Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59865
Automatic Translation
1
1Institute of Parasitology, McGill University

Summary

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Abstract

İnositol Fosfatlar ve fosfoinositidler, gen ifadesi, vezikül kaçakçılığı, sinyal iletimi, metabolizma ve gelişim dahil olmak üzere Ökaryotlar içinde çeşitli hücresel süreçleri düzenler. Bu metabolitler proteinlere bağlayarak, böylece protein konformasyonu, katalitik aktivite ve/veya etkileşimleri değiştirerek bu düzenleyici aktivite gerçekleştirin. Burada açıklanan yöntem, Inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile etkileşimde bulunan proteinleri belirlemek için kütle spektrometresi veya Batı blomlamaya bağlı benzeşme Kromatografi kullanır. İnositol fosfatlar veya fosfoinositidler kimyasal olarak biotin ile etiketlenmiştir, bu da agaroz veya manyetik boncuklar için conjuated streptavidin aracılığıyla yakalanan. Proteinlerin metabolite bağlanması onların yakınlık tarafından izole edilir, sonra elüe ve kütle spektrometresi ya da Batı lekeleme tarafından tanımlanır. Yöntem hassasiyet ile protein ve metabolit etkileşimi analizini destekleyen, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome-ücretsiz ve özelleştirilebilir basit bir iş akışı vardır. Bu yaklaşım, kompleks biyolojik örneklerde veya arıtılmış proteinleri kullanarak protein-metabolit etkileşimlerini belirlemek için etiketsiz veya amino asit etiketli nicel kütle spektrometresi yöntemlerinde kullanılabilir. Bu protokol tripanosoma bruceiproteinleri analizi için optimize edilmiştir, ancak ilgili protozoon parazitleri, Maya veya memeliyen hücrelere adapte edilebilir.

Introduction

İnositol fosfat (IPS) ve phosphoinositides (PIS) gen ifadesi1,2,3, vezikül kaçakçılığı kontrolü gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesi yoluyla ökaryote biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır 4, sinyal dönüştürücü5,6, metabolizma7,8,9, ve geliştirme8,10. Bu metabolitlerin düzenleyici fonksiyonu proteinlerle etkileşim ve böylece protein fonksiyonunu düzenleyen yeteneğinden sonuçlanır. Proteinler tarafından bağlayıcı üzerine, IPS ve protein konformasyonu11değiştirebilir, katalitik aktivite12, veya etkileşimler13 ve dolayısıyla hücresel fonksiyonunu etkiler. IPS ve, Nucleus2,3,14,15, endoplazmik retikulum16,17, Plasma gibi birden fazla alt hücreli bölmeler halinde dağıtılır membran1 ve sitsol18, proteinlerle ilişkili3,19 veya Rnas20.

Membran ile ilişkili PI (4, 5) P2 fosfolipase C tarafından pedi (1, 4, 5) P3, hangi fosforilize edilebilir veya IP kinazları ve fosfatlar tarafından dephosphorylated, sırasıyla. IPS, proteinlere bağlanan ve düzenleyici fonksiyonları destekleyen çözünebilir moleküllerdir. Örneğin, INS (1, 4, 5) Metazoan P3 IP1 reseptörleri bağlayıcı tarafından ikinci bir haberci olarak hareket edebilir, hangi reseptör Konformasyonel değişiklikleri ve böylece CA serbest bırakmak2 + hücre içi mağazalardan11. INS (1, 3, 4, 5) P4 histon deasetilaz kompleksine bağlanır ve protein kompleksi montajı ve aktivite13düzenler. IPS düzenleyici fonksiyon diğer örnekler kromatin organizasyon21, RNA taşıma22,23, RNA düzenleme24ve transkripsiyon1,2,3 kontrolü içerir . Buna karşılık, genellikle plazma membranı veya organel membranlara protein alımı ile ilişkilidir25. Ancak, 'in gelişmekte olan bir özelliği, membran olmayan bir ortamda proteinleri ile ilişkilendirmek için yeteneğidir3,15,19,26. Bu nükleer reseptör steroidojenik faktör olduğunu, hangi transkripsiyonel kontrol fonksiyonu Pi tarafından düzenlenir (3, 4, 5) P319, ve poli-A polimeraz hangi enzimatik aktivite nükleer PI tarafından düzenlenir (4, 5) P226. IP 'ler ve için bir düzenleyici rol Maya22,27, mammalin hücreleri19,23, Drosophila10 ve Worms28dahil olmak üzere birçok organizmalarda gösterildi. Önemli olan bu metabolitlerin Tripanozomlar içinde rolüdür, bu da erken ökaryotik soydan uzaklaşır. Bu metabolitler tripanosoma brucei transkripsiyonel kontrol1,3, geliştirme8, organel Biyogenez ve protein trafiği önemli bir rol oynar29,30 , 31 , 32ve aynı zamanda patojenler T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 ve Plasmodium geliştirme ve enfeksiyon kontrol dahil edilir 5 , 37. bu nedenle, tripanosomlar içinde IPS ve rolünü anlamak bu moleküller için yeni biyolojik fonksiyon aydınlatmak ve Roman uyuşturucu hedeflerini belirlemek için yardımcı olabilir.

Protein ve IP veya PI bağlamanın özgüllüğü, protein etkileşimindeki etki alanlarına ve Inositol13'ün fosforilasyon durumuna bağlıdır,38, Ayrıca, lipid parçası ile etkileşimler de19oluşur. Çeşitli IPS ve ve onların değiştirme kinazlar ve fosfatları metabolit kullanılabilirliği ve bolluk, inositol fosforilasyon durumu ve protein etkilenir protein fonksiyonunu kontrol etmek için esnek bir hücresel mekanizma sağlar etkileşimin benzeşimi1,3,13,38. Bazı protein alanları iyi karakterize olmasına rağmen39,40,41, örn., pleckstrin Homoloji Domain42 ve SPX (SYG1/Pho81/XPR1) Domains43 ,44,45, bazı proteinler IPS veya ile bilinmeyen mekanizmalar tarafından etkileşimde. Örneğin, T. brucei 'nin baskıcı aktivatör proteini 1 (RAP1) standart Pi-bağlayıcı etki alanlarına sahip değildir, ancak Pi (3, 4, 5) P3 ile etkileşime girer ve antijenik varyasyona katılan genlerin kontrol transkripsiyonu3. Trypanosome, Maya veya memelilerin hücrelerinden IP veya Pi etkileşen proteinlerin benzeşme Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi, bilinen IP veya PI bağlama etki alanları olmadan çeşitli proteinleri tespit etti8,46, 47. Data, bu metabolitleri bağlayan ek karakterize olmayan protein alanları önerir. Bu nedenle, IPS veya ile etkileşim proteinlerin tanımlanması, bu küçük moleküller için protein-metabolit etkileşimi ve yeni hücresel düzenleyici fonksiyonların roman mekanizmaları ortaya çıkarabilir.

Burada açıklanan yöntem, IPS veya 'e bağlanan proteinleri belirlemek için Batı blo, veya kütle spektrometresi ile birleşen benzeşme Kromatografi kullanır. Bu ya da çapraz bağlı streptavidin agaroz boncuk ya da alternatif olarak, streptavidin-konjuik manyetik boncuklar üzerinden yakalanan konjuik olan biyotinlenmiş IPS veya kullanır (Şekil 1). Bu yöntem, hassas, radyoaktif olmayan, Liposome içermeyen basit bir iş akışını sağlar ve proteinlerin hücre endoglikozidazları veya arıtılmış proteinleri3 'ü (Şekil 2) bağlamasını tespit etmek için uygundur. Yöntem, etiket içermeyen8,46 veya karmaşık biyolojik örneklerden IP veya PI bağlama proteinlerini tanımlamak için amino asit etiketli nicel Kütle Spektrometrisi47 ile birleştiğinde kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem birkaç Yöntemler hücresel proteinleri ile IPS veya etkileşimi incelemek için kullanılabilir bir alternatiftir ve bu metabolitlerin tripanosomlar ve belki de diğer Ökaryotlar düzenleyici işlevini anlamada yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. yakınlık Kromatografi ve Batı lekeleme tarafından IP-veya PI-bağlayıcı proteinlerin Analizi

  1. Hücre büyümesi, lizis ve yakınlık Kromatografi
    1. Orta günlük faz ve monitör hücre canlılığı ve yoğunluk T. brucei hücreleri büyümek. Toplam 5,0 x 107 hücre bir bağlayıcı tahlil için yeterlidir.
      1. Kan akışı formları için, 37 °C ve% 5 CO2' de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilen HMI-9 medyadaki hücreleri büyütün. 8,0 arasında hücre yoğunluğu tutun x 105 için 1,6 x 106 hücreler/ml.
        Not: 1,8 x 106 hücre/ml 'Den yüksek yoğunluk, hücre viability etkileyebilir. İki katına- T. brucei 427 gerinim in vitro yetiştirilen zaman 5,5 ve 6,5 h arasındadır.
      2. Procyclic formlar için, hücreleri Grow SDM-79 Orta 27 °C% 10 FBS ile tamamlayıcı ve 1,0 x 107 ve 3,0 x 107 hücreler/ml arasında hücre yoğunluğu tutmak.
      3. Arıtılmış proteinler için (örn. rekombinant proteinler), 450 μL bağlayıcı tampon (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,2% 4-nonyl fenil-Polietilen glikol, pH 7,4) içinde 1 μg protein ve seyreltme 0,5 almak. Batı leke analizi için seyreltilmiş proteinin (girişin)% 5 'ini saklayın. 1.1.7 adıma geçin.
    2. 1.600 x g , Oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 10 dakika santrifüj hücreleri. Süpernatant atın.
      Not: büyük kültür birimlerin santrifüjleme hakkında ek bilgi için adım 2.1.2 bakın.
    3. 10 ml fosfat tampon tuz içinde Pelet yavaşça pelletini pH 7,4 6 mm glikoz (PBS-G) ile tamamlayıcı ve 37 °c ' de önceden ısıtılan hücreleri yıkamak için. Sonra, hücre santrifüjler 1.600 x g 5 dk için RT. prosedürü Iki kez tekrarlayın.
    4. PBS-G 1 ml içinde Pelet resuspend. Ardından, hacmi 1,5 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve 1.600 x g 'de Santrifüjü 5 dakika boyunca atın.
      Not: hücre pelalları sıvı nitrojen içinde dondurulur ve-80 °C veya sıvı nitrojen olarak saklanır.
    5. 0,5 ml lizis tampon (25 mm HEPES, 150 mm NaCl, 1% t-oktylphenoxypolithoxyethanol, pH 7,4) içinde Pelet resuspend 1,5 x proteaz inhibitörü kokteyl ve 1x fosfataz inhibitörü kokteyl (malzeme tablosu) ön-buz içinde soğutulmuş hücrelerde Lyse. 50 RPM 'de 4 °C ' de 10 dakika dönen lysate inküye yapın.
      Not: Bu kritik bir adımdır çünkü proteinler belirtildiği gibi işlenmezse düşebilir. Sodyum Dodesil sülfat-Poliakrilamid jel elektroforezi (SDS/sayfa) ile protein lysate bütünlüğünü kontrol edin.
      DIKKAT: T-oktylphenoxypolithoxyethanol toksik ve cilt ve göz tahrişi neden olabilir. Kullanım eldiven, Eyeshield ve faceshield koruma.
    6. 4 °C ' de 10 dakika için 14.000 x g 'de lysate Santrifüjü. Bağlayıcı assays için yeni bir 1,5 ml tüp içine süpernatant toplayın. Western blot analizi için toplam lysate (giriş)% 5 ' i tutun. Süpernatant lizis tampon ile çıkarılan parazit proteinleri içerir.
    7. Agaroz boncuklarla (örn. 50 μL Bulamaç) ya da 50 μL agaroz boncuklar için konjuge edilen 50 μL IP veya 'i toplayın ve 1.000 x g'de 1 dakika santrifüje gidin. 50 μL 'de süpernatant ve pelletini 'i atın ve boncuklar için bağlayıcı tampon tamponu yapın. Kontrol olarak konjugated olmayan boncuklar kullanın. Spesifik olmayan etkileşimleri kontrol etmek için fosforsuz formlar dahil olmak üzere farklı fosfat konfigürasyonu ile IP/PI-boncuk kullanın.
    8. 50 μL IP veya PI-boncuk hücre lysate veya arıtılmış proteinler ekleyin (her 1 mL boncuk 10 nmol konjuate IPS veya içerir). IP veya PI-boncuk hacmini toplam lysate% 10 içinde tutun ve gerekirse, bağlayıcı reaksiyonu hacmi bağlayıcı tampon ile ayarlayın.
      1. Rekabet assays için, bağlayıcı reaksiyon non-konjugated IPS veya çeşitli konsantrasyonları ekleyin (örneğin, 1-, 10-, 100-Fold molar fazla IP veya PI-boncuk karşılaştırıldığında).
    9. Reaksiyonu 4 °C ' de 1 saat veya gecede, 50 RPM 'de döner.
      Not: proteinin kararlılığına bağlı olarak, arıtılmış proteinler ile bağlayıcı reaksiyonlar RT 'de yapılabilir. IPS veya kullanarak biotin sadece adım 1.1.9.1 devam konjugated, aksi takdirde adım 1.1.10 devam ederseniz.
      1. Ekleme 50 μL streptavidin-manyetik boncuklar bağlayıcı reaksiyon için konjuate ve 1 h için 4 °C ' de 50 RPM 'de dönen Inkük.
    10. 4 °C ' de 1.000 x g 'de 1 dak için karışımı Santrifüjü. Süpernatant çıkarın (akış-through) ve Pelet tutun. Western leke analizi için süpernatant% 5 tutun.
      Not: manyetik boncuk kullanıyorsanız, süper natantları çıkarın ve bir manyetik standı kullanarak sonraki yıkanmaları gerçekleştirin (santrifüjler gerekli değildir).
    11. 1 ml yıkama tamponu (25 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,2% 4-nonyl fenil-Polietilen glikol, pH 7,4) ekleyin ve tüpü dokunarak veya tıkayarak reçineyi pelletini (boncuk pipet uçları takabilir çünkü pipet kullanmayın). 4 °C ' de 1.000 x g 'de 1 dakika için reaksiyonu santrifüjün ve supernatant atın. Toplam beş yıkanıyor için yordamı tekrarlayın.
      DIKKAT: 4-nonyl fenil-Polietilen glikol toksik ve cilt ve göz tahrişi neden olabilir. Kullanım eldiven, Eyeshield ve faceshield koruma.
    12. Ekleme 50 μL 2x Laemmli tampon ile Takviyeler 710 mM 2-mercaptoethanol boncuklar ve mix dokunarak veya girdap proteinleri elute. Isı 95 °c 5 dakika için, daha sonra 1 dakika için 10.000 x g için Santrifüjü ve süpernatant toplamak (içerilmiş proteinler içerir). Alternatif olarak, SDS kullanmaktan kaçınmak için 8 M Urea/100 mm glisin pH 2,9 ile elute proteinleri. -80 °c ' de yıkantıdaki 'i dondurur, aksi takdirde Batı leke analizine devam edin.
      DIKKAT: 2-mercaptoetanol toksik ve cilt, göz ve solunum tahrikine neden olabilir. Eldiven kullanın ve kimyasal kaput içinde çalışın.
  2. Western blot Analizi
    1. 5 μL 4X Laemmli tampon ile 15 μL giriş (adım 1.1.6) veya akış yoluyla (adım 1.1.10) örneklerle karıştırın. 95 °C ' de 5 dakikalık ısı girişi ve akış örnekleri. 8 M Urea/100 mm glisin pH 2,9 olarak oluşturulan örneklere göre, 5 μL 4X laemmli tampon ile 15 μL ' lik bir karıştırma ve 95 °c ' de 5 dakika ısıtın.
      Not: Bu adım, 2x laemmli arabelleğinde elüe örnekleri için gerekli değildir.
    2. 4-20% sds/page jel, 2,5 μL giriş, 2,5 μL debi-through ve 20 μl elüe numune ile yük kuyuları ve üreticinin tavsiyesine göre yük proteini merdiven.
      Not: faiz proteininin moleküler ağırlığına göre% jel seçin.
    3. Çalışan tampon içinde 30-45 dk için 150 V 'de SDS/PAGE çalıştırın veya Laemmli tampon mavi boya jel sonunda kadar.
      Not: çalışma süresi laboratuar ekipmanına göre değişebilir.
    4. Jeli cam (veya plastik) plakalardan çıkarın ve 15 dakika boyunca transfer tamponunun içine çekin.
    5. Proteinleri Poliviniliden diflorür (PVDF) membran veya nitroselüloz membrandan aktarın. Transfer tamponunun içinde membran ve 3 mm filtre kağıdı çekin. Üç yaprak filtre kağıdı, nitroselüloz veya PVDF membran, jel ve ek bir üç yaprak filtre kağıdı ile bir sandviç birleştirin. Hiçbir hava kabarcıkları sandviç sıkışmış olduğundan emin olun. Gerekirse kabarcıkları kaldırmak için bir silindir kullanın. Kasetin anot tarafındaki katot ve jel üzerindeki membranı ayarlayın.
      Not: membran aktivasyonu veya leke hazırlama hakkında bilgi için membran üreticisinin talimatlarını kontrol edin.
    6. Transfer tamponu ile sandviç içeren kaseti transfer tankına yerleştirin. Tankı bir buz kovasına veya 4 °C ' ye (örn. soğuk odada) yerleştirin. 100 V 'de 1 h için transfer proteinleri (akım 200-400 mA arasında değişmektedir). Alternatif olarak, gece 4 °C ' de 15 mA sabit akımı ile transfer edilir.
    7. Zarı kasetten çıkarın. Membranı bloke etmek için RT 'de 1 saat boyunca% 0,05 polisorbat 20 (PBS-T) veya uyumlu engelleme çözeltisi ile PBS 'de seyreltilmiş% 6 yağ içermeyen kuru sütte membran kuluçta yapın.
      Not: membranı engellemeden önce, transferin kalitesi Ponceau S lekesi kullanılarak kontrol edilebilir. Membranı 15 mL Ponceau S 'de 1 dakika boyunca inküye, suda durulayın ve bantları görselleştirin.
    8. Engelleme çözümünü çıkarın ve PBS-T ' d e seyreltilmiş% 6 yağ içermeyen kuru sütte seyreltilmiş primer antikorların 50 RPM dönüşü ile RT 'de 1 h için membranı inkük. Alternatif olarak, membran gece 4 °C ' de 50 RPM dönüşü ile Inküye.
      Not: inkübasyon süresi antikorların kalitesine göre farklılık gösterebilir; Ancak, çoğu antikorlar RT 1-3 h inkümleri ile çalışacaktır. antikor konsantrasyonu veya seyreltme için üreticinin tavsiyesini takip edin.
    9. RT 'de 50 RPM dönüşü ile 5 dakika boyunca PBS-T ' d e membran inküte ederek leke yıkayın. işlemi 3-5 kez tekrarlayın. Antikorların kalitesine bağlı olarak daha fazla yıkama gerekebilir.
    10. 50 RPM rotasyonlu PBS-T ' d e seyreltilmiş% 6 ' lık yağ olmayan kuru süt içinde RT 'de 1 h için konjutik peroksidaz (HRP)-Conjugated Secondary antikorlar içinde membranı kulbe etme.
      Not: antikor konsantrasyonu veya seyreltme için üreticinin tavsiyesini takip edin.
    11. 1.2.9 adımda belirtildiği gibi yıkama leke.
    12. Membranı kapsayacak şekilde kemiluminesans substrat ekleyin. Substrat fazlalığını çıkarın ve karanlıkta RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın.
      Not: kemiluminans reaktifleri hakkında öneriler için üreticinin talimatlarını kontrol edin.
    13. Kamera tabanlı bir görüntüleştirici kullanarak kemiluminesans sinyali yakalayın. Alternatif olarak, chemiluminesans sinyali yakalamak için bir X-ışını filmi kullanın.

2. ilgi Kromatografi ve kütle spektrometresi ile IP/PI-bağlayıcı proteinlerin Analizi

  1. Hücre büyümesi, lizis ve yakınlık Kromatografi
    1. Orta günlük faz ve monitör hücre canlılığı ve yoğunluk T. brucei hücreleri büyümek.
      Not: toplam 1,0 x 1010 hücre, iki bağlama açıklaması için yeterlidir. Burada belirtilenden daha az hücre kullanmak, kütle spektrometresi tarafından düşük bolluk proteinlerinin algılanmasını etkileyebilir.
      1. T. brucei kan akışı formları için, 37 °c ' de% 10 FBS ve% 5 Co2ile desteklenen HMI-9 medyasında (8,0 x 105-1,6 x 106 hücre/ml) günlük orta faz hücrelerini büyütün. 427 gerilme için 5 L kültür 0.5-1.0 x 1010 hücre verecektir. 1,8 x 106 hücre/ml hücre viability etkileyebilir daha yüksek yoğunluk önlemek için hücre büyümesini izleyin. Hücre kültürü hacmi 1/10 için Flask hacmi tutun; Aksi takdirde, hücrelerin büyüme oranı kötü havalandırma nedeniyle etkilenecektir.
        Not: 427 gerilme 5.5-6.5 h ikiye katlama süresi vardır.
      2. Procyclic formlar için, hücreleri Grow SDM-79 Orta 27 °C% 10 FBS ile tamamlayıcı ve 1,0 x 107 ve 3,0 x 107 hücreler/ml arasında hücre yoğunluğu tutmak. 500 mL kültür 0.5-1,5 x 1010 hücre verecektir.
    2. 1.600 x g 'deki hücreleri RT 'de 15 dakika boyunca santrifüjün. süpernatant 'ı atın ve 200 ml 'lik PBS-g ' d a k i, 37 °c ' de önceden ısıtılan Pelet ile pelletini. Yuvarlak alt santrifüjleme tüpleri (malzeme tablosu) kullanın, çünkü T. brucei kan akışı formu Pelet sabit açılı santrifüj rotorlar kullanıldığında kolayca rahatsız edilir. Hücreleri 1.600 x g 'de yeniden SANTRIFÜJLER, RT 'de 5 dk.
    3. Süpernatant kaldırmak ve PBS-G 10 ml Pelet pelletini. Hücre santrifüjler 1.600 x g 'de 5 dakıka için RT. prosedürü tekrarlayın ve son yıkamadan sonra supernatant atın.
      Not: Peleler sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve-80 °C veya sıvı nitrojen olarak saklanan flaş olabilir.
    4. 30 mL Liz tamponu içinde hücre peleti, buzda önceden soğutulmuş ve 1,5 x proteaz inhibitörü kokteyli ve 1x fosfataz inhibitörü kokteyli (malzeme tablosu) ile tamamlayıcı olarak yeniden resuspend. 50 RPM 'de 4 °C ' de dönen lysate 10 dak.
    5. 4 °C ' de 10 dakika için 10.000 x g 'de lysate Santrifüjü. Süpernatant (çözünen proteinleri) toplayın ve 20 ml bağlayıcı tampon içinde seyreltilir.
    6. Agaroz boncuklarla (örn. 400 μL Bulamaç) ya da 400 μL kontrol boncukları için konjuge edilen IPS veya 400 μL 'yi toplayın ve 400 RT 'de 1.000 x g 'de 1 dakika santrifüj yapın Spesifik olmayan etkileşimlere göre protein-metabolit etkileşimlerinin spesifik zenginleştirmesini belirlemek için agaroz boncukları negatif bir kontrol olarak kullanın (örn., özellikle boncuklara bağlayan proteinler). Fosfat ücretleri veya biotin bağlayıcı nedeniyle spesifik olmayan etkileşimler için kontrol etmek için non-phosphorylated formları da dahil olmak üzere farklı fosfat yapılandırmaları ile IPS veya kullanın.
    7. 400 μL IP/PI-boncuk veya kontrol boncukları 10 mL lysate ekleyin ve 1 saat veya bir gecede 4 °C ' de 50 devirde döner. Sadece biotin ile konjugated IPS veya kullanıyorsanız (boncuk olmadan) adım 2.1.7.1 devam, aksi takdirde adım 2.1.8 devam.
      1. 100 μL streptavidin ekleyin-manyetik boncuklar için konjuate ve 50 RPM 'de dönen 4 °C ' de 1 h için inkük.
    8. 1.000 x g 'de 4 °c ' de 1 dakika için bağlayıcı reaksiyonu Santrifüjü. Süpernatant çıkarın (akış-through) ve Pelet tutun. Western leke analizi için süpernatant% 5 tutun.
    9. Pelet için 5 ml yıkama tamponu ekleyin, tüpü dönen ile hafifçe karıştırın ve sonra 4 °c ' de 1.000 x g 'de 1 dakika Santrifüjüne gidin. Süpernatant atın. Yıkama beş kez tekrarlayın. Manyetik boncuk kullanıyorsanız, süpernatanlarında toplayın ve bir manyetik stand kullanarak yıkıyor gerçekleştirin (santrifüjler gerekli değildir).
    10. Ekle 50 μL 2x laemmli tampon (veya 8 M Urea/100 mm glisin pH 2,9, SDS kullanmaktan kaçınmak için) boncuklar ve mix dokunarak veya Vortex (boncuk pipet uçları ekleyebilirsiniz çünkü pipetleme kaçının), ve sonra ısı 95 ° c 5 dakika için. 1 dk için 10.000 x g Santrifüjü ve süpernatant (eluted proteinleri) toplamak. Üç kesirler toplam toplamak için iki kez yordamı yineleyin.
    11. -80 °C ' de devam edin, aksi takdirde SDS/PAGE 'de proteinleri ayırın veya tripsinizasyon ve kütle spektrometresi analizi için çözelti tutun.
  2. Kütle spektrometresi için proteinlerin tripsin sindirimi
    Not: Bu prosedürün Iki varyasyonları Bölüm 2.2.1 (jel) veya bölüm 2.2.2 (çözelti) proteinlerin sindirimi için gösterilir. Protein düşük bağlayıcı tüpler örnek kayıpları önlemek için tavsiye edilir. Proteomikler tesisinde bir analitik kimyager ile ilgili örnekler ve kitle spektrometresi enstrümanları için protokolün uyguniyetini inceleyin.
    1. Protein içinde-jel tripsinizasyon
      1. SDS/PAGE 'de protein ayrılması sonrasında, jeli yüksek saflıkta suda kısaca durulayın. Jel temiz bir cam plaka üzerine aktarın. Temiz bir bıçak ile tüketim proteini bantları ve dış bantları ekstra jel kesme kaçının. Küçük parçalara (örneğin, yaklaşık 1 mm kare) jel parçaları kesmek ve 1 mL tüp içine aktarmak. Gerekirse bir pipet ucu kullanın, ancak pipet ucunun kullanmadan önce etanol içinde Durulanmadan emin olun.
        Not: jel kontaminasyonunu önlemek için eldivenler kullanın. Jel parçaları-20 °C ' de saklanabilir.
      2. Jel parçalarını durulamak için tüplere yüksek saflıkta veya yüksek performanslı sıvı kromatografi sınıfı su 100 μL ekleyin. Suyu atın.
        1. Coomassie veya Ruthenium tabanlı floresan lekeli jel parçaları için, 1 h için (25 mM NH4HCO3 in 50% acetonitrile), ek çözelti içinde jel parçaları inkük çözüm atın. Boyama görünmez olana kadar prosedürü tekrarlayın.
          Not: NH4HCO3 Içeren ÇÖZÜMLERI, 100 mm NH4HCO3, pH 7,8 ' de bir stok çözümden seyreltme ile hazırlayın.
          DIKKAT: Asetonitril, yanıcı ve toksik uçucu bir çözücüdür. NH4HCO3 cilt veya göz tahrişine neden olabilir. Eldiven kullanın ve kimyasal bir kaput altında çalışın.
        2. Gümüş lekeli jel parçaları için, 30 dakika boyunca su içinde gümüş leke (15 mM K3[Fe (CN)6], 50 mm na2S2O3) için kabarınma çözeltisi 50 μL içinde jel parçaları inkük. solüsyonu atın ve jel parçalarını 200 μL ile yıkayın su. Tekrar yıkayın beş kez veya jel sarı renk görünmüyor kadar.
          DIKKAT: K3[Fe (CN)6] cilt veya göz tahrişine neden olabilir. Eldiven kullan.
      3. 200 μL Asetonitril kullanarak jel parçalarını 10 dk 'da RT 'de kurutur. Ardından, çözümü atın.
        Not: susuz jel parçaları, cilt, opak ve yapışkan küçük. Birkaç adet jel tek bir tüpte birleştirildiğinde, jel parçalarının verimli dehidratasyonu için prosedürü tekrarlayın.
      4. 50 μL (veya jel parçalarını kapsayacak kadar hacim) ekleme (100 mm NH4HCO3' te 10 mm ditiyotreitol [DTT]) ve 1 saat için 56 °c ' de inküye yapın. daha sonra, tüpler RT için serin ve azaltma çözeltisi aşan atın.
      5. 50 μL (ya da jel parçalarını kapsayacak kadar hacim) ekleyin (100 mM NH4HCO3' te 50 mm iodoacetamid) ve karanlıkta RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın. Daha sonra, alkilasyon çözeltisi aşan atın.
      6. 200 μL Asetonitril ile jelleri, RT 'de 10 dakika boyunca kurutur. asetonitrile çıkarın ve 100 mM NH4HCO3 ile jel parçalarını RT 'de 10 dakika nemlendirin.
      7. 200 μL Asetonitril ile tekrar 10 dk için RT ve çözelti aşan atın jel parçaları kurutmak.
      8. 50 mM NH4HCO3 tamponunun içinde seyreltilmiş 15 μL kütle spektrometresi dereceli tripsin ekleyin veya hidrat jel parçalarını kapsayacak ve 37 °c ' de 4 saat ya da bir gecede inkük etmek için yeterli hacim. 100 arasında toplam tripsin tutarlar tutun 500 ng (veya 20 ng tripsin/μg protein).
      9. Numuneyi RT 'ye serin ve 2.000 x g 'de 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjün. Su içinde seyreltilmiş% 5 formik asit 10-20 μL ekleyin ve RT 'de 10 dakika boyunca inküye yapın.
        DIKKAT: formik asit, yanıcı, korozif ve toksik. Eldiven kullanın ve kimyasal bir kaput altında çalışın.
      10. Santrifüj adım 2.2.1.9 belirtildiği gibi, daha sonra farklı bir tüp için (ayıklanan peptitler içerir) süpernatant toplamak. 20 μL% 5 formülik asit% 50-60 Asetonitril tüp seyreltilmiş ve RT 10 dk için inküye ekleyin. aynı tüpte çıkarılan peptid fraksiyonları toplayın.
      11. Numuneyi bir vakum konsantratörünü kurutun ve 10 μL 0,5% asetik asit ve kütle spektrometresi analizi için% 2 Asetonitril olarak yeniden oluşturur. Santrifüj ve tüp altında çözüm toplamak; -20 °C veya-80 °C ' de depolama çözümü.
    2. Protein çözeltisi tripsinizasyon içinde
      1. Numune hacmini, tuzlama ve tampon değişimi azaltmak için proteinleri çökeltir. Numunenin altı adet soğutulmuş (-20 °C) aseton ekleyin, örn., 600 μL 'den 100 μL 'ye kadar örnek. Vortex ve-20 °C ' de 15 dk ile 1 saat arasında inkük. Çözüm bulutlu veya bir çökelme formu dönecek.
        DIKKAT: aseton toksik ve yanıcı. Eldiven kullanın ve kimyasal bir kaput altında çalışın.
      2. Santrifüj numuneleri 4 °C ' de 30 dk. aseton ve hava-kuru Pelet 15 dakika için.
      3. 50 mm 'de 10 μL 6-8 M üre veya% 1 SDS ekleyin NH4HCO3 , pelet ve girdap için karıştırmak için çözülür. Daha büyük miktarlarda proteinler için (> 10 μg), 20 μL 'ye kadar çözünme tamponu kullanın.
      4. 5 μL azaltma solüsyonu ve Vortex ekleyin. Bir mikrosantrifüjü kullanarak ses seviyesini aşağı döndürün. Numuneler Urea 'da seyreltiliyorsanız, RT 'de 1 h için inküye yapın. Numuneler SDS 'de seyreltiliyorsanız, 56 °C ' de 1 saat boyunca inkübe edilir.
      5. Bir mikrosantrifüjü kullanarak ses seviyesini aşağı döndürün. 3 μL alkillenme solüsyonu ve Vortex ekleyin. Sonra, ses seviyesini aşağı döndürün ve RT 'de 30 dakika boyunca karanlıkta inküye yapın.
      6. Reaksiyonu nötralize etmek için 3 μL azaltma çözümü ekleyin. 50 mm NH4HCO3kullanarak numuneyi 1 M üre veya% 0,05 SDS 'ye yavaşça seyreltin.
        Not: tripsin sindirim tamponu deterjan veya denaturant olmalıdır. Denatüranlar için konsantrasyon limitleri: 0,05% sds; 0,1% Oktil B-D-glukopyranoside; 0,1% 4-nonilfenil-Polietilen glikol; 0,1% t-oktylphenoxypolithoxyethanol; 0,1% polisorbat 20; 0,1% 3-[(3-kolaminoprokül) dimethylammonio] -1-propanesulfonate; < 1 M üre veya Thiourea.
      7. 50 mM NH4HCO3 tamponunun içinde seyreltilmiş 5 μL Kütle Spektrometrisi dereceli tripsin ekleyin ve 37 °c ' de 4 saat veya gece boyunca inküye yapın. Toplam tripsin tutarları 100 ve 500 ng (veya 20 ng tripsin/μg protein) arasında tutun.
      8. RT örnek serin ve bir mikrosantrifüjü kullanarak ses aşağı spin. Reaksiyonu gidermek için% 5 asetik asit (veya% 50 Asetonitril içinde% 5 formik asit) ekleyin.
      9. 2.2.1.11 adımda belirtildiği gibi bir vakum konsantratördeki numuneleri kurutun. Örnekleri-80 °C ' de saklayın. Desalt ve konsantre peptidler C18 zip-ucu gibi ters faz sütunu kullanarak ve sonra kütle spektrometresi tarafından analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RAP1 ve PI Analizi (3, 4, 5) yakınlık Kromatografi ve Batı lekesi ile P3 etkileşimi
Bu örnek, RAP1 tarafından t. brucei lysate veya rekombinant t. brucei RAP1 proteini tarafından bağlama çözümlemek için bu yöntemin uygulama gösterilmektedir. Hemagglutinin (HA) ifade eden T. brucei kan akışı formları Lysates-RAP1 etiketli bağlayıcı olarak kullanıldı. RAP1 varyant yüzey glikoprotein transkripsiyonel kontrol dahil olan bir protein (VSG) genler3,48, hangi yüzey proteinleri antijenik varyasyon tarafından parazite bağışıklık kaçırma dahil için kodlamak49. RAP1, VSG Gen transkripsiyonu1,3' ün kontrolünde de işlev gören fosfatidilositol 5-fosfataz (PIP5Pase) enzim3ile telomerik protein kompleksi içinde etkileşime girer. RAP1 bir N-terminal meme kanseri vardır 1 karboksil-Terminal (brct) bir myeloblastosis (MYB) DNA-bağlayıcı etki alanı ve C-Terminal MYB benzeri etki alanı3,48tarafından takip edilir. Ancak, kurallı PI bağlama etki alanları yoksun. Bağlayıcı olmayan fosforile veya ositol halka farklı konumlarda fosforylated olan ve non-konjugated agaroz boncuklar ile PIR ile yapılmıştır. Batı Analizi RAP1 için tercihen PI (3, 4, 5) P3-boncuk (Şekil 3a) bağlar, ama aynı zamanda Pi (4, 5) P2-boncuk daha az ölçüde bağlar gösterir. Ancak, herhangi bir diğer veya agaroz boncuklar bağlanmadı. RAP1 MultiProtein kompleksi3bir parçası olduğundan, bazı ile etkileşimi doğrudan olmayabilir ve bu nedenle diğer hücresel PROTEINLERI ile RAP1-ha etkileşiminden sonuçları bağlamak.

Bu nedenle, RAP1 doğrudan bağlar olup olmadığını test etmek için, C-Terminally etiketli 6x-onun rekombinant RAP1 (rRAP1) protein ifade edildi ve E. coli3homojenliği için temizlendi. Protein, Pi (3, 4, 5) P3-boncuk (3, 4, 5) P3 ya da Pi (4, 5) P2 rakip konsantrasyonlarda varlığı ile bağlayıcı deneyleri kullanılmıştır. Batı Blot, Pi (3, 4, 5) P3 artan konsantrasyonları gösterir, ama Pi (4, 5) P2 rRAP1 Pi ile etkileşimi inhibe (3, 4, 5) P3 (Şekil 3B). Dahası, T. brucei PIP5Pase enziminin eklenmesi reaksiyonda Pi geri yüklendi (3, 4, 5) rRAP1 tarafından P3-bağlayıcı, hangi ücretsiz PI PIP5Pase olan kaynaklanmaktadır (3, 4, 5) P33 ve böylece gösterir Bu fosforilasyon deseni metaboliti rRAP1 bağlayıcı için önemlidir. Bu nedenle, rRAP1 ile etkileşime girer PI (3, 4, 5) P3 gibi RAP1-HA T. brucei Lysates. Dahası, veri, RAP1-HA ' ı lysate 'den PI 'ye (4, 5) P2 'ye bağlamanın, kompleks içindeki diğer proteinler ile RAP1 etkileşiminin (örn. PIP5Pase)3olduğunu gösterir. Veriler, hücre endoglikozidazları ve rekombinant proteinleri ile bağlayıcı kavramların tamamlanığını göstermektedir. Aynı zamanda, protein ve arasındaki etkileşimlerin özgüllüğünü belirlemek için rekabetçi bağlama programının yardımcı programını gösterir.

İnlerin tanımlanması (1, 4, 5) yakınlık Kromatografi ve kütle spektrometresi ile P3 bağlayıcı proteinleri
Bu örnekte, INS 'e bağlanan T. brucei proteinleri tanımlamak için kitle spektrometresi tarafından izlenen benzeşme Kromatografi kullanılmıştır (1, 4, 5) P3; Bu nedenle deney, potansiyel INS (1, 4, 5) P3 bağlayıcı proteinleri T. brucei kan akışı formlarından araştırmaz. T. brucei lysate INS (1, 4, 5) ile inkübe edildi P3 agaroz boncuk veya olmayan konjuate boncuklar (bir kontrol olarak kullanılır) ile konjudu ve bağlı proteinler laemmli örnek tampon ile elüe. SDS/page analizi, agaroz boncuklardan (Şekil 4A) gelen proteinlere kıyasla INS (1, 4, 5) P3-boncuklar tarafından ekilmiş proteinlerde zenginleştirme gösterir. 250 proteinleri üzerinde tespit edilen ve 84 INS (1, 4, 5) P3 boncukları kontrol boncuklara kıyasla kütle spektrometresi Analizi (Şekil 4B, kat değişimi [FC] ≥ 2, p < 0,05). INS (1, 4, 5) P3 bağlı proteinlerin zenginleştirme kontrol boncukları SDS/PAGE tarafından algılanan protein sinyali ile ilişkilendirir. Veri bağlama INS (1, 4, 5) P3 ve proteinlerin INS (1, 4, 5) P3 bağlama mekanizmaları bilinmeyen8olduğu doğrulandı proteinleri içerir. Dahası, INS (1, 4, 5) P3 bağlayıcı proteomu ins (1, 3, 4, 5) P4 ve diğer8, bu proteinlerin bazı ins belirli fosfat yapılandırma tanımak öneriyor büyük ölçüde farklı (1, 4, 5) P3. Bu nedenle, biotin-Tagged INS (1, 4, 5) P3, INS (1, 4, 5) P3 bağlamak proteinlerini belirlemek için kütle spektrometresi birleştiğinde yakınlık kromatografi için kullanılabilir. Yaklaşım diğer IPS veya3,8,46,47bağlamak proteinleri belirlemek için keşfedilebilir.

Figure 1
Şekil 1 : Bağlama Için benzeşme reaktifler. (A) PI (3, 4, 5) P3 (üst) ve INS (1, 4, 5) P3 (Bottom) Inositol SN1 pozisyonunda biotin konjuere. İçinde PI (3, 4, 5) P3, biotin ositol SN1 pozisyonunda lipid zincirine konjuated, INS içinde ise (1, 4, 5) P3 biotin pozisyonunda fosfat için konjuyedir SN1. (B) INS (1, 4, 5) P3 biotin ile konjuit ve boncuk (örneğin, agaroz veya manyetik boncuk) konjud streptavidin bağlama yoluyla yakalanan. Bu reaktiflerin varyasyonları biotin yerine özel sentezlenmiş linkers kullanarak da mümkündür46. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : Protokollerin iş akışı, T. brucei PROTEINLERI Ile IP veya PI benzeşimi etkileşiminin analizine yönelik adımları ve (A) Batı blok veya (B) kütle spektrometresi tarafından algılanmasını açıklar. AC-WB, yakınlık Kromatografi ve Batı lekeleme; AC-MS, benzeşme Kromatografi ve kütle spektrometresi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : T. brucei RAP1 fosfoinositidler için bağlayıcı. (A) T. brucei (5,0 x 107 parazitler), bu ekspres ha-Tagged RAP1 2 h 4 ° c 50 μL ile (her 1 ml agaroz boncuk 10 nmol konjugated PIS) veya agaroz (AG) boncuklar için inkübe edildi. Bağlama reaksiyonu yıkanmış ve 2 x Laemmli numune tamponu ile temizlenmiş ve 95 °C ' de 5 dakika ısıtıldı. proteinlerin% 4-20 SDS/PAGE, bir PVDF membran transfer ve monoklonal antikorlar Anti-HA ile probed (1:5000,% 6 PBS-süt seyreltilmiş) izledi Anti-Mouse IgG-HRP (1:5000,% 6 PBS-süt içinde seyreltilmiş) ve kemiluminerence ile algılanır. (B) 50 ΜL PI (3) ile RT 'de 1 h için bir μg rRAP1 inkübe edildi 4, 5) P3-agarose boncuk varlığı veya yokluğunda 5 Için 50 μm dioctanoylgliserol (DIC8) Pi (3, 4, 5) P3, 20 to 50 ΜM diC8 Pi (4, 5) P2, veya 50 ΜM diC8 PI (3, 4, 5) p3 ve 250 ng PIP5Pase saflaştırılmış T. brucei kan dolaşımına formları3. Bağlama, Mouse Anti-onun HRP monoklonal antikorları (1:2000,% 6 PBS-süt seyreltilmiş) ile Batı Blot tarafından analiz edildi ve kemiluminescence tarafından geliştirilmiştir. Bu rakam Cestari ve ark.3' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : INS 'e bağlanan T. brucei proteinlerinin benzeşme Kromatografi ve kütle spektrometresi Analizi (1, 4, 5) P3. (A) INS (1, 4, 5) P3-boncuk veya agaroz boncuk bind T. brucei proteinlerin% 10 SDS/sayfa analizi. 5,0 x 109 ' lu lysates 4 °c ' de 2 h ile 400 μL INS (1, 4, 5) P3 ile agaroz boncuklarla veya agaroz boncuklar (1, 4, 5) P3 ile konjonktür olan 1 ml 'de 10 nmol konjuly ins (1, 4, 5) P3] içerir. Bağlayıcı reaksiyon 2 x Laemmli numune tamponunun içinde yıkanır ve 95 °C ' de 5 dakika boyunca kaynatılır. Proteinler% 10 SDS/PAGE 'de ayrıldı ve Coomassie boyama (malzeme tablosu) ile lekelendiler. Ok uçları INS (1, 4, 5) P3-boncuklar agaroz boncuk ile karşılaştırıldığında zenginleştirilmiş proteinleri gösterir; Daireler her iki ins (1, 4, 5) P3-boncuk ve agaroz boncuklar mevcut proteinleri gösterir ve braket her ikisi de mevcut olan ama INS (1, 4, 5) P3-boncuk agaroz boncuklar ile karşılaştırıldığında zenginleştirilmiş proteinleri belirtir. (B) dot-Plot, agaroz boncuklar ile karşılaştırıldığında INS (1, 4, 5) P3-boncuk zenginleştirilmiş kütle spektrometresi tarafından tanımlanan proteinleri gösterir. FC > 2 ve pdeğeri < 0.05 tarafından tanımlanan zenginleştirme. Agarose boncuklar AC-MS için dört biyolojik çoğaltır ve IP3-boncuk AC-MS için üç biyolojik çoğaltır kullanılmıştır. kat-değiştirme proteinleri IP4-boncuklar vs agarose-boncuk tanımlanan bir peptid spektrum yoğunluğu kullanılarak hesaplanır MSstat50. Detaylı sonuçlar ve peptidler listesi mevcuttur8. Kütle spektrometresi ham verileri, gurup ortak deposu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumu üzerinden PXD005907 tanımlayıcısı ile de kullanılabilir. Bu rakam Cestari ve ark.8' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IPS veya 'e bağlanan proteinlerin tanımlanması, bu metabolitlerin hücresel fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Batı leke veya kütle spektrometresi ile bağlantılı benzeşme kromatografi, IP veya PI etkileşimi olan proteinlerin belirlenmesi ve dolayısıyla düzenleyici fonksiyonları hakkında öngörüler elde etmek için bir fırsat sunar. IPS veya kimyasal olarak etiketlenmiş [örn., INS (1, 4, 5) P3 kimyasal olarak biotin bağlı] ve streptavidin yoluyla agaroz boncuklar için çapraz bağlı veya streptavidin tarafından yakalanan manyetik boncuk daha sonra kitle tarafından tespit edilebilir etkileşen proteinlerin yalıtım sağlar spektrometri veya Batı Blot. Burada açıklanan protokoller, T. brucei3,8 ve memeliler hücrelerinden proteinleri tanımlamak için kullanılan bu metabolitleri bağlamak47 . Özelleştirilmiş etiketleri kullanan yaklaşım varyasyonları (biotin dışında) da Maya46kullanılmıştır. Bu yaklaşımla ilgili önemli bir önem, belirli olmayan etkileşimlerden spesifik ayrımcılık yapmak için denetimler kullanmaktır. Non-konjume boncuklar temel bir kontrol, ama ek kontroller olmayan fosforilated berbat içerebilir veya inositol boncuk3konjuated. Farklı fosfat kombinasyonları ile IPS veya3,8 de bu metabolitler için protein bağlayıcı etki içerebilir çünkü kullanılabilir ositol38fosfat yapılandırma ayrımcılık, 39,40,41. Ayrıca, örnek karmaşıklık yaklaşımı duyarlılığı etkileyebilir ve bu nedenle örnek fraksiyonlama tarafından örnek karmaşıklığı azalan hücrede düşük bol proteinlerin algılanmasını yardımcı olabilir. Hücre fraksiyonlama ve mitokondri51, Nucleus52, glycosome53ve flagellum54,55 trypanosomes gelen yalıtım için iyi kurulmuş protokoller vardır. Arabellek ve reaktifler alt hücresel fraksiyonlarını kullanılan arabellekleri ve bu protokolde kullanılan reaktifler ile uyumluluk için ayarlanması gerekebilir unutmayın. Özellikle, burada belirtildiği gibi benzeşme Kromatografi tarafından IPS veya bağlamak proteinlerin tanımlanması, etkileşim protein ve metabolit benzeşimi bağlıdır ve böylece IPS veya için zayıf bir benzeşimi olan proteinler kolayca algılanamayabilir.

Hücre lysate proteinleri ile IP veya PI etkileşiminin analizi de bu metabolitleri doğrudan bağlaması olmayan proteinlerin tanımlanması neden olabilir, ancak diğer proteinler ile Kompleks protein dernek hangi etkileşim sonuçları IPS bind veya. Bu özellik, T. brucei lysate gelen RAP1-ha Pi (3, 4, 5) P3-boncuk ve Pi (4, 5) P2-boncuk bağlamak Için görünen Şekil 3A, örneklenmiştir. Ancak, bağlayıcı, bu protein PI (3, 4, 5) P3 ve PI (4, 5) P23bağlar onun etiketli rRAP1 göstermek ile diyor. Bu Şekil 3B'de gösterilmiştir, hangi rekabetçi gösterimlerin gösterir ki ücretsiz Pi (3, 4, 5) P3 ama ücretsiz Pi (4, 5) P2 rRAP1 IÇIN yarışır-Pi (3, 4, 5) P3-boncuklar ile etkileşimi. PI (4, 5) P2-boncuklar ile RAP1 görünen etkileşimi, PI (4, 5) P2 (örn., PIP5Pase)3' ü bağlayan proteinlerle kompleks içinde RAP1 ilişkilendirmesi nedeniyle olur. Bu nedenle, hücre endoglikozidazları bağlayıcı deneyleri doğrudan veya dolaylı olarak IPS veya bağlamak proteinleri tanımlayabilir. Özellikle, dolaylı etkileşimler, eski bir biyolojik fonksiyon (protein kompleksi bağlamında) etkileyen veya metabolit bağlayıcı etkilenir olabilir beri spesifik olmayan etkileşimler farklıdır. Örneğin, INS (1, 4, 5, 6) P4, Multi-subunit Co-repressor deasetilaz kompleksine bağlanır ve karmaşık montaj ve aktivite13' ü kontrol eder. Bu nedenle, proteinleri ile IP/PI etkileşimlerini doğrulamak için esastır. Etkileşimin doğrulanması, IPS veya SIS ( Şekil 3B'de olduğu gibi)3,8, potansiyel protein alanları56mutasyonları veya saflaştırılmış proteinlerin kullanımı ile rekabeti aşmaları ile ilgilidir doğrudan etkileşimleri belirleyin (Şekil 3A, B)3.

Protein ve IP veya PI etkileşimlerini incelemek için diğer yöntemler, protein yakalama için matrisler olarak hidrofobik membranlara bağlı IPS ya da, veya lipozomlara dahil olan 'e proteinleri bağlamak için proteinleri radyoaktif IPS veya 'e bağlamayı içerir. 42 , 57 , 58. daha da önemlisi, ile protein etkileşimi38membran yapıları gerektiriyorsa, Liposome tabanlı asder tamamlayıcı bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Bu yaklaşımların sınırlamaları düşük verimlilik, düşük hassasiyet, IPS veya dernek bilinmeyen kimyasal oryantasyon58, ya da radyoaktif malzeme42kullanımı içerir. Burada açıklanan yöntem hassas, Liposome içermeyen, radyoaktif olmayan ve IP/PI-boncuk ticari olarak mevcuttur ve böylece özelleştirilmiş kimyasal sentezini gerektirmez. Ayrıca, IPS veya bağlı biotin konumu iyi tanımlanmış, ve ayrıca değiştirilebilir46,58, hangi protein ve metabolit etkileşimi hassas analiz sağlar. Burada açıklanan yöntem, hücre kültüründe amino asitler (SıLAC)47istikrarlı izotop etiketleme gibi nicel kütle spektrometresi yaklaşımlar ile kombine edilebilir, hangi farklı hücresel altında dinamik etkileşimleri belirlemek için kullanılabilir tedaviler veya koşullar. Batı leke veya kütle spektrometresi ile birleşen benzeşme Kromatografi T. brucei, memelilerin hücreleri ve Maya3,8,46, çok sayıda IP veya PI bağlayıcı proteinleri belirlemek için yardımcı oldu 47, IP veya PI-bağlayıcı etki alanları karakterize olmayan proteinleri de dahil olmak üzere, ve aynı zamanda yeni bağlayıcı alanların tanımlanması yardımcı oldu, örneğin, PI (3, 4, 5) P3 bağlayıcı etki47.

Genel olarak, burada açıklanan protokoller, T. brucei'den potansiyel IP veya PI etkileşen proteinlerin incelenmesi ve bu metabolitleri ile Proteinlerin moleküler etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Protokol, diğer tek hücreli parazitlerden veya mammalin hücreler47 ve Maya46gıbı diğer ORGANIZMALARDAN IP veya PI bağlayıcı proteinlerin belirlenecek şekilde kolayca adapte edilebilir ve IPS 'in biyolojik fonksiyonunu daha da anlamanıza yardımcı olacaktır. Ökaryotlar içinde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarın ifşa etmesi gereken bir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Doğal Bilimler ve Kanada Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC, RGPIN-2019-04658) tarafından destekleniyordu; Erken kariyer araştırmacılar için NSERC Discovery fırlatma eki (DGECR-2019-00081) ve McGill Üniversitesi tarafından.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent - control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Bu ay JoVE sayı 149 inositol Fosfatlar fosfatidilositol fosfoinositide protein etkileşimi Tripanosoma metabolitler kütle spektrometresi Batı lekesi yakınlık Kromatografi
Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cestari, I. Identification of… More

Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter