Summary
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van afzonderlijke cellen van geïsoleerde menselijke alvleesklier eilandjes met behulp van een druppel-gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie.
Abstract
Pancreatic eilandjes bestaan uit endocriene cellen met onderscheidende hormoon expressie patronen. De endocriene cellen vertonen functionele verschillen in reactie op normale en pathologische omstandigheden. Het doel van dit protocol is het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van elk type endocriene cellen met het gebruik van een druppeltje gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie. Dergelijke gegevens kunnen worden gebruikt om het genexpressie profiel van elk type endocriene cellen in normale of specifieke omstandigheden te bouwen. Het proces vereist zorgvuldige hantering, nauwkeurige meting en strenge kwaliteitscontrole. In dit protocol beschrijven we gedetailleerde stappen voor de dissociatie, sequencing en data-analyse van menselijke alvleesklier eilandjes. De representatieve resultaten van ongeveer 20.000 humane single Islet-cellen tonen de succesvolle toepassing van het protocol aan.
Introduction
Pancreatic eilandjes vrijgeven endocriene hormonen om de niveaus van de glucose van het bloed te reguleren. Vijf endocriene celtypen, die functioneel en morfologisch verschillen, zijn betrokken bij deze essentiële rol: α-cellen produceren glucagon, β-cellen insuline, δ-cellen Somatostatine, pp-cellen alvleesklier polypeptide en ε-cellen ghreline1. Genexpressie profilering is een nuttige benadering om de endocriene cellen in normale of specifieke omstandigheden te karakteriseren. Historisch gezien werd het hele eilandje genexpressie profilering gegenereerd met behulp van Microarray en volgende-generatie RNA-sequencing2,3,4,5,6,7 , 8. Hoewel het hele eilandje transcriptome informatief is om de Orgaanspecifieke transcripten en kandidaatgenen van de ziekte te identificeren, slaagt het er niet in de moleculaire heterogeniteit van elk eilandje celtype te achterhalen. Laser Capture microdissection (LCM)-techniek is toegepast om rechtstreeks specifieke celtypen te verkrijgen van eilandjes9,10,11,12 maar valt niet op zuiverheid van de beoogde cel Bevolking. Om deze beperkingen te overwinnen, is fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt om specifieke endocriene celpopulaties te selecteren, zoals α-en β-cellen13,14,15,16 , 17 , 18. Bovendien gebruikte dorrell et al. een op antilichamen gebaseerde FACS Sorteer benadering om β-cellen te classificeren in vier subpopulaties19. FACS-gesorteerde eiland cellen kunnen ook worden verguld voor RNA-sequencing van enkelvoudige cellen; de op plaat gebaseerde methoden worden echter geconfronteerd met uitdagingen in schaalbaarheid20,21,22.
Voor het genereren van hoge kwaliteit, grootschalige transcriptome gegevens van elk type endocriene cel, we toegepast microfluïdische technologie voor menselijke eiland cellen. Het microfluïdische platform genereert transcriptome gegevens uit een groot aantal afzonderlijke cellen in een hoge doorvoer, hoge kwaliteit en schaalbare manier23,24,25,26,27. Naast het onthullen van moleculaire kenmerken van een celtype dat in een grote hoeveelheid is gevangen, maakt een zeer schaalbaar microfluïdisch platform identificatie van zeldzame celtypen mogelijk wanneer er voldoende cellen worden geleverd. Vandaar dat de toepassing van het platform op menselijke pancreas eilandjes de profilering van ghrelin-afscheidende ε-cellen toegestaan, een zeldzaam endocriene celtype met weinig bekende functie vanwege zijn schaarste28. In de afgelopen jaren, verschillende studies zijn gepubliceerd door ons en anderen rapporteren grootschalige transcriptome gegevens van menselijke eilandjes met behulp van de technologie29,30,31,32, 33. De gegevens zijn publiekelijk beschikbaar en nuttige middelen voor de Gemeenschap van het eiland om de heterogeniteit van de endocriene cellen en de implicatie ervan bij ziekten te bestuderen.
Hier beschrijven we een op droplet gebaseerd microfluïdisch single-cell RNA sequencing protocol, dat is gebruikt om transcriptome gegevens te produceren van ongeveer 20.000 menselijke eilandje cellen, waaronder α-, β-, δ-, PP, ε-cellen, en een kleiner deel van niet-endocriene cellen 32. de werkstroom begint met geïsoleerde menselijke eilandjes en toont stappen van eilandje celdissociatie, vastleggen in één cel en gegevensanalyse. Het protocol vereist het gebruik van vers geïsoleerde eilandjes en kan worden toegepast op eilandjes van mensen en andere soorten, zoals knaagdieren. Met behulp van deze workflow, kunnen onbevooroordeelde en uitgebreide eiland-celatlas onder baseline en andere omstandigheden worden gebouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dissociatie van menselijke eilandje
- Verkrijgen van menselijke eilandjes geïsoleerd van kadaver orgaandonoren van beide geslacht, leeftijden tussen 15-80 jaar, zonder reeds bestaande ziekten, tenzij eilandjes van donoren met specifieke demografische gegevens zijn vereist voor het doel van de studie.
- Na isolatie, hebben de geïsoleerde eilandjes bewaard in de weefselcultuur faciliteit voor 2-3 dagen bij de leverancier. Het duurt vaak meer dan 1 dag voor eilandje schade zichtbaar te worden.
- Plaats de eilandjes in een flesje en dompel het volledig onder in het eilandje. Krijg het in het laboratorium door de nachtelijke verzending.
- Verkrijg het eilandje equivalente hoeveelheid (IEQ) van de verscheept eilandjes van de leverancier van het eilandje.
- Herstel eilandjes van de zending op de dag van het eilandje aankomst. Voer deze stap uit met een capuchon om de kans op verontreiniging te minimaliseren.
- Koel de volledige eilandje media (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x pen-STREP, 2 mM glutamine) in een koelkast.
- Breng de eilandjes van de fles over in een conische buis van 50 mL.
- Voeg 10 mL voorgekoelde complete eilandje media toe aan de geleegd flesje om de overgebleven eilandjes te wassen. Breng de media over naar de conische buis.
- Centrifugeer de buis op 200 x g gedurende 2 minuten om eilandjes te herstellen. Aspireren de supernatant verlaten over 1-2 mL media met de pellet.
- Resubreng de eilandjes met voorgekoelde complete eilandje media. Op basis van de IEQ geleverd door de leverancier, toevoegen 12 mL media per 5000 IEQ.
- Giet de eilandjes in de media op een 10 cm niet-behandelde weefselkweek schotel. Incuberen in een weefselkweek incubator bij 37 °C met 5% CO2 in atmosferische lucht.
- Dissociate eilandjes zoals hieronder weergegeven. Voer deze stap uit na een nachtelijke incubatie.
- Pre-warme complete eilandje media en celdissociatie oplossing.
- Bereid 1x PBS met 0,04% BSA bij kamertemperatuur.
- Tel en hand-pick 200-300 eilandjes met behulp van een P200 pipet en breng de eilandjes over naar een conische buis van 15 mL met 5 mL voorverwarmde complete eilandje media.
- Verzamel de eilandjes door centrifugeren bij 200 x g gedurende 2 min. Zuig de supernatant zachtjes op zonder de pellet op de bodem te verstoren.
- Voeg 1,0 mL voorverwarmde celdissociatie oplossing toe en breek de pellet door zachtjes op en neer te pipetteren. Incuberen de eilandjes bij 37 °C gedurende 9-11 min. Elke 3 min pipet op en neer langzaam voor 10 s om de cellen in afzonderlijke cellen te ontkoppelen.
- Zodra de eiland cellen goed zijn losgekoppeld en de oplossing troebel wordt, voeg je 9 mL complete eilandje media toe en filtreer je door een 30 μm celzeef in een nieuwe conische buis van 15 mL.
- Was de buis en de celzeef met 2 mL complete eilandje media om de overgebleven eilandjes te verzamelen en toe te voegen aan dezelfde buis.
- Verzamel cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 minuten.
- Zuig de media voorzichtig aan en breng de celpellet in 5 mL 1x PBS met 0,04% BSA (PBS-BSA).
- Filtreer door een nieuwe 30 μm celzeef in een conische buis van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g om cellen te verzamelen.
- Zuig de supernatant op en relaat de celpellet in 200-300 μL 1x PBS-BSA-oplossing.
- Meet de celconcentratie en pas het volume aan tot een eindconcentratie van 400-500 cellen/μL.
2. enkelvoudige celophanging kwaliteitscontrole
- Bepaal de celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller van fluorescentie34.
- Meng 10 μL cellen met 0,5 μL AO/DAPI. Pipet Meng grondig. Laad 10,5 μL op de glijbaan en voer de celmeetassay uit om het aantal en de levensvatbaarheid te bepalen.
- Verdun en/of Filtreer de celsuspensie indien nodig op basis van het aantal cellen.
3. partitionering van één cel met behulp van een microfluïdische chip. Volg Protocol van microfluïdische chipfabrikant35.
- Breng 3 ' gel Beads en reverse transcriptie (RT) reagentia naar kamertemperatuur (> 30 min). Reconstitueer indien nodig de RT primer in TE buffer.
- Bereid de RT Master mix in een lage BIND buis zoals beschreven in tabel 1.
- Bepaal het aantal cellen dat moet worden ingevoerd voor elk voorbeeld. Bereken het volume van de celsuspensie (X) dat nodig is om het gewenste doelcelnummer te leveren. Het berekende volume Nuclease vrij water dat aan elk monster wordt toe te voegen, is 33,8-X μL.
- Voeg voor elk te gepartitioneerd monster 33,8-X μL Nuclease vrij water toe aan de PCR-strip buis van 0,2 mL. Voeg vervolgens 66,2 μL Master Mix toe aan elke strip buis. Voeg de cellen op dit punt niet toe aan de strook buis. Pipetteer zachtjes om te mengen. Leg de voorbereide strook buizen op ijs.
- Plaats een microfluïdische chip in een chip case. Oriënteer de chip Case waardoor olieputten (rij gelabeld 3) zijn het dichtst bij de persoon die het experiment uitvoert.
- Als er minder dan 8 monsters worden uitgevoerd, gebruikt u 50% glycerol om ongebruikte kanalen in de volgende volgorde te vullen:
- Voeg 90 μL 50% glycerol toe aan de putten in rij 1 voor alle ongebruikte kanalen.
- Voeg 40 μL 50% glycerol toe aan de putjes in rij 2 voor alle ongebruikte kanalen.
- Voeg 270 μL 50% glycerol toe aan de putjes in rij 3 voor alle ongebruikte kanalen.
- Maak de gelkralen in een Vortex. Vortex op volle snelheid voor 30 s. Tik meerdere malen op de strip op de Bench top om kralen te verzamelen. Bevestig dat er geen bubbels aanwezig zijn.
- Voeg X μL cellen toe aan de voorbereide strook buizen. Pipet om 5 keer te mengen. Zonder de pipetpunten te verwijderen, moet u 90 μL celmengsel overbrengen naar rij 1 van de chip.
- Wacht 30 s en laad vervolgens 40 μL gel-parels op rij 2. Pipetteer heel langzaam voor deze stap. Breng 270 μL partitioneringsolie in de putjes van rij 3.
- Haak de spaan pakking op de lipjes van de spaan houder. Plaats de gemonteerde chip houder in het partitioneringsapparaat met één cel en druk op de knop uitvoeren.
- Verwijder onmiddellijk de gemonteerde spaan houder bij uitvoering voltooid.
- Verwijder de spaan pakking van de houder, open de spaan kast in een hoek van 45 ° en verwijder 100 μL van de emulsie van de chip in een blauwe kunststof 96-goed plaat.
4. cDNA-versterking van één cel. Volg Protocol van microfluïdische chipfabrikant35.
- Omgekeerde transcriptie.
Opmerking: Voer deze stap uit onder een schone PCR-only kap om microbiële en andere contaminatie van het niet versterkte cDNA te voorkomen.- Seal de 96-goed blauwe plaat met een folie afdichting op een verwarmde plaat sealer.
- Voer de omgekeerde transcriptie reactie in een thermische cycler als volgt uit: 53 °C gedurende 45 min à 85 °C gedurende 5 minuten à 4 °C.
Opmerking: dit is een veilig stoppunt. Monsters kunnen op 4 °C voor maximaal 72 uur houden.
- Reiniging na RT
- Breng het nucleïnezuur bindende magnetische kralen en nucleïnezuur grootte selectie magnetische kralen op kamertemperatuur en Vortex om opnieuw op te schorten. Op dit punt ontdooit u de monster opschonings buffer gedurende 10 minuten bij 65 °C. Breng alle andere reagentia op kamertemperatuur en Vortex.
- Bereid de buffers voor zoals weergegeven in tabel 2 en tabel 3.
- De emulsie chemisch breken en zuiveren.
- Om dit te doen, verwijder voorzichtig de folie afdichting van de plaat.
- Verdeel 125 μL roze emulsie-breek reagens in elke emulsie. Wacht 1 minuut en breng het volledige volume over naar een schone 0,2 mL strip buis. Zorg ervoor dat er een laag van helder en een laagje roze in de strook buis.
- Verwijder 125 μL van de roze laag van de onderkant van de strook buis zonder de blanke laag te verstoren. Het is normaal dat een klein volume (~ 15 μL) van de roze laag in de buis blijft.
- Voeg 200 μL opruimings mengsel van tabel 2 toe aan de strook slang en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Breng de strip buis over naar een magnetische standaard en laat de oplossing wissen. Verwijder de supernatant en gooi, dan was de kralen met 80% ethanol tweemaal. Laat de kralen 1 minuut drogen.
- Verwijder de strook buis van de magneet en voeg 35,5 μL elutie-oplossing van tabel 3 aan de parels toe. Pipet om de parels in de oplossing te hervatten. Inincuberen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng de strip buis over naar een magnetische standaard en laat de oplossing wissen. Verwijder het gezuiverde cDNA uit de strip buis en verdeel het om 0,2 mL strip buizen te reinigen.
- Versterken de cDNA.
- Bereid amplificatie Master mix voor in tabel 4, hieronder.
- Voeg aan elk monster 65 μL cDNA Amplification Master Mix toe. Plaats de strip buis in een thermische cycler en voer het volgende programma uit: 98 °C 3 min à 15 cycli van [98 °C 15 s à 67 °C 20 s à 72 °C 1 min] à 72 °C 5 min à 4 °C Hold
Opmerking: dit is een veilig stoppunt. Monsters kunnen op 4 °C voor maximaal 72 uur houden. - Reinig de versterkte cDNA met 0,6 x nucleïnezuur grootte selectie magnetische kralen. Was tweemaal met 80% ethanol en elueer met 40,5 μL.
- Voer de kwaliteitscontrole cDNA uit met behulp van geautomatiseerde gel elektroforese en fluorescentie-gebaseerde DNA kwantatie test36,37.
Opmerking: dit is een veilig stoppunt. Monsters kunnen bij 4 °C tot 72 uur of bij-20 °C voor onbepaalde tijd worden bewaard.
5. sequentiëren bibliotheek constructie
- Tagmentatie en clean-up van cDNA38.
- Normaliseer cDNA tot 50 ng in 20 μL van het totale volume. Exacte kwantatie is van cruciaal belang in deze stap.
- Maak de tagmentatie mix in tabel 5 en aliquot 30 μL tot elk 20 ΜL cDNA-monster op ijs. Zet de monsters in de thermische cycler en voer het tagmentatie protocol uit: 55 °C 5 min à 10 °C vasthouden.
- Voer de clean-up van tagmenteerde cDNA met behulp van kolommen38. Voeg aan elk monster een DNA-bindings buffer van 180 μL toe. Breng 230 μL over naar een spin kolom.
- Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1300 x g en gooi de doorstroom weg.
- Was tweemaal met een 300 μL DNA-reinigings buffer. Centrifugeer 2 minuten extra bij 1300 x g om te zorgen dat ethanol wordt verwijderd.
- Elute gezuiverde tagmenteerde cDNA door het toevoegen van 31 μL elutie buffer aan de kolom en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
- Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1300 x g om het gezuiverde product te herstellen.
- Monster index PCR.
- Kies streepjescodes die niet overlappen tijdens een multiplexed sequentiëren uitvoeren.
- Maak een sample index PCR Master Mix zoals weergegeven in tabel 6.
- Voeg 60 μL monster index PCR-Master mengsel toe aan 30 μL van het gezuiverde monster.
- Voeg aan elk monster 10 μL van een 20 μM, 4-oligo-monster index toe (record index gebruikt). Het totale reactievolume is nu 100 μL.
- Plaats in een thermische cycler met het deksel ingesteld op 105 °C. Voer het volgende programma uit: 98 °C 45 s à 12-14 cycli van [98 °C 20 s à 54 °C 30 s à 72 °C 20 s] à 72 °C 1 min à 4 °C hold.
Opmerking: dit is een veilig stoppunt. Monsters kunnen op 4 °C voor maximaal 72 uur houden.
- Purify bibliotheken met dubbele kraal opruimen.
- Voeg aan het monster 100 μL nucleïnezuur grootte selectie magnetische kralen toe en meng grondig met een pipet. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Breng aan op een magneet en laat deze staan totdat de oplossing is verdwenen. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Was tweemaal met 200 μL van 80% ethanol.
- Droog de parels op de magneet gedurende 2 min. Verwijder uit de magneet en voeg 50,5 μL EB-buffer toe aan de kraal pellet. Pipet om de parels in de buffer opnieuw op te schorten.
- Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 min. overbrengen naar een magneet en laat staan voor 2 min. Breng 50 μL van het voorbeeld naar een schone strook buis.
- Voeg 40 μL nucleïnezuur selectie magnetische kralen toe aan het monster en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Breng de oplossing op een magneet aan en laat deze duidelijk. Verwijder en gooi supernatant weg.
- Was tweemaal met 125 μL van 80% ethanol.
- Droog de parels op de magneet gedurende 2 min. Verwijder uit de magneet en voeg 60,5 μL EB-buffer toe aan de kraal pellet. Pipet om de parels in de buffer opnieuw op te schorten.
- Inincuberen bij kamertemperatuur 2 min. Transfer naar een magneet en laat het staan voor 2 min. Breng 50 μL van het voorbeeld naar een schone strook buis. Dit is de definitieve bibliotheek.
- Houd monsters bij 4 °C voor onbepaalde tijd tot 72 uur of bij-20 °C. Houd er rekening mee dat dit een veilig stoppunt is.
- Kwantificeer en voer kwaliteitscontrole uit van de uiteindelijke bibliotheken met behulp van geautomatiseerde gel elektroforese en fluorescentie-gebaseerde DNA-quantitatie test36,37. Verdun de monsters 1:10 voordat de kwaliteitscontrole wordt uitgevoerd.
6. sequentiëren van bibliotheken
- Normaliseer elk monster om te worden gesequentieerd naar 2 ng/μL en pool 3 μL van elk genormaliseerd monster samen.
- Meet de pool concentratie met de op fluorescentie gebaseerde DNA-kwantitatie test37.
- Verdun het zwembad tot 0,25 ng/μL.
- De pool als volgt denatureren: 12 μL verdund samengevoegd monster (0,25 ng/μL) + 1 μL DNA-controle (1 nM), 2 μL EB-buffer + 5 μL NaOH (0,4 N). Laat dit gedurende 5 minuten inbroed en voeg vervolgens 10 μL van 200 mM tris pH 8,0 toe.
- Laad 4,05 μL in 1345,95 μL HT1. Laad 1,3 mL in de patroon van de sequencer en voer volgens de richtlijnen van de fabrikant39 met behulp van een volgorde recept met 26 cycli (Lees 1) + 8 cycli (i7-index) + 0 cycli (i5-index) + 55 cycli (Lees 2).
7. Lees uitlijning (aanvullend bestand 1)
- Voer Cell Ranger (v 2.0.0) uit om RAW base Call (BCL)-bestanden te demultiplex die worden gegenereerd door sequentiëren in FASTQ-bestanden. Lijn FASTQ bestanden uit naar humaan B 37,3 genoom assemblage en UCSC gen model om expressie kwantificering te verkrijgen.
- Uitlijning kwaliteitscontrole.
- Metrische gegevens voor uitlijning genereren en controleren Q30 bases, geldige streepjescode, cel-geassocieerde Lees breuk, toegewezen Lees breuk en gelezen in elke cel gedetecteerd.
- Bekijk de streepjescode rangschikking om ervoor te zorgen dat de met de cel geassocieerde streepjescodes en de achtergrond worden gescheiden.
8. gegevensanalyse (aanvullend bestand 2)
- Celkwaliteitscontrole en voorverwerken.
- Cellen uitsluiten met < 500 gedetecteerde genen, < 3000 totaal aantal unieke moleculaire identificatie (UMI), > 0,2 levensvatbaarheid Score zoals eerder beschreven32. Pas de afgeknipte aan volgens weefsel-en celtypes.
- Verwijder doublets.
- Evalueer de vijf endocriene hormoon genen (glucagon- GCG, insuline- ins, Somatostatine- SST, pancreas polypeptide- PPYen ghreline- ghrl) voor bimodaal uitdrukkings patroon (hoog-en laaguitdrukkings modus) met behulp van R pakket mclust40.
- Verwijder cellen die meer dan één hormoon-gen uitdrukken, d.w.z. met twee of meer hormoon genen in de High-Expression-modus.
- Normaliseer genexpressie door de totale UMI en vermenigvuldig met de schaalfactor van 10.000 op celniveau met R-pakket Seurat41.
- Verwijder genen gedetecteerd in minder dan 3 cellen.
- Detecteer variabele genen met behulp van gemiddelde expressie en dispersie van alle cellen. Pas de afgeknipte aan volgens de weefsel-en celtypen.
- Voer de hoofdcomponent analyse uit met de variabele genen. Cluster cellen met het geselecteerde aantal hoofdcomponenten. Verrijkte cellen met cluster verrijking door één celcluster te vergelijken met de rest van de cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De single-cell RNA sequencing workflow bestaat uit drie stappen: door intact menselijke eilandjes in eencellige suspensie, het vastleggen van afzonderlijke cellen met behulp van een druppel gebaseerde technologie, en het analyseren van RNA-SEQ-gegevens (Figuur 1). Ten eerste werden de verworven menselijke eilandjes 's nachts geïnfiltreerd. De intacte eilandjes werden onder de microscoop onderzocht (Figuur 2a). De integriteit van losgemaakt eiland cellen is gevalideerd met behulp van RNA-fluorescentie in situ-hybridisatie (RNA-vis). Zoals weergegeven in Figuur 2bwerden gezien α-en β-cellen gevisualiseerd met respectievelijk GCG -en ins mRNA-sondes.
Aantal cellen en levensvatbaarheid moeten worden bepaald voordat de eencellige vastleg stap. Cellen met een lage levensvatbaarheid of een hoog puin zijn niet geschikt voor verdere verwerking. Een goede celconcentratie varieert meestal van 400 tot 500 cellen/μL. ongeveer 6000 cellen werden geladen in de microfluïdische chip in de stap van de partitionering met één cel, en 100 μL gelparels in emulsie werden uit de chip verwijderd. Figuur 3a illustreert een succesvol voorbeeld van emulsie na de partitioneringsstap. De vloeistof in elke pipetpunten is uniform licht bewolkt met minimale partitionering olie gescheiden van de gelkralen. Figuur 3b vertoont daarentegen een emulsie van slechte kwaliteit met een duidelijke fasescheiding tussen de gelparels en olie. Dit kan te wijten zijn aan een klomp tijdens de chip run.
Na het partitioneren van één cel werd cDNA Amplification uitgevoerd. Fig. 4a illustreert een representatieve fragment grootteverdeling na cDNA-versterking. De typische piek voor een goede kwaliteit cDNA sample woonde in de buurt van 1000-2000 BP. interessant is dat een piek in de buurt van 600 BP specifiek was voor het eilandje cDNA. De fragment grootteverdeling voor de RNA-SEQ-bibliotheken lag tussen 300 en 500 BP (figuur 4b).
Na het sequentiëren hebben we een reeks metrische gegevens voor uitlijning gebruikt om de single-cell-datakwaliteit (RNA-SEQ) te evalueren (tabel 7). De eerste drie metrische gegevens goed samengevat single-cell sequencing bibliotheek kwaliteit. Gemiddeld werd 92% van de leesbewerkingen afgeleid van intacte cellen en 72% van de leesbewerkingen werden toegewezen aan exonen. Uit alle Exon leest gevangen in druppels, 90% van hen werden geproduceerd door intacte cellen en de rest was waarschijnlijk Ambient Rna's in cel-vrije druppels. Deze uitlijnings statistieken suggereren een goede gegevenskwaliteit. De verhouding tussen Exon-leesbewerkingen en UMI was een empirische meting om de sequentie verzadiging te evalueren en meestal was de 10:1-verhouding een goede indicator. Bovendien was het aantal gedetecteerde genen (UMI > 0) een nuttige functie om verschillende celtypen te karakteriseren. Voor menselijke eilandje cellen, het aantal gedetecteerde genen is ongeveer 1.900 in elke cel.
We hebben in totaal 20.811 eilandje cellen van 12 niet-diabetische donoren gesequentieerd. Expressie van meer dan één hormoon werd gedetecteerd in ongeveer 6% van de cellen. Deze multi-hormonale cellen zijn hoogstwaarschijnlijk wambuizen omdat ons vorige werk toonde aan dat minder dan < 0,1% van enkele eilandje cellen mede-uitgedrukt meer dan één endocriene hormoon33. We verwijderde alle geïdentificeerde multi-hormonale cellen. Het is ook belangrijk om cellen van lage kwaliteit uit te sluiten op basis van totaal UMI, gedetecteerde genen en levensvatbaarheid van cellen33. Na deze kwaliteitscontrole stappen bleef 19.174 voor verdere analyse. De clustering analyse onthulde 12 celtypes: α-, β-, δ-, PP, ε-cellen, acinar, ductale, stilleer bare Stellate, geactiveerde Stellate, endotheel, macrophage en mestcellen (Figuur 5). Zoals verwacht waren endocriene cellen de meerderheid (tabel 8). De top verrijkte genen in α-cellen (d.w.z. GCG, TTR, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B) en β-cellen (d.w.z. iApp, ins, hadh, DLK1, RBP4) zijn consistent met andere studies13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. Interessant is dat zowel α-als β-cellen uit verschillende subpopulaties bestonden. Drie β-celsubpopulaties, bèta SUB1, 2 en 3, waren vergelijkbaar met een klein aantal subpopulatie verrijkte genen (18 in Beta SUB1, 33 in Beta sub 2 en 18 in Beta sub 3). De vierde subpopulatie had 488 verrijkte genen. De kleine α-celsubpopulatie (alpha sub3) bestond uit prolifererende cellen, gekenmerkt door verrijkte expressie van MKI67, CDK1en TOP2A.
Figuur 1: Schematisch diagram van een werkstroom met één cel RNA-sequencing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve beelden van intacte en gezien menselijke eilandjes. A) een afbeelding van eilandjes die na een nachtelijke incubatie zijn genomen. B) gedissocieerde eilandje-cellen die door RNA-vis kleuring voor ins (wit) en GCG (rood) zichtbaar zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: onderzoek van de kwaliteit van eencellige emulsie voorafgaand aan omgekeerde transcriptie. A) een eencellige emulsie van goede kwaliteit. De vloeistof in elke pipetpunt was homogeen bewolkt. B) een eencellige emulsie van slechte kwaliteit. De vloeistof in de pipetpunt was niet homogeen en toonde scheiding tussen olie en de gelparels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: onderzoek van de kwaliteit van cDNA en bibliotheek met één cel. A) een representatieve cDNA-traceringen. Deze cDNA was van goede kwaliteit en rendement, met de belangrijkste piek voor het monster dat in de buurt van 1000-2000 BP. De piek in de trace rond 600 BP was typerend en onderscheidend van het eiland cDNA. (B) een representatieve definitieve sequentie van bibliotheek tracering. Deze bibliotheek was van goede kwaliteit en rendement, met de belangrijkste piek tussen 300-500 BP. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: celtypen en subpopulaties geïdentificeerd in eencellige RNA-sequencing van menselijke alvleesklier eilandjes. Cellen werden geclusterd door onderscheidende celtypen in de ruimte van t-gedistribueerde stochastische neighbor Embedding (tSNE)-dimensies. De analyse onthulde ook drie subpopulaties in α-cellen en vier in β-cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Reagensnaam | Vol. te gebruiken (μL) per reactie |
| RT-reagens mengsel | 50 |
| RT primer | 3,8 |
| Additief A | 2,4 |
| RT enzym mix | 10 |
| Totale | 66,2 |
Tabel 1: omgekeerde transcript mix.
| Reagensnaam | Te gebruiken volume (uL) per reactie |
| Nuclease-vrij water | 9 |
| Buffer monster opruimen 1 | 182 |
| Dynabeads MyOne silaan | 4 |
| Additief A | 5 |
| Totale | 200 |
Tabel 2: cleanup mix.
| Reagensnaam | Te gebruiken volume (uL) per reactie |
| Buffer EB | 98 |
| 10% tween 20 | 1 |
| Additief A | 1 |
| Totale | 100 |
Tabel 3: elutie-oplossing.
| Reagensnaam | Te gebruiken volume (uL) per reactie |
| Nuclease-vrij water | 8 |
| Versterkings Master Mix | 50 |
| cDNA additief | 5 |
| cDNA primer mix | 2 |
| Totale | 65 |
Tabel 4: cDNA amplificatie mix.
| Reagensnaam | Te gebruiken volume (μL) per reactie |
| Tagmentatie-enzym | 5 |
| Tagmentatie buffer | 25 |
| Totale | 30 |
Tabel 5: Tagmentatie mengsel.
| Reagensnaam | Te gebruiken volume (μL) per reactie |
| Nuclease-vrij water | 8 |
| Versterkings Master Mix | 50 |
| SI-PCR primer | 2 |
| Totale | 60 |
Tabel 6: sample index PCR Master Mix.
| Voorbeeld-ID | % Leesbewerkingen met geldige Celstreepjes codes | % Exon leest in vastgelegde cellen tussen totale cellen | % Exon leest onder totale leesbewerkingen | Gemiddelde Exon-leesbewerkingen per cel | Mediaan UMI per cel | Mediane genen per cel |
| Monster-1 | 92% | 93% | 76% | 142.015 | 10.310 | 1.747 |
| Sample-2 | 92% | 91% | 74% | 151.395 | 11.350 | 1.754 |
| Voorbeeld-3 | 94% | 92% | 75% | 120.538 | 19.604 | 2.180 |
| Sample-4 | 95% | 93% | 67% | 160.657 | 11.870 | 2.111 |
| Voorbeeld-5 | 94% | 92% | 62% | 177.809 | 13.821 | 2.288 |
| Voorbeeld-6 | 95% | 89% | 67% | 138.208 | 8.235 | 1.296 |
| Voorbeeld-7 | 94% | 89% | 72% | 147.484 | 13.606 | 2.272 |
| Voorbeeld-8 | 94% | 91% | 69% | 159.793 | 9.505 | 1.865 |
| Voorbeeld-9 | 95% | 92% | 72% | 168.436 | 12.794 | 2.389 |
| Voorbeeld-10 | 83% | 83% | 74% | 88.067 | 13.323 | 1.805 |
| Voorbeeld-11 | 82% | 88% | 77% | 67.752 | 9.295 | 1.278 |
| Voorbeeld-12 | 91% | 85% | 74% | 194.781 | 14.877 | 1.746 |
Tabel 7: Lees uitlijnings statistieken.
| Celtype | Aantal cellen | Ave. cellen per donor (standaarddeviatie) |
| Alpha | 6546 | 546 (258) |
| Beta | 7361 | 613 (252) |
| Delta | 922 | 77 (37) |
| Pp | 545 | 45 (25) |
| Epsilon | 11 | 1, lid 1 |
| Acineuze | 836 | 70 (71) |
| Ductaal | 1313 | 109 (95) |
| Quiescerende ecoagriturismo late | 225 | 19, lid 14 |
| Geactiveerde ecoagriturismo late | 890 | 74 (58) |
| Endotheliale | 408 | 34 (21) |
| Macrophage | 80 | 7, lid 6 |
| Schwann | 37 | 3, lid 3 |
Tabel 8: samenstelling van het celtype. Het totale aantal cellen voor elk celtype en de gemiddelde cellen voor elke donor in elk celtype.
Aanvullend bestand 1: opdrachten die worden gebruikt voor de uitlijning van reeksen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: R-scripts voor het uitvoeren van celkwaliteitscontrole, celclustering en het identificeren van verrijkte genen van het celtype. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single-cell technologieën ontwikkeld in de afgelopen jaren bieden een nieuw platform te karakteriseren celtypen en studie moleculaire heterogeniteit in menselijke alvleesklier eilandjes. We hebben een protocol van op droplet gebaseerde microfluïdische eencellige isolatie en data-analyse aangenomen om menselijke eilandjes te bestuderen. Ons protocol heeft met succes RNA-sequentie gegevens geproduceerd van meer dan 20.000 single human Islet-cellen met relatief kleine variaties in sequentie kwaliteit en batch-effecten.
In het bijzonder zijn twee stappen van cruciaal belang in dit protocol voor kwalitatief hoogstaande resultaten. Voorzichtigheid moet worden betracht bij het dissociëren van menselijke eilandjes. Het is belangrijk om de eilandjes niet te verteren. Partitioneren met één cel is een andere belangrijke stap voor een geslaagde eencellige experiment. We toonden voorbeelden van goede en slechte kwaliteit emulsies in Figuur 3. Een heldere emulsie is meestal een indicatie van onvoldoende aantal cellen dat wordt verzameld in de partitioneringsstap.
De toegang tot geïsoleerde primaire menselijke eilandjes is een snelheids begrenzings stap voor het genereren van grootschalige eencellige transcriptomes op menselijk eiland. Geïsoleerde eilandjes van individuele kadaver donoren worden meestal op verschillende tijdstippen verwerkt, dus potentiële monster-afhankelijke batch-effecten moeten zorgvuldig worden onderzocht tijdens gegevensanalyse. Integratieve analyse kan worden gebruikt voor het identificeren van veelvoorkomende celtypen en subpopulaties in afzonderlijke batches41. Het batch-effect kan ook worden aangepast met batch gecorrigeerde expressie kwantificering42. Een andere uitdaging om single-cell RNA-SEQ-gegevens te analyseren is het identificeren van doublets. In de voor verwerking van gegevens hebben we maatregelen genomen om endocriene doubleten te verwijderen door cellen te identificeren die meerdere hormoon genen uitdrukken (GCG, ins, SST, PPYen ghrl). Identificatie van dubbeltjes gevormd door twee verschillende celtypen is een relatief eenvoudige taak vanwege de extreem hoge expressie van endocriene hormonen. De echte uitdaging is om binnen-cel-type dubbeltjes te identificeren, bijvoorbeeld door twee α-cellen. Omdat een hoger UMI-en hoger aantal gedetecteerde genen wijzen op mogelijke dubbeltjes, is één oplossing het verwijderen van uitschieters met een groot aantal genen en UMI tijdens de cel QC-stap. Daarnaast zijn er tools voor het opsporen van wambuizen beschikbaar43,44,45.
Een belangrijke beperking van eencellige RNA-sequencing is lage gevoeligheid. Met behulp van Spike-in externe RNA Controls Consortium (ERCC) Rna's, we geschat dat slechts 10% van alle uitgesproken genen werden gedetecteerd met behulp van het huidige protocol en dat gedetecteerde degenen waren bevooroordeeld naar hoge overvloed genen46. Pancreas endocriene cellen Express extreem hoog-niveau van hormoon genen (dat wil zeggen, GCG, ins, SST, en PPY). Als gevolg hiervan hebben de Mrna's van deze genen het risico om Ambient RNA te worden. Dergelijke achtergrondgeluiden kunnen niet volledig worden vermeden. Echter, dit stap-voor-stap protocol helpt onderzoekers ongewenste experimentele geluiden te minimaliseren. Het huidige protocol is ontworpen voor vers geïsoleerde weefsels. Andere technologieën, zoals single-Nucleus RNA-sequencing47,48, zijn beschikbaar voor RNA-seq van verse, bevroren of licht vaste weefsels. Bovendien kan een recent ontwikkelde Cell hashing technologie49 worden beschouwd als een geavanceerd microfluïdisch eencellige protocol dat sample multiplexing mogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs zijn werknemers en aandeelhouders van Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Geen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , 10X Genomics. (2017).
- Agilent Technologies. Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent Technologies. (2013).
- Thermo Fischer Scientific. Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , Thermo Fischer Scientific. (2015).
- Illumina. Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , Illumina. (2016).
- Illumina. llumina NextSeq 500 System Guide. , Illumina. (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
