Summary
このプロトコルは、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定に焦点を当てています。これは、アガロースまたは磁気ビーズにストレプトアビジンを介して固定化されたバイオチン化イノシトールリン酸塩またはリンオイノシチドとの親和性クロマトグラフィーを使用しています。イノシトールリン酸塩またはホスオイノシチド結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析によって同定される。
Abstract
イノシトールリン酸塩およびホスホイノシチドは、遺伝子発現、小胞の人身売買、シグナル伝達、代謝、および発達を含む真核生物のいくつかの細胞プロセスを調節する。これらの代謝産物は、タンパク質に結合することによってこの調節活性を実行し、それによってタンパク質の立体構造、触媒活性、および/または相互作用を変化させる。ここで説明する方法は、質量分析またはウェスタンブロッティングに結合されたアフィニティクロマトグラフィーを使用して、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドと相互作用するタンパク質を同定する。イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドは、化学的にビオチンでタグ付けされ、その後、アガロースまたは磁気ビーズに結合したストレプトアビジンを介して捕捉される。タンパク質は、代謝物との結合の親和性によって単離され、次いで、質量分析またはウェスタンブロッティングによってタンパク化され、同定される。この方法は、感度が高く、非放射性、リポソームフリー、カスタマイズ可能なシンプルなワークフローを備えており、タンパク質と代謝産物の相互作用を精度で解析できます。このアプローチは、ラベルフリーまたはアミノ酸標識定量質量分析法で、複雑な生物学的試料中のタンパク質代謝産物相互作用を同定したり、精製されたタンパク質を使用したりするために使用できます。このプロトコルは、トリパノソマブルーサイからのタンパク質の分析のために最適化されていますが、関連する原虫寄生虫、酵母または哺乳動物細胞に適応することができます。
Introduction
イノシトールリン酸塩(IP)とホスホイノシチド(POI)は、遺伝子発現1、2、3、小胞の人身売買などの細胞プロセスの調節を通じて、白質生物生物学において中心的な役割を果たしている。4、信号伝達5、6、代謝7、8、9、および発達8、10。これらの代謝産物の調節機能は、タンパク質と相互作用し、したがってタンパク質機能を調節する能力から生じます.タンパク質によって結合すると、IPおよびピは、タンパク質立体構造11、触媒活性12、または相互作用13を変化させ、したがって細胞機能に影響を与える。IPおよびPは、核2、3、14、15、小平性網膜16、17、プラズマなどの複数の細胞下コンパートメントに分布している。膜1およびサイトゾル18は、タンパク質3、19またはRNA20に関連する。
ホスホリパーゼCによる膜関連PI(4,5)P2の切断は、それぞれIPキナーゼおよびホスファターゼによってリン酸化または脱リン酸化されうるIns(1,4,5)P3の放出をもたらす。IPは、タンパク質に結合し、調節機能を発揮することができる可溶性分子です。例えば、メタゾンにおけるIns(1,4,5)P3は、IP3受容体に結合することによって第2のメッセンジャーとして作用することができ、これは受容体立体構造変化を誘導し、したがって細胞内ストア11からCa2+の放出を誘導する。Ins(1,3,4,5)P4はヒストンデアセチラーゼ複合体に結合し、タンパク質複合体の組み立ておよび活性13を調節する。IP調節機能の他の例は、クロマチン組織21、RNA輸送22、23、RNA編集24、および転写1、2、3の制御を含む.対照的に、ピニは、多くの場合、血漿膜またはオルガネラ膜25へのタンパク質の募集に関連する。しかし、新しいPの特性は、非membranous環境3、15、19、26のタンパク質と関連付ける能力である。これは、転写制御機能がPI(3,4,5)P319によって調節される核受容体ステロイド生成因子の場合であり、および酵素活性が核PI(4,5)P226によって調節されるポリAポリメラーゼである。IPおよびPIの調節的役割は、酵母22、27、哺乳動物細胞19、23、ショウジョウバエ10およびワーム28を含む多くの生物で示されている。重要なのは、真核系統から早期に発散したトリパノソームにおけるこれらの代謝産物の役割である。これらの代謝産物は、トリパノソマブルーサイ転写制御1、3、開発8、器官生体形成およびタンパク質トラフィック29、30において重要な役割を果たす,31歳,32、および病原体T.クルジ33、34、35、トキソプラズマ36およびプラスモジウムにおける発達および感染の制御にも関与している5,37.したがって、トリパノソームにおけるIPとPIの役割を理解することは、これらの分子の新しい生物学的機能を解明し、新しい薬物標的を同定するのに役立つ可能性がある。
タンパク質およびIPまたはPI結合の特異性は、イノシトール13、38のタンパク質相互作用ドメインおよびリン酸化状態に依存するが、PIの脂質部分との相互作用も19である。様々なIプとピと、その修飾キナーゼおよびホスファターゼは、代謝産物の利用可能性と豊富さ、イノシトールのリン酸化状態、およびタンパク質の影響を受けるタンパク質機能を制御するための柔軟な細胞機構を提供します。相互作用の親和性1,3,13,38.一部のタンパク質ドメインは39、40、41、例えば、プレクストリン相同性ドメイン42およびSPX(S YG1/P ho81/XPR1)ドメイン43を特徴とするが ,44,45, 一部のタンパク質は、未知のままであるメカニズムによって、IPまたはPと相互作用する。例えば、T.bruceiのリプレッサ活性化タンパク質1(RAP1)は、正規のPI結合ドメインを欠いているが、PI(3,4,5)P3と相互作用し、抗原変動3に関与する遺伝子の転写を制御する。トリパノソーム、酵母、または哺乳動物細胞からのIPまたはPI相互作用タンパク質の親和性クロマトグラフィーおよび質量分析分析は、既知のIP-またはPI結合ドメインなしでいくつかのタンパク質を同定した8、46、47.データは、これらの代謝産物に結合する追加の無特徴タンパク質ドメインを示唆している。したがって、IPやピと相互作用するタンパク質の同定は、これらの低分子に対するタンパク質代謝物相互作用と新しい細胞調節機能の新しいメカニズムを明らかにする可能性がある。
ここで説明する方法は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析に結合したアフィニティクロマトグラフィーを採用し、IPまたはPIに結合するタンパク質を同定する。これは、アガロースビーズに結合したストレプトアビジンに架橋されるか、または代わりに、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを介して捕捉されたバイオミチル化されたIPまたはピを使用します(図1)。この方法は、感受性、非放射性、リポソームフリーであり、細胞のリザエートまたは精製タンパク質3からのタンパク質の結合を検出するのに適した簡単なワークフローを提供する(図2)。この方法は、標識のない8、46、またはアミノ酸標識定量質量分析47に結合して、複雑な生物学的試料からIPまたはPI結合タンパク質を同定するために使用することができる。したがって、この方法は、細胞タンパク質とのIPまたはピの相互作用を研究するために利用可能ないくつかの方法に代わるものであり、トリパノソームおよびおそらく他の真核生物におけるこれらの代謝産物の調節機能を理解するのに役立ちます。
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Protocol
1. 親和性クロマトグラフィーとウェスタンブロッティングによるIP結合タンパク質の解析
- 細胞増殖、リシスおよび親和性クロマトグラフィー
- T.ブルーシー細胞を中間ログ相に成長させ、細胞の生存率と密度を監視します。1つの結合アッセイには合計5.0 x 107細胞で十分です。
- 血流形態の場合、37°Cおよび5%CO2で10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したHMI-9培中の細胞を増殖させる。8.0 x 105から 1.6 x 106セル/mL の間のセル密度を維持します。
注: 1.8 x 106セル/mL より高い密度は、細胞の生存率に影響を与える可能性があります。インビトロで成長したT.brucei 427株の倍増時間は5.5〜6.5hの間である。 - プロ環状形態の場合、SDM-79培地で細胞を27°Cで10%FBSで補い、1.0 x 107と3.0 x 107細胞/mLの間の細胞密度を保つ。
- 精製タンパク質(例えば、組換えタンパク質)の場合、0.5~1 μgのタンパク質を摂取し、結合バッファーの450 μLで希釈する(25mM HEPES、150mM NaCl、0.2%4-ノンニルフェニルポリエチレングリコール、pH 7.4)。ウェスタンブロット分析のために希釈タンパク質(入力)の5%を保持します。ステップ 1.1.7 に進みます。
- 血流形態の場合、37°Cおよび5%CO2で10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したHMI-9培中の細胞を増殖させる。8.0 x 105から 1.6 x 106セル/mL の間のセル密度を維持します。
- 室温(RT)で10分間1,600 x gの遠心分離細胞。上清を捨てます。
注: 大きなカルチャボリュームの遠心分離の詳細については、手順 2.1.2 を参照してください。 - 6 mMグルコース(PBS-G)を補充したリン酸緩衝生理食生pH 7.4の10mLでペレットを静かに再中断し、37°Cで予熱して細胞を洗浄する。次に、RTで1,600 x gで細胞を遠心分離し、RTで5分間遠心分離します。
- PBS-Gの1 mLでペレットを再ステースする。その後、1.5 mLチューブにボリュームを移し、1,600 x gで5分間上清を捨てます。
注:細胞ペレットは、液体窒素中でフラッシュ冷凍し、-80 °Cまたは液体窒素で保存することができます。 - 0.5 mLのリシスバッファー(25 mM HEPES、150mM NaCl、1%t-オクチルフェノキシポリエトキセタノール、pH 7.4)でペレットを再懸濁し、1.5倍プロテアーゼ阻害剤カクテルと1xホスファターゼ阻害剤カクテル(材料の表)を予め冷やした細胞をlyseします。4°Cで50rpmで回転する10分間のライサテをインキュベートします。
注:タンパク質は、指示どおりに処理しないと分解する可能性があるため、これは重要なステップです。必要に応じて、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS/PAGE)によるタンパク質リサートの完全性を確認してください。
注意: T-オクチルフェノキシポリエトキセタノールは有毒であり、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。手袋、アイシールド、フェイスシールドを使用してください。 - 4°Cで10分間14,000 x gでリサートを遠心分離します。結合アッセイのための新しい1.5 mLチューブに上清を収集します。西洋ブロッティング分析のための総リサート(入力)の5%を保ちます。上清は、リシスバッファーで抽出された寄生虫タンパク質を含んでいます。
- アガロースビーズ(スラリーの50μL)または50μLのアガロースビーズに結合した50 μLのIまたはピを集め、1,000 x gで1分間遠心分離機を採取する。上清を廃棄し、ビーズを平衡化するために結合バッファーの50 μLで再懸濁します。コントロールとして非共役ビーズを使用します。非リン酸化形態を含む異なるリン酸構成のIP/PIビーズを使用して、非特異的相互作用を制御します。
- 細胞のライサートまたは精製タンパク質に50 μLのIP-またはPI-ビーズを加えます(ビーズの各1 mLには、共役IPまたはPIの10 nmolが含まれています)。IP-またはPIビーズの体積を総リサートの10%以内に保ち、必要に応じて結合バッファーで結合反応量を調整します。
- 競合アッセイの場合、結合反応に非共役IPまたはPIの様々な濃度(例えば、IP-またはPIビーズと比較して1-、10-、100倍のモル過剰)を加える。
- 反応を1時間または一晩、4°Cでインキュベートし、50rpmで回転させる。
注:精製タンパク質との結合反応は、タンパク質の安定性に応じてRTで行うことができます。BIOtin に結合された I または P を使用する場合は、ステップ 1.1.9.1 にのみ進む場合は、ステップ 1.1.10 に進みます。- 結合反応に磁気ビーズに50μLのストレプトアビジン結合を加え、50rpmで回転する4°Cで1時間インキュベートする。
- 4°Cで1,000 x gで1分間混合物を遠心分離します。上清(フロースルー)を取り除き、ペレットを保持します。西洋のブロット分析のための上清の5%を保つ。
注:磁気ビーズを使用する場合は、上清を取り除き、磁気スタンドを使用して後続の洗い出しを行います(遠心分離は必要ありません)。 - 洗浄バッファー(25 mM HEPES、300 mM NaCl、0.2%4-ノンニルフェニルポリエチレングリコール、pH 7.4)を1mL追加し、チューブをタップまたは旋回して樹脂を再サスペンドします(ビーズはピペットの先端に付着できるのでピペットを使用しないでください)。4°Cで1,000 x gで1分間の反応を遠心分離し、上清を廃棄する。合計 5 回の洗い方の手順を繰り返します。
注意:4-ノニルフェニルポリエチレングリコールは有毒であり、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。手袋、アイシールド、フェイスシールドを使用してください。 - ビーズに710 mM 2-メルカプトエタノールを添加した2x Laemmliバッファーの50 μLを加え、たたきまたは渦をタップしてタンパク質を溶出して混ぜます。95°Cで5分間熱し、その後1分間10,000 x gの遠心分離機を行い、上清(タンパク質を含む)を収集します。あるいは、8M尿素/100mMグリシンpH 2.9を有するタンパク質を溶出し、SDSの使用を避ける。溶出液を-80°Cで凍結し、それ以外の場合はウェスタンブロット分析に進みます。
注意:2-メルカプトエタノールは有毒であり、皮膚、眼および呼吸器刺激を引き起こす可能性がある。手袋を使用し、化学フードで作業します。
- T.ブルーシー細胞を中間ログ相に成長させ、細胞の生存率と密度を監視します。1つの結合アッセイには合計5.0 x 107細胞で十分です。
- 西洋ブロッティング分析
- 入力の15 μL(ステップ1.1.6から)またはフロースルー(ステップ1.1.10から)サンプルを4x Laemmliバッファの5 μLと混合します。95°Cで5分間の熱入力とフロースルーサンプル。8M尿素/100mMグリシンpH 2.9で溶出したサンプルの場合は、溶出液の15μLを4x Laemmliバッファーの5μLと混合し、95°Cで5分間加熱します。
注: この手順は、2x Laemmli バッファーでエリュートされたサンプルには必要ありません。 - 入力の2.5 μL、2.5 μLのフロースルー、および20 μLの浸透サンプルを備えた4-20%のSDS/PAGEゲルのウェルをロードし、製造元の推奨に従ってタンパク質はしごをロードします。
注:目的のタンパク質の分子量に応じてゲル%を選択します。 - 実行中のバッファーで 30 ~ 45 分間、または Laemmli バッファーの青色染料がゲルの末端になるまで、SDS/PAGE を 150 V で実行します。
注:走行時間は、実験装置によって異なる場合があります。 - ガラス(またはプラスチック)プレートからゲルを取り出し、15分間転送バッファーに浸します。
- タンパク質をポリビニリデレンジフッ化物(PVDF)膜またはニトロセルロース膜に移す。転写バッファーに膜と3mmフィルターペーパーを浸します。3枚のフィルターペーパー、ニトロセルロースまたはPVDF膜、ゲル、およびフィルターペーパーの追加3枚でサンドイッチを組み立てます。サンドイッチに気泡が閉じ込められていないことを確認します。必要に応じて、ローラーを使用して気泡を除去します。カソードの膜とカセットの陽極側のゲルをセットします。
注: 膜の活性化またはブロット調製に関する情報については、膜の製造元の指示を確認してください。 - サンドイッチを入ったカセットを転送バッファ付きの転送タンクに入れます。タンクをアイスバケツまたは4°C(例えば、冷たい部屋)に置きます。1時間100Vでタンパク質を転写する(電流は200〜400 mAの間で変化する)。あるいは、4°Cで15mAの一定電流で一晩転送する。
- カセットから膜を取り除きます。ポリソルベート20(PBS-T)の0.05%でPBSで希釈した6%非脂肪ドライミルクで膜をインキュベートし、または互換性のあるブロッキング溶液をRTで1時間、膜を遮断する。
注:膜を遮断する前に、ポンソーS染色を使用して転送の品質を確認することができます。ポンソーSの15 mLで1分間膜をインキュベートし、水中ですすいでバンドを可視化します。 - ブロッキング溶液を除去し、PBS-Tで希釈した6%の非脂肪ドライミルクで希釈した一次抗体で50rpm回転でRTで1時間膜をインキュベートする。あるいは、50rpm回転で4°Cで一晩膜をインキュベートする。
注:インキュベーションの時間は、抗体の品質に応じて変化する場合があります。しかし、ほとんどの抗体はRTで1-3時間のインキュベーションで動作します。 - PBS-Tで膜を5分間、RTで50rpm回転させ、ブロットを洗浄し、手順を3~5回繰り返します。抗体の品質に応じて、より多くの洗い出しが必要な場合があります。
- 50 rpm 回転で PBS-T で希釈した 6% 非脂肪ドライミルクで RT で 1 時間のワサビペルオキシダーゼ (HRP)結合二次抗体で膜をインキュベートします。
注:抗体濃度または希釈に関するメーカーの推奨に従ってください。 - ステップ 1.2.9 に示すようにブロットを洗います。
- 膜を覆う化学発光基板を添加する。基板の過剰を取り除き、暗闇の中でRTで5分間インキュベートします。
注: 化学発光試薬に関する推奨事項については、製造元の指示を確認してください。 - カメラベースのイメージャーを使用して化学発光信号をキャプチャします。あるいは、X線フィルムを使用して化学発光シグナルを捕捉する。
- 入力の15 μL(ステップ1.1.6から)またはフロースルー(ステップ1.1.10から)サンプルを4x Laemmliバッファの5 μLと混合します。95°Cで5分間の熱入力とフロースルーサンプル。8M尿素/100mMグリシンpH 2.9で溶出したサンプルの場合は、溶出液の15μLを4x Laemmliバッファーの5μLと混合し、95°Cで5分間加熱します。
2. 親和性クロマトグラフィーと質量分析によるIP/PI結合タンパク質の解析
- 細胞増殖、リシスおよび親和性クロマトグラフィー
- T.ブルーシー細胞を中間ログ相に成長させ、細胞の生存率と密度を監視します。
注:合計1.0 x 1010細胞は、2つの結合アッセイに十分です。ここで示すよりも少ない細胞を使用すると、質量分析による低量タンパク質の検出に影響を与える可能性があります。- T.brucei血流形態の場合、HMI-9培中の中間対数相(8.0 x 105-1.6 x 106細胞/mL)で細胞を増殖させ、37°Cで10%FBSを補充し、5%CO2を用いた。427株の場合、5Lの培養物は0.5〜1.0 x 1010細胞を得る。細胞の増殖を監視し、細胞の生存率に影響を与える可能性のある1.8 x 106細胞/mLより高い密度を避けます。フラスコ体積の1/10にセル培養体積を保ちます。それ以外の場合は、細胞の増殖速度が悪い通気性のために影響を受けます。
注:427株は5.5-6.5 hの倍増時間を有する。 - プロ環状形態の場合、SDM-79培地で細胞を27°Cで10%FBSで補い、1.0 x 107と3.0 x 107細胞/mLの間の細胞密度を保つ。培養の500 mLは0.5〜1.5 x 1010細胞を生み出す。
- T.brucei血流形態の場合、HMI-9培中の中間対数相(8.0 x 105-1.6 x 106細胞/mL)で細胞を増殖させ、37°Cで10%FBSを補充し、5%CO2を用いた。427株の場合、5Lの培養物は0.5〜1.0 x 1010細胞を得る。細胞の増殖を監視し、細胞の生存率に影響を与える可能性のある1.8 x 106細胞/mLより高い密度を避けます。フラスコ体積の1/10にセル培養体積を保ちます。それ以外の場合は、細胞の増殖速度が悪い通気性のために影響を受けます。
- RTで1,600 x gで細胞を遠心分離し、上清を捨て、37°Cで予熱したPBS-Gの200 mLでペレットを再懸濁する。固定角遠心ローターを使用する場合、T.ブルーセイ血流形態ペレットが邪魔されやすいため、丸底遠心分離管(材料表)を使用してください。RTで5分間、1,600 x gで再び細胞を遠心分離します。
- 上清を取り出し、PBS-Gの10mLでペレットを再中断します。RTで5分間1,600 x gで細胞を遠心分離し、手順を繰り返し、最終洗浄後、上清を廃棄します。
注:ペレットは、液体窒素中でフラッシュ凍結し、-80°Cまたは液体窒素で保存することができます。 - 細胞ペレットを5mLのリシスバッファーで予め氷で冷やし、1.5倍プロテアーゼ阻害剤カクテルと1xホスファターゼ阻害剤カクテル(材料表)を補充する。50rpmで回転する4°Cで10分間ライサテをインキュベートします。
- 4°Cで10分間10,000 x gでリサートを遠心分離します。上清(可溶化タンパク質)を回収し、結合バッファーの20mLで希釈します。
- アガロースビーズ(スラリーの400μL)または400μLのコントロールビーズに結合した400 μLのIまたはピを収集し、RTで1,000 x gで1分間遠心分離機を廃棄し、ビーズを平衡化するために400 μLの結合バッファーで再濁します。アガロースビーズを負の対照として使用して、非特異的相互作用(例えば、ビーズに非特異的に結合するタンパク質)と比較したタンパク質代謝産物相互作用の特異的濃縮を決定する。非リン酸化形態を含む異なるリン酸構成を持つIPまたはピを使用して、リン酸料金またはビオチンへの結合による非特異的相互作用を制御します。
- 400 μLのIP/PIビーズまたはコントロールビーズを10mLのリザートに加え、50rpmで回転する4°Cで1時間または一晩インキュベートします。ビオチンのみ(ビーズなし)で結合したIPまたはピを使用する場合は、ステップ2.1.7.1に進み、それ以外の場合はステップ2.1.8に進みます。
- 磁気ビーズに100μLのストレプトアビジン結合を加え、50rpmで回転する4°Cで1時間インキュベートします。
- 4°Cで1,000 x gで1分間の結合反応を遠心分離する。上清(フロースルー)を取り除き、ペレットを保持します。西洋のブロット分析のための上清の5%を保つ。
- ペレットに洗浄バッファーの5 mLを追加し、チューブを旋回して穏やかに混合し、次いで4°Cで1,000 x gで1分間遠心分離機を行います。上清を捨てます。5回繰り返します。磁気ビーズを使用する場合は、上清を収集し、磁気スタンドを使用して洗い洗いを行います(遠心分離は必要ありません)。
- 2x Laemmliバッファーの50 μL(または8 M尿素/100 mMグリシンpH 2.9、SDSの使用を避けるために)をビーズに追加し、タップまたは渦(ビーズはピペットの先端に取り付けることができるのでピペッティングを避ける)、そして10,000 mのために5分間95°Cで熱します。上清(タンパク質)を収集します。手順を 2 回繰り返して、合計 3 分の分数を収集します。
- 溶出液を-80°Cで凍結し、それ以外の場合はSDS/PAGEでタンパク質を分離するか、トリプシン化および質量分析分析のための溶液中に保管してください。
- T.ブルーシー細胞を中間ログ相に成長させ、細胞の生存率と密度を監視します。
- 質量分析のためのタンパク質のトリプシン消化
注:この手順の2つのバリエーションは、セクション2.2.1(ゲル)またはセクション2.2.2(溶液中)のタンパク質の消化について示されています。タンパク質の低結合チューブは、サンプル損失を防ぐために推奨されます。プロテオミクス施設の分析化学者に、利用可能なサンプルおよび質量分析計の器具に対するプロトコルの適合性を相談してください。- タンパク質のインゲルトリプシン化
- SDS/PAGEでタンパク質を分離した後、高純度の水でゲルを簡単にすすいでください。ジェルをきれいなガラス板に移します。きれいな刃の蛋白質バンドを物品切り出しし、バンドの外に余分なゲルを切断しないようにしてください。ゲル片を小片(約1mm角)に切り、1mLチューブに移します。必要に応じてピペットチップを使用しますが、使用前にピペットチップがエタノールですす込まれたことを確認してください。
注:ゲルの汚染を避けるために手袋を使用してください。ゲル片は-20°Cで保存することができます。 - 高純度または高性能液体クロマトグラフィーグレードの水をチューブに100μLのゲル片をすすいでください。水を捨てなさい。
- クーマシーまたはルテニウムベースの蛍光染色ゲル片の場合は、脱染溶液(25mM NH4HCO3 in 50%アセトニトリル)でゲル片を1時間インキュベートし、溶液を廃棄します。染色が見えないまで手順を繰り返します。
注:100 mM NH4HCO 3、pH 7.8のストック溶液からの希釈によりNH4 HCO3を含む溶液を調調します。
注意:アセトニトリルは揮発性溶媒であり、可燃性および有毒である。NH4HCO3は、皮膚や眼の刺激を引き起こす可能性があります。手袋を使用し、化学フードの下で作業します。 - 銀染色ゲル片の場合は、銀染色液の50μLの脱染液(15mM K3[Fe(CN)6]、50mM Na2 S2O3)を水中で30分間水中に入れ、200μLでゲル片を洗浄します。水の。5回繰り返し、またはゲル黄色が見えなくなるまで洗い流します。
注意:K3[Fe(CN)6]皮膚や眼の炎症を引き起こすことがある。手袋を使用してください。
- クーマシーまたはルテニウムベースの蛍光染色ゲル片の場合は、脱染溶液(25mM NH4HCO3 in 50%アセトニトリル)でゲル片を1時間インキュベートし、溶液を廃棄します。染色が見えないまで手順を繰り返します。
- RTで200μLのアセトニトリルを使用してゲル片を10分間脱水します。次に、ソリューションを破棄します。
注:脱水ゲル片は、体積、不透明、粘着性が小さくなります。複数のゲルを1つのチューブに組み合わせる場合は、ゲル片の効率的な脱水のための手順を繰り返します。 - 還元液(100mM NH4HCO3で10mMジチオスレイトール[DTT])の50 μL(またはゲル片を覆うのに十分な体積)を加え、その後1時間56°Cでインキュベートし、チューブをRTに冷却し、還元液の過剰を廃棄します。
- アルキル化溶液(100mM NH4HCO3で50mMヨードアセタミド)の50 μL(またはゲル片を覆うのに十分な体積)を加え、暗闇の中でRTで30分間インキュベートします。その後、過剰なアルキル化溶液を廃棄する。
- RTで10分間アセトニトリルの200 μLでゲル片を脱水し、RTで100 mM NH4HCO3でゲル片を水和します。
- RTで10分間アセトニトリルの200 μLで再度ゲル片を脱水し、溶液の過剰を廃棄します。
- 50 mM NH4HCO3バッファーで希釈した質量分析グレードトリプシンを 15 μL 追加するか、水和ゲル片を覆うのに十分な体積を加え、4 時間または一晩、37 °C でインキュベートします。総トリプシン量は100~500ng(またはタンパク質の20ngトリプシン/μg)に保ちます。
- サンプルをRTに冷却し、マイクロ遠心分離機で2,000 x gで1分間遠心分離機を使用します。水に希釈したギ酸5%の10-20 μLを加え、RTで10分間インキュベートします。
注意:ギ酸は可燃性、腐食性、有毒です。手袋を使用し、化学フードの下で作業します。 - ステップ2.2.1.9に示すように遠心分離機は、次いで、別のチューブに上清(抽出されたペプチドを含む)を収集します。50-60%のアセトニトリルで希釈した5%のギ酸の20 μLをチューブに加え、RTで10分間インキュベートします。
- 真空濃縮器でサンプルを乾燥させ、質量分析のために0.5%酢酸と2%アセトニトリルの10 μLで再構成します。遠心分離機とチューブの底部に溶液を収集します。-20 °C または -80 °C.
- SDS/PAGEでタンパク質を分離した後、高純度の水でゲルを簡単にすすいでください。ジェルをきれいなガラス板に移します。きれいな刃の蛋白質バンドを物品切り出しし、バンドの外に余分なゲルを切断しないようにしてください。ゲル片を小片(約1mm角)に切り、1mLチューブに移します。必要に応じてピペットチップを使用しますが、使用前にピペットチップがエタノールですす込まれたことを確認してください。
- タンパク質の溶液トリプシン化
- タンパク質を沈殿させ、サンプル量、脱塩、およびバッファー交換を減らします。6つのボリュームのチルド(-20°C)アセトンをサンプルに加え、例えば、600μLのアセトンを100μLのサンプルに加えます。渦と-20°Cで15分〜1時間インキュベートします。溶液は曇りになるか、沈殿物を形成します。
注意:アセトンは有毒で可燃性です。手袋を使用し、化学フードの下で作業します。 - 遠心分離機は4°Cで30分間試料を30分間デカントし、ペレットを15分間空気乾燥させます。
- 50 mM NH4HCO3に6-8 M尿素の10 μLまたは1%SDSを加え、ペレットと渦を溶かして混合します。タンパク質の量が多い場合 (> 10 μg) は、最大 20 μL の溶解バッファーを使用します。
- 還元溶液と渦の5 μLを追加します。マイクロ遠心分離機を使用して音量を下げます。サンプルが尿素で希釈された場合は、RTで1時間インキュベートします。サンプルをSDSで希釈した場合は、56°Cで1時間インキュベートします。
- マイクロ遠心分離機を使用して音量を下げます。アルキル化溶液と渦の3 μLを追加します。その後、音量を下げ、RTで30分間暗闇の中でインキュベートします。
- 反応を中和するために還元溶液の3 μLを追加します。50 mM NH4HCO3を使用してサンプルを1M尿素または0.05%SDSにゆっくりと希釈する。
注:トリプシン消化バッファーは、洗剤または脱窒剤を持っている必要があります。脱薬の濃度限界は次のとおりです: 0.05% SDS;0.1% オクチル B-D-グルコピーラノシド;0.1% 4-ノニルフェニルポリエチレングリコール;0.1% t-オクチルフェニキシポリエトキセタノール;0.1% ポリソルベート 20;0.1% 3-[(3-チョラミドプロピル)ジメチルアモンオ]-1-プロパンスルホネート;< 1 M尿素またはチウレア。 - 50 mM NH4HCO3バッファーで希釈した質量分析グレードトリプシンを 5 μL を追加し、37 °C で 4 時間または一晩インキュベートします。総トリプシン量は100~500ng(またはタンパク質の20ngトリプシン/μg)に保ちます。
- サンプルをRTに冷却し、マイクロ遠心分離機を使用して音量を下げます。反応をクエンチするために5%酢酸(または50%アセトニトリルで5%ギ酸)を追加します。
- ステップ2.2.1.11に示すように、真空コンセントレータでサンプルを乾燥させます。サンプルを-80 °C.で保存します。C18ジップチップなどの逆相カラムを用いてペプチドを脱塩・濃縮し、質量分析で分析します。
- タンパク質を沈殿させ、サンプル量、脱塩、およびバッファー交換を減らします。6つのボリュームのチルド(-20°C)アセトンをサンプルに加え、例えば、600μLのアセトンを100μLのサンプルに加えます。渦と-20°Cで15分〜1時間インキュベートします。溶液は曇りになるか、沈殿物を形成します。
- タンパク質のインゲルトリプシン化
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Representative Results
親和性クロマトグラフィーとウェスタンブロッティングによるRAP1とPI(3,4,5)P3相互作用の解析
この例は、この方法を用いて、T.ブルシー・リサートまたは組換えT.ブルーシーRAP1タンパク質からのRAP1による結合を分析する。ヘマグルチニン(HA)タグ付きRAP1を発現するT.ブルーセイ血流形態のライサテスを結合アッセイに用いた。RAP1は、変異面糖タンパク質(VSG)遺伝子3、48の転写制御に関与するタンパク質であり、これは抗原変動49による寄生虫免疫回避に関与する表面タンパク質についてコードする。RAP1は、ホスファチリノシトール5-ホスファターゼ(PIP5Pase)酵素3とテロメリックタンパク質複合体内で相互作用し、これはVSG遺伝子転写1、3の制御にも機能する。RAP1はN末端乳癌1カルボキシル末端(BRCT)ドメインを有し、続いて骨髄芽細胞症(myb)DNA結合ドメインおよびC末端myb様ドメイン3、48が続く。ただし、正規の PI バインディング ドメインがありません。結合アッセイは、非リン酸化またはイノシトールリングの異なる位置でリン酸化されるピと、非共役アガロースビーズで行った。西洋分析では、RAP1がPI(3,4,5)P3ビーズ(図3A)よりも優先的に結合することを示していますが、PI(4,5)P2ビーズに対する結合度も低い。しかし、他のピジやアガロースビーズには結合しなかった。RAP1は多タンパク質複合体3の一部であるため、一部のピスとの相互作用は直接的ではない可能性があるため、RAP1-HAは、Pに結合する他の細胞タンパク質との相互作用から生じる。
したがって、RAP1がピに直接結合するかどうかをテストするために、C末端にタグ付けされた6x-彼の組換えRAP1(rRAP1)タンパク質を、大腸菌3から均質性に発現し精製した。このタンパク質は、PI(3,4,5)P3またはPI(4,5)P2の競合濃度の存在下でPI(3,4,5)P3ビーズとの結合アッセイに使用された。ウェスタンブロッティングは、PI(3,4,5)P3の濃度の上昇を示すが、PI(4,5)P2はPI(3,4,5)P3とのrRAP1の相互作用を阻害する(図3B)。また、反応復元PI(3,4,5)P3結合に対するPAT5Pase酵素の添加は、遊値PI(3,4,5)P33のPIP5Pase脱リン酸化によるものであり、このリン酸化パターンを示している。 代謝産物はrRAP1結合に不可欠です。したがって、rRAP1は、T.ブルーシー・リサテスからのRAP1-HAと同様にPI(3,4,5)P3と相互作用する。さらに、このデータは、LYsateからPI(4,5)P2へのRAP1-HAの結合が、複合体内の他のタンパク質とのRAP1相互作用(例えば、PIP5Pase)3に起因する可能性が高いことを示している。このデータは、細胞リザートおよび組換えタンパク質との結合アッセイの相補性を示す。また、タンパク質とピとPとの相互作用の特異性を決定するための競合結合アッセイの有用性を示しています。
親和性クロマトグラフィーと質量分析によるIns(1,4,5)P3結合タンパク質の同定
この例では、アフィニティクロマトグラフィーに続いて質量分析を行い、Ins(1,4,5)P3に結合するT.ブルーセイタンパク質を同定した。したがって、実験はT.brucei血流形態から潜在的なIns(1,4,5)P3結合タンパク質を調査する。T.bruceilysateをIns(1,4,5)P3をアガロースビーズまたは非共役ビーズ(対照として使用)で共役し、結合タンパク質をLaemmliサンプルバッファーで照合した。SDS/PAGE解析は、コントロールアガロースビーズからタンパク質を取り出したタンパク質と比較して、Ins(1,4,5)P3ビーズからタンパク質を含むタンパク質の濃縮を示しています(図4A)。250以上のタンパク質を同定したタンパク質の質量分析分析では、そのうち84個が対照ビーズと比較してIns(1,4,5)P3ビーズで濃縮された(図4B、折りたたみ変化[FC]≥2、p<0.05)。 対照ビーズと比較してIns(1,4,5)P3に結合したタンパク質の濃縮は、SDS/PAGEによって検出されたタンパク質シグナルと相関する。データには、Ins(1,4,5)P3に結合するために検証されたタンパク質と、Ins(1,4,5)P3に結合するメカニズムが不明であるタンパク質が含まれる8.さらに、Ins(1,4,5)P3結合プロテオームは、Ins(1,3,4,5)P4および他のP4および他のP8のそれとは大きく異なり、これらのタンパク質の一部がIns(1,4,5)P3の特異的リン酸構成を認識することを示唆している。したがって、ビオチンタグIns(1,4,5)P3は、質量分析に結合したアフィニティクロマトグラフィーに使用して、Ins(1,4,5)P3に結合するタンパク質を同定することができる。このアプローチは、他のGPまたはPI 3、8、46、47に結合するタンパク質を同定するために探索することができる。
図 1: 結合アッセイ用アフィニティ試薬。(A) PI(3,4,5)P3(上)及びIns(1,4,5)P3(下)は、イノシトールのsn1位置でビオチンに結合した。PI(3,4,5)P3では、ビオチンはイノシトールのsn1位置で脂質鎖に結合され、Ins(1,4,5)P3ではビオチンが位置sn1でリン酸塩に結合される。(B)Ins(1,4,5)P3はビオチンと共役し、ビーズ(例えば、アガロースまたは磁気ビーズ)に結合したストレプトアビジンへの結合を介して捕捉される。ビオチンに代わるカスタム合成リンカーを用いてこれらの試薬のバリエーションも可能である46.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: プロトコルのワークフローは、(A)ウェスタンブロッティングまたは(B)質量分析によるT.bruceiのタンパク質とのIPまたはPI親和性相互作用の分析と検出のためのステップを記述する。AC-WB, 親和性クロマトグラフィーとウェスタンブロッティング;AC-MS、親和性クロマトグラフィーおよび質量分析。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: T. ブルータイRAP1をホスホイノシチドに結合する。(A) HAタグ付きRAP1を発現するT.brucei(5.0 x 107寄生虫)のライサテスを、50μLのピ(共役ピの10nmolを含むアガロースビーズの各1mL)またはアガロース(Ag)ビーズを4°Cで2時間インキュベートした。 結合反応を2x Laemmliサンプルバッファーで洗浄してEL化し、95°Cで5分間加熱し、タンパク質を4-20%SDS/PAGEで分離し、PVDF膜に移し、モノクローナル抗体抗体を用いてプローブした(1:5,000、6%PBS-ミルクで希釈)。抗マウスIgG-HRP(1:5,000、6%PBS-ミルクで希釈)により、化学発光によって検出した。(B) rRAP1の1 μgを50 μLのPI(3,4,5)P3-アガロースビーズを5~50 μMジオクタノルグリセロール(diC8)PI(3,4,5)P3の有無中にRTで1時間インキュベートした。 20 ~ 50 μM diC8 PI(4,5)P2、または 50 μM diC8 PI(3,4,5)P3 および 250 ng PIP5Pase 精製T. ブルーシー血流フォーム3.結合は、マウス抗HIS HRPモノクローナル抗体(1:2,000、6%PBS-ミルクで希釈)を使用してウェスタンブロッティングにより分析し、化学発光によって開発された。この図は、Cestariら3.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: Ins(1,4,5)P3に結合するT.ブルーセイタンパク質のアフィニティクロマトグラフィーおよび質量分析分析(A) Ins(1,4,5)P3ビーズまたはアガロースビーズに結合するT.ブルーサイタンパク質の10%SDS/PAGE分析。5.0 x 109の寄生虫のリサテスを4°Cで2時間4°Cでインキュベートし、400 μLのIns(1,4,5)P3をアガロースビーズまたはインスなしのアガロースビーズ(1,4,5)P3[1mLのビーズは10nmolを含む)10nmol(P3)で含む。結合反応を洗浄し、2×Laemmliサンプルバッファーでelemmliを熱し、95°Cで5分間沸騰させた。タンパク質を10%SDS/PAGEで分離し、クマシー染色で染色した(材料表)。矢印は、アガロースビーズと比較してIns(1,4,5)P3ビーズで濃縮されたタンパク質を示しています。円は、Ins(1,4,5)P3ビーズとアガロースビーズの両方に存在するタンパク質を示し、ブラケットは、両方に存在するが、アガロースビーズと比較してIns(1,4,5)P3ビーズに富むタンパク質を示す。(B)ドットプロットは、アガロースビーズと比較してIns(1,4,5)P3ビーズで濃縮された質量分析によって同定されたタンパク質を示す。FC > 2 およびp-値 <0.05 によって定義されるエンリッチメント。4つの生物学的反復をアガロースビーズAC-MSに用い、IP3ビーズとアガロースビーズで同定されたタンパク質の折りたたみ変化に対して3つの生物学的反復をMSstat50を用いてペプチドスペクトル強度を用いて計算した。詳細な結果とペプチドのリストは、利用可能です8.質量分析の生データは、PRIDEパートナーリポジトリを介してProteomeXchangeコンソーシアムを介して識別子PXD005907でも利用可能です。この図は、Cestariら8から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
これらの代謝産物の細胞機能を理解するためには、IPまたはPに結合するタンパク質の同定が重要です。ウェスタンブロットまたは質量分析に結合されたアフィニティクロマトグラフィーは、IPまたはPI相互作用タンパク質を同定し、その調節機能に関する洞察を得る機会を提供します。IPまたはPは化学的にタグ付けされた[例えば、Ins(1,4,5)P3はビオチンに化学的にリンクされている]とストレプトアビジンを介してアガロースビーズに架橋またはストレプトアビジン磁気ビーズによって捕捉され、その後、質量によって識別することができる相互作用タンパク質の単離を可能にする分光またはウェスタンブロット。ここで説明するプロトコルは、これらの代謝産物に結合するT.brucei3、8および哺乳動物細胞47からのタンパク質を同定するために使用されている。(ビオチン以外の)カスタマイズされたタグを使用するアプローチのバリエーションは、酵母46でも使用されています。このアプローチの重要な考慮事項は、コントロールを使用して、特定の特定の相互作用を区別することです。非共役ビーズは必須のコントロールであるが、追加の制御は、非リン酸化ピまたはイノシトール結合ビーズ3を含みてもよい。異なるリン酸組み合わせを持つIPまたはピ5は、これらの代謝産物に結合するタンパク質がイノシトール38のリン酸構成を判別するドメインを含む可能性があるため、また使用されてもよい。39、40、41。さらに、サンプルの複雑さはアプローチの感度に影響を与える可能性があるため、サンプル分画によってサンプルの複雑さを減少させることは、細胞内の低豊富なタンパク質の検出に役立つ可能性があります。ミトコンドリオン51、核52、グリコソーム53、およびフラグラム54、トリパノソームからの細胞分画および単離のための確立されたプロトコルがある。細胞内分画で使用されるバッファーおよび試薬は、このプロトコルで使用されるバッファーおよび試薬との互換性のために調整する必要がある場合があることに注意してください。特に、ここで示すように、親和性クロマトグラフィーによってIPまたはPに結合するタンパク質の同定は、相互作用のタンパク質と代謝産物の親和性に依存するため、したがって、IPまたはピに対する親和性が弱いタンパク質は容易に検出されない場合があります。
細胞リサートからのタンパク質とのIPまたはPI相互作用の分析は、これらの代謝産物に直接結合しないタンパク質の同定をもたらすかもしれないが、どの相互作用は、IPPに結合する他のタンパク質と複合体のタンパク質との関連から生じるまたはピス。この特徴は図3Aに例示され、T.brucei lysateのRAP1-HAがPI(3,4,5)P3ビーズおよびPI(4,5)P2ビーズに結合しているように見える。 しかし、Hisタグ付きrRAP1との結合アッセイは、このタンパク質がPI(3,4,5)P3に結合し、PI(4,5)P23に結合しないことを示しています。これは図3Bに示され、競合アッセイは、無料PI(3,4,5)P3ではなく、自由PI(4,5)P2がPI(3,4,5)P3ビーズとのrRAP1-彼の相互作用を競うであることを示しています。RAP1とPI(4,5)P2ビーズとの相互作用は、PI(4,5)P2(例えば、PIP5Pase)3を結合するタンパク質との複合体内のRAP1関連によるものである。したがって、細胞のライサテスからの結合アッセイは、直接または間接的にIまたはPIに結合するタンパク質を識別する可能性があります。特に、間接的な相互作用は、前者が代謝物結合に影響を与えるか、または影響を受ける生物学的機能(タンパク質複合体の文脈において)を持つ可能性があるため、非特異的相互作用とは異なる。たとえば、Ins(1,4,5,6)P4 はマルチサブユニット共リプレッサデアセチラーゼ複合体に結合し、複雑なアセンブリおよびアクティビティ13を制御する。したがって、タンパク質とのIP/PI相互作用を検証することが不可欠です。相互作用の検証は、過剰なIPまたはピスを有する競合アッセイ(図3B、図3、8、潜在的タンパク質ドメイン56の突然変異、または精製タンパク質の使用)を含む場合がある。直接相互作用を決定する (図 3A,B)3.
タンパク質およびIPまたはPIの相互作用を研究するための他の方法には、放射性標識されたIPまたはPIへのタンパク質の結合、タンパク質捕捉のための行列として疎水性膜に結合されたIPまたはPIの使用、またはリポソームに組み込まれたPIへのタンパク質の結合が含まれる。42歳,57歳,58.重要なのは、PIとのタンパク質相互作用が膜構造38を必要とする場合、リポソームベースのアッセイを相補的なアプローチとして用いてもよい。これらのアプローチの制限には、低スループット、低感度、IPまたはPの未知の化学的向きが行列58に対する未知の化学的向き、または放射性物質42の使用が含まれる。ここで説明する方法は、敏感な、リポソームフリー、非放射性、およびIP/PIビーズが市販されているので、カスタマイズされた化学合成を必要としません。さらに、IPまたはPにリンクされたビオチンの位置が明確に定義され、タンパク質と代謝産物相互作用の正確な分析を可能にする46、58を改変することもできる。ここで説明する方法は、細胞培養中のアミノ酸の安定同位板標識(SILAC)47などの定量質量分析アプローチと組み合わせることもできます。治療または条件。ウェスタンブロットまたは質量分析に結合された親和性クロマトグラフィーは、T.ブルーセイ、哺乳動物細胞、および酵母3、8、46、および酵母から多数のIP-またはPI結合タンパク質を同定するのに役立ちました。 47は、IP-またはPI結合ドメインを特徴付けていないタンパク質を含み、および新規結合ドメインの同定にも役立ち、例えば、PI(3,4,5)P3結合ドメイン47を同定するのに役立った。
全体として、ここで説明するプロトコルは、T.bruceiから潜在的なIPまたはPI相互作用タンパク質を調査し、これらの代謝産物とのタンパク質の分子相互作用を研究するために使用することができる。このプロトコルは、他の単細胞寄生虫または哺乳動物細胞47および酵母46などの他の生物からのIP-またはPI結合タンパク質を容易に同定することができ、IPの生物学的機能をさらに理解するのに役立ち、真核生物のピニ。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(NSERC、RGPIN-2019-04658)によって支援されました。NSERCディスカバリーは、初期のキャリア研究者のためのサプリメントを起動します (DGECR-2019-00081) とマギル大学.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Ketone |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | Solvent |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | Inorganic salt |
| Centrifuge Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | Centrifuge for large volumes (e.g., 1L) |
| Centrifuge botles | Sigma-Aldrich | B1408 | Bottles for centrifugation of 1L of culture |
| Control Beads | Echelon | P-B000-1ml | Affinity chromatography reagent - control |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Sugar, Added in PBS to keep cells viable |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Reducing agent |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | ThermoFisher Scientific | 65305 | Streptavidin beads for binding to biotin ligands |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | Protease inhibitors |
| Electrophoresis running buffer | Bio-Rad | 1610732 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3 |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning Life Sciences | 430052 | To centrifuge 10 mL cultures |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 106526 | Acid |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Amino acid |
| HMI-9 cell culture medium | ThermoFisher Scientific | ME110145P1 | Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms |
| Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE |
| Ins(1,4,5)P3 Beads | Echelon | Q-B0145-1ml | Affinity chromatography reagent |
| Instant Nonfat Dry Milk | Thomas Scientific | C837M64 | Blocking reagent for Western blotting |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides |
| Lab Rotator | Thomas Scientific | 1159Z92 | For binding assays |
| LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | Low protein binding tubes for mass spectrometry |
| Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | Detergent |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Physiological buffer |
| Peroxidase substrate for chemiluminescence | ThermoFisher Scientific | 32106 | Substrate for Western bloting detection of proteins |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Phosphatase inhibitors |
| PI(3)P PIP Beads | Echelon | P-B003a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(3,4)P2 PIP Beads | Echelon | P-B034a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | Affinity chromatography reagent |
| PI(3,4,5)P3 PIP Beads | Echelon | P-B345a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(3,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B035a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(4)P PIP Beads | Echelon | P-B004a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | Affinity chromatography reagent |
| PI(4,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B045a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PI(5)P PIP Beads | Echelon | P-B005a-1ml | Affinity chromatography reagent |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid) |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | Potassium salt |
| PtdIns PIP Beads | Echelon | P-B001-1ml | Affinity chromatography reagent |
| PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | For Western blotting |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5910 R | Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL) |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 862010 | Detergent |
| Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich | 72049 | Chemical |
| SpeedVac Vacuum Concentrators | ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | Sample concentration (e.g., for mass spectrometry) |
| T175 flasks for cell culture | ThermoFisher Scientific | 159910 | To grow 50 mL T. brucei culture |
| Trypsin, Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | Trypsin for protein digestion |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | Denaturing reagent |
| Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | For mixing reactions |
| Western blotting transfer buffer | Bio-Rad | 1610734 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol |
| Whatman 3 mm paper | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | Paper for Wester transfer |
| 2-mercaptoethanol (14.2 M) | Bio-Rad | 1610710 | Reducing agent |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Protein loading buffer |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561094 | Gel for protein electrophoresis |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Protein loading buffer |
References
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