, 5) P2 de interactie van rRAP1 met PI (3, 4, 5) P3 remt (Figuur 3B). Bovendien is de toevoeging van T. brucei gezuiverd PIP5Pase enzym aan de reactie hersteld PI (3, 4, 5) P3-bindend door rRAP1, wat te wijten is aan PIP5Pase defosforylering van vrije PI (3, 4, 5) P33 en geeft dus aan dat het fosforylatiepatroon van deze metaboliet is essentieel voor rRAP1 binding. Vandaar, rRAP1 samenwerkt met PI (3, 4, 5) P3 zoals het doet RAP1-HA van T. brucei lysates. Bovendien blijkt uit de gegevens dat de binding van RAP1-ha van lysaat tot pi (4, 5) P2 waarschijnlijk voortvloeit uit RAP1 interactie met andere eiwitten in het complex (bijv. PIP5Pase)3. De gegevens illustreren de complementariteit van bindende assays met cellysaten en recombinant eiwitten. Het toont ook het nut van concurrerende bindende assays om de specificiteit van de interacties tussen eiwitten en Pi's te bepalen.

Identificatie van ins (1, 4, 5) P3-bindende eiwitten door affiniteits chromatografie en massaspectrometrie
In dit voorbeeld werd affiniteits chromatografie gevolgd door massaspectrometrie gebruikt om T. brucei eiwitten te identificeren die binden aan ins (1, 4, 5) P3; Daarom, het experiment enquêtes potentiële ins (1, 4, 5) P3 bindende eiwitten uit T. brucei bloedbaan vormen. T. brucei lysaat werd geïncasseerd met ins (1, 4, 5) P3 geconjugeerd met agarose kralen of met niet-geconjugeerde kralen (gebruikt als een controle), en gebonden eiwitten werden geelkaniseerd met Laemmli sample buffer. SDS/PAGE-analyse toont verrijking in eiwitten uit ins (1, 4, 5) P3-kralen in vergelijking met eiwitten die worden geeleerd uit de controle agarose-parels (Figuur 4A). Massaspectrometrie analyse van geelerede eiwitten geïdentificeerd over 250 eiwitten, waarvan 84 zijn verrijkt met ins (1, 4, 5) P3 kralen in vergelijking met controle kralen (Figuur 4B, vouw verandering [FC] ≥ 2, p < 0,05). De verrijking van eiwitten gebonden aan ins (1, 4, 5) P3 in vergelijking met controle kralen correleert met het eiwit signaal gedetecteerd door SDS/pagina. De gegevens omvatten eiwitten die werden gevalideerd om ins te binden (1, 4, 5) P3 en eiwitten welke mechanismen van binding aan ins (1, 4, 5) P3 zijn niet bekend8. Bovendien verschoof de ins (1, 4, 5) P3 binding Proteoom sterk van die van ins (1, 3, 4, 5) P4 en andere pi's8, wat suggereert dat sommige van deze eiwitten de specifieke fosfaat configuratie van ins (1, 4, 5) P3 herkennen. Daarom kunnen Biotine-gelabelde ins (1, 4, 5) P3 worden gebruikt voor affiniteits chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie om eiwitten te identificeren die binden aan ins (1, 4, 5) P3. De aanpak kan worden onderzocht om eiwitten te identificeren die zich binden aan andere IPS of pi's3,8,46,47.

Figure 1
Figuur 1 : Affiniteits reagentia voor bindende assays. A) PI (3, 4, 5) P3 (boven) en ins (1, 4, 5) P3 (onder) geconjugeerd met biotine op SN1-positie van de inositol. In PI (3, 4, 5) P3 wordt het Biotine geconjugeerd tot de lipide-keten op SN1-positie van de inositol, terwijl in ins (1, 4, 5) P3 het biotine wordt geconjugeerd tot het fosfaat op positie SN1. B) ins (1, 4, 5) P3 wordt geconjugeerd met biotine en vastgelegd via binding aan streptavidine geconjugeerd met kralen (bijv. agarose of magnetische kralen). Variaties van deze reagentia met behulp van aangepaste gesynthetiseerde linkers die de Biotine vervangen zijn ook mogelijk46. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : De workflow van protocollen beschrijft de stappen voor de analyse van IP-of pi-affiniteits interactie met eiwitten van T. brucei en detectie door (A) westerse blotting of (B) massaspectrometrie. AC-WB, affiniteits chromatografie en Western blotting; WISSELSTROOM-MS, affiniteits chromatografie en massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Binding van T. brucei RAP1 aan fosfoinositides. A) lysaten van T. brucei (5,0 x 107 parasieten) die met ha-Tagged RAP1 zijn gebroed voor 2 uur bij 4 °c met 50 μL pi's (elke 1 ml agarose kralen met 10 nmol van geconjugeerde Pi's) of agarose (AG) kralen. De bindende reactie werd gewassen en met 2 x Laemmli monster buffer gespoeld en verhit tot 95 °C gedurende 5 min. eiwitten werden gescheiden in 4-20% SDS/pagina, overgebracht naar een PVDF-membraan, en gepropaxeerd met monoklonale antilichamen anti-HA (1:5000, verdund in 6% PBS-melk), gevolgd door anti-muis IgG-HRP (1:5000, verdund in 6% PBS-melk), en gedetecteerd door chemiluminescentie. B) één μg rRAP1 werd gedurende 1 uur geïnineerd bij RT met 50 μL PI (3, 4, 5) P3-agarose kralen in de aanwezigheid of afwezigheid van 5 tot 50 μM dioctanoylglycerol (DIC8) PI (3, 4, 5) P3, 20 tot 50 ΜM diC8 PI (4, 5) P2, of 50 ΜM diC8 PI (3, 4, 5) p3 en 250 ng PIP5Pase gezuiverd van T. brucei bloedbaan vormen3. Binding werd geanalyseerd door Western blotting met muis anti-zijn HRP monoklonale antilichamen (1:2000, verdund in 6% PBS-melk) en ontwikkeld door chemiluminescentie. Dit cijfer is gewijzigd van Cestari et al.3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 : Affiniteits chromatografie en massaspectrometrie analyse van T. brucei eiwitten die binden aan ins (1, 4, 5) P3. A) 10% sds/pagina analyse van T. brucei eiwitten die binden aan ins (1, 4, 5) P3-kralen of agarose kralen. Lysaten van 5,0 x 109 parasieten werden geïnineerd bij 4 °c gedurende 2 uur met 400 ΜL van ins (1, 4, 5) P3 geconjugeerd met agarose kralen of met agarose kralen zonder ins (1, 4, 5) P3 [1 ml kralen bevatten 10 nmol van geconjugeerde ins (1, 4, 5) P3]. De bindende reactie werd gewassen, geeleerd in 2 x Laemmli monster buffer en gekookt gedurende 5 min bij 95 °C. Eiwitten werden gescheiden in 10% SDS/pagina en gekleurd met Coomassie-kleuring (tabel met materialen). Pijlpunten tonen eiwitten die zijn verrijkt in ins (1, 4, 5) P3-kralen in vergelijking met agarose-kralen; cirkels duiden op eiwitten aanwezig in beide ins (1, 4, 5) P3-kralen en agarose kralen, en de beugel geeft aan eiwitten die aanwezig zijn in beide, maar zijn verrijkt in ins (1, 4, 5) P3-kralen in vergelijking met agarose kralen. B) punt-plot toont eiwitten geïdentificeerd door massaspectrometrie die zijn verrijkt in ins (1, 4, 5) P3-kralen in vergelijking met agarose kralen. Verrijking gedefinieerd door FC > 2 en p-waarde < 0,05. Vier biologische replicaten werden gebruikt voor agarose-kralen AC-MS, en drie biologische replicaten voor IP3-kralen AC-MS. fold-verandering van eiwitten geïdentificeerd in IP3-kralen versus agarose-kralen werd berekend met behulp van de intensiteit van de peptide spectra met behulp van MSstat50. Gedetailleerde resultaten en lijst van peptiden zijn beschikbaar8. Mass spectrometrie RAW data is ook beschikbaar met identifier PXD005907 via het ProteomeXchange consortium via de PRIDE partner repository. Dit cijfer is gewijzigd van Cestari et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De identificatie van eiwitten die binden aan IPs of Pi's is van cruciaal belang om de cellulaire functie van deze metabolieten te begrijpen. Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie biedt de mogelijkheid om IP-of PI-interacties te identificeren en zodoende inzicht te krijgen in hun regelgevende functie. IPS of pi's die chemisch zijn gelabeld [bv., ins (1, 4, 5) P3 die chemisch zijn gekoppeld aan biotine] en gecrosslinkt naar agarose-parels via streptavidine of gevangen door streptavidine magnetische parels maakt het isoleren van de interactie eiwitten die vervolgens kunnen worden geïdentificeerd door massa spectrometrie of Western Blot. De hier beschreven protocollen zijn gebruikt om eiwitten van T. brucei3,8 en zoogdiercellen47 te identificeren die aan deze metabolieten binden. Variaties van de aanpak die gebruik maakt van aangepaste tags (andere dan Biotine) zijn ook gebruikt in gist46. Een belangrijke overweging bij deze aanpak is het gebruik van controles om specifieke discriminatie van niet-specifieke interacties te discrimineren. Niet-geconjugeerde kralen zijn een essentiële controle, maar aanvullende controles kunnen omvatten niet-fosforylated Pi's of inositol geconjugeerd aan kralen3. IPS of pi's met verschillende fosfaat combinaties3,8 kunnen ook worden gebruikt omdat eiwitbinding aan deze metabolieten kan betrekking hebben op domeinen die de fosfaat configuratie van de inositol38discrimineren, 39,40,41. Bovendien kan de complexiteit van het monster van invloed zijn op de gevoeligheid van de benadering, waardoor het verminderen van de monster complexiteit door fractionering van het monster de detectie van lage overvloedige eiwitten in de cel kan helpen. Er zijn goed gevestigde protocollen voor celfractionering en isolatie van mitochondrion51, Nucleus52, glycosome53, en flagellum54,55 van trypanosomes. Buffers en reagentia die in subcellulaire fractionaties worden gebruikt, moeten mogelijk worden aangepast voor compatibiliteit met buffers en reagentia die in dit protocol worden gebruikt. Met name de identificatie van eiwitten die binden aan IPs of Pi's door affiniteits chromatografie zoals hier aangegeven hangt af van de affiniteit van eiwitten en metaboliet van interactie, en dus eiwitten die een zwakke affiniteit hebben voor IPs of Pi's kunnen niet gemakkelijk worden gedetecteerd.

De analyse van IP-of PI-interactie met eiwitten uit cellysaat kan ook resulteren in de identificatie van eiwitten die niet rechtstreeks binden aan deze metabolieten, maar welke interactie voortvloeit uit de eiwit associatie in complex met andere eiwitten die aan IPs binden of Pi's. Deze functie is geïllustreerd in Figuur 3A, waarin RAP1-ha van T. brucei lysaat lijkt te binden aan PI (3, 4, 5) P3-kralen en Pi (4, 5) P2-kralen. Bindende assays met zijn-Tagged rRAP1 tonen echter aan dat dit eiwit bindt aan PI (3, 4, 5) P3 en niet aan PI (4, 5) P23. Dit wordt geïllustreerd in Figuur 3B, waarin competitieve assays aantonen dat vrije PI (3, 4, 5) P3 maar niet vrije PI (4, 5) P2 concurreert voor rRAP1-zijn interactie met PI (3, 4, 5) P3-kralen. De RAP1 schijn interactie met PI (4, 5) P2-kralen is te wijten aan RAP1 vereniging binnen een complex met eiwitten die binden PI (4, 5) P2 (bv, PIP5Pase)3. Daarom kunnen bindende assays van celllysates eiwitten identificeren die direct of indirect binden aan IPs of Pi's. Met name indirecte interacties onderscheiden zich van niet-specifieke interacties, aangezien de eerstgenoemde een biologische functie (in de context van het eiwit complex) kunnen hebben die invloed heeft op of wordt beïnvloed door de binding van de metaboliet. Bijvoorbeeld, ins (1, 4, 5, 6) P4 bindt aan de multi-subunit co-repressor deacetylase complex en regelt de complexe assemblage en activiteit13. Vandaar, het is essentieel om te valideren IP/PI interacties met eiwitten. De validatie van de interactie kan betrekking hebben op concurrentie testen met een overmaat aan IPS of pi's (zoals in Figuur 3B)3,8, mutaties van potentiële eiwit domeinen56, of het gebruik van gezuiverde eiwitten om Bepaal de directe interacties (Figuur 3A, B)3.

Andere methoden voor het bestuderen van eiwit-en IP-of pi-interacties omvatten de binding van eiwitten aan van IPS of pi's, het gebruik van IPS of pi's gebonden aan hydrofobe membranen als matrices voor eiwitinname, of de binding van eiwitten aan pi's die zijn opgenomen in liposomen 42 , 57 , 58. belangrijk, als eiwit interactie met pi's membraan structuren38vereist, kan Liposome gebaseerde assays worden gebruikt als een complementaire aanpak. Beperkingen van deze benaderingen omvatten lage doorvoer, lage gevoeligheid, de onbekende chemische oriëntatie van IPs of Pi's associatie met matrices58, of het gebruik van radioactieve materialen42. De hier beschreven methode is gevoelig, Liposome-vrij, niet-radioactieve, en IP/PI-kralen zijn commercieel beschikbaar, en dus vereisen ze geen aangepaste chemische synthese. Bovendien is de positie van het Biotine gekoppeld aan IPS of pi's goed gedefinieerd, en het kan ook worden gewijzigd46,58, die een precieze analyse van de interactie van eiwitten en metaboliet mogelijk maakt. De hier beschreven methode kan ook worden gecombineerd met kwantitatieve massaspectrometrie benaderingen zoals stabiele isotoop etikettering van aminozuren in celkweek (SILAC)47, die kan worden gebruikt om dynamische interacties te identificeren onder verschillende cellulaire behandelingen of voorwaarden. Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie heeft bijgedragen tot het identificeren van talrijke IP-of pi-bindende eiwitten van T. brucei, zoogdiercellen en gist3,8,46, 47, met inbegrip van eiwitten die geen gekarakteriseerde IP-of pi-bindende domeinen hebben, en het heeft ook bijgedragen aan de identificatie van nieuwe bindings domeinen, bijvoorbeeld PI (3, 4, 5) P3 binding domein47.

Over het algemeen kunnen de hier beschreven protocollen worden gebruikt om potentiële IP-of PI-interacties met eiwitten van T. bruceite onderzoeken en om de moleculaire interactie van eiwitten met deze metabolieten te bestuderen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast om IP-of PI-bindende eiwitten te identificeren van andere unicellulaire parasieten of van andere organismen zoals zoogdiercellen47 en gist46, en het zal helpen om de biologische functie van IPS en Pi's in eukaryoten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteur heeft niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery Launch supplement voor vroege loopbaan onderzoekers (DGECR-2019-00081) en door McGill University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent - control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Deze maand in JoVE probleem 149 inositol fosfaten phosphatidylinositol fosfoinositide eiwit interactie Trypanosoma metabolieten massaspectrometrie Western blotting affiniteits chromatografie
Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cestari, I. Identification of… More

Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter