Summary
ここでは、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシング技術を用いて、単体ヒト膵島から単一細胞の高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成するプロトコルを提示する。
Abstract
膵島は、特徴的なホルモン発現パターンを有する内分泌細胞からなる。内分泌細胞は、正常および病理学的状態に応答して機能的な違いを示す。このプロトコルの目的は、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシング技術を使用して、各内分泌細胞タイプの高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成することです。このようなデータは、正常または特定の条件で各内分泌細胞型の遺伝子発現プロファイルを構築するために利用することができる。このプロセスには、慎重な取り扱い、正確な測定、および厳格な品質管理が必要です。このプロトコルでは、ヒト膵島の解離、シーケンシング、およびデータ解析の詳細な手順について説明する。約20,000個のヒト単一のイレット細胞の代表的な結果は、プロトコルの正常な適用を実証する。
Introduction
膵島は、血糖値を調節するために内分泌ホルモンを放出します。機能的および形態的に異なる5つの内分泌細胞タイプは、この重要な役割に関与している:α細胞はグルカゴン、β細胞インスリン、δ細胞ソマトスタチン、PP細胞膵臓ポリペプチド、およびε細胞グレリン1を産生する。遺伝子発現プロファイリングは、正常または特定の状態で内分泌細胞を特徴付ける有用なアプローチである。歴史的に、全イレット遺伝子発現プロファイリングは、マイクロアレイと次世代RNAシーケンシング2、3、4、5、6、7を用いて生成された。,8.全てのイレットトランスクリプトームは、臓器特異的転写物および疾患候補遺伝子を同定するのに有益であるが、各イレット細胞型の分子不均一性を明らかにすることができない。レーザー捕捉微細解剖(LCM)技術は、島9、10、11、12から直接特定の細胞タイプを得るために適用されているが、標的細胞の純度に満ちばない人口。これらの制限を克服するために、蛍光活性化細胞選別(FACS)は、α細胞およびβ細胞13、14、15、16などの特定の内分泌細胞集団を選択するために使用されてきた。,17歳,18.さらに、Dorrellらは抗体ベースのFACS選別アプローチを用いてβ細胞を4つの亜集団19に分類した。FACSソートされたイレット細胞は、単一細胞のRNAシーケンシング用にメッキすることも可能です。しかし、プレートベースの方法は、スケーラビリティ20、21、22の課題に直面しています。
各内分泌細胞型の高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成するために、ヒトのイレット細胞にマイクロ流体技術を応用しました。マイクロ流体プラットフォームは、ハイスループット、高品質、スケーラブルな方法で多数の単一細胞からトランスクリプトームデータを生成します23,24,25, 26,27.大量に捕捉された細胞型の分子特性を明らかにするとともに、スケーラブルなマイクロ流体プラットフォームにより、十分な細胞が提供されたときに希少な細胞タイプを同定することができます。従って、ヒト膵島へのプラットフォームの適用は、グレリン分泌ε細胞のプロファイリングを可能にし、その希少性28に起因するほとんど知られていない機能を持つ稀な内分泌細胞型である。近年、技術29、30、31、32を用いたヒト島の大規模な転写データを報告する研究がいくつか出版されている。 33.このデータは、内分泌細胞の不均一性と疾患への影響を研究するために、公に入手可能で有用なリソースです。
ここでは、α-、β-、δ-、PP、ε細胞、および非内分泌細胞の小さな割合を含む約20,000個のヒトイヌアレット細胞のトランスクリプトームデータを生成するために使用されている液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシングプロトコルについて説明します。32.ワークフローは、孤立した人間の島から始まり、島細胞の解離、単一細胞のキャプチャ、およびデータ分析のステップを示しています。このプロトコルは、新たに分離された島を使用する必要があり、ヒトやげっ歯類などの他の種からの島に適用することができます。このワークフローを使用して、ベースラインおよび他の条件の下で公平で包括的な入り点細胞アトラスを構築することができる。
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Protocol
1. 人間のアイレット解離
- 研究目的のために特定の人口統計を有するドナーからの島が必要でない限り、15〜80歳の性別の死体臓器提供者から単離されたヒトの島を得る。
- 単離後、隔離された島をサプライヤーで2〜3日間組織培養施設に保管する。多くの場合、イレットの損傷が見えるようになるまでに1日以上かかります。
- ボトルに島を入れ、島培地に完全に浸します。夜間発送で研究室に持って行け
- 出荷された島の同等量 (IEQ) を、島の仕入先から入手します。
- 島到着日に出荷から島を回収します。汚染の可能性を最小限に抑えるためにフードを使用してこの手順を実行します。
- 完全なアイズルメディア(CMRL-1066、10%(v/v)FBS、1xペンストレップ、2mMグルタミン)を冷蔵庫で冷却します。
- ボトルから50 mLの円錐形チューブに島を移します。
- 空のボトルに10mLの予冷完了の完全な島の媒体を加えて残りの島を洗い流す。メディアを円錐形のチューブに移します。
- 200 x gでチューブを遠心分離し、2分間、島を回収します。ペレットで約1-2 mL培分を残して上清を吸引する。
- あらかじめ冷却された完全な島の媒体で島を再中断します。サプライヤーが提供する IEQ に基づいて、5000 IEQ ごとに 12 mL メディアを追加します。
- 10cmの非処理組織培養皿に培中に島を注ぎます。大気中の5%CO2で37°Cの組織培養インキュベーターで一晩インキュベートする。
- 以下に示すように、島を解離する。一晩インキュベーションの後にこの手順を実行します。
- 事前ウォーム完全なイレット培養および細胞解解。
- 室温で0.04%BSAを含む1x PBSを調調します。
- P200ピペットを使用して200-300の島を数え、5 mLの予め温められた完全な島の媒体を含む15 mLの円錐形の管に渡す。
- 200 x gで200xgで遠心分離して島を2分間集め、底部のペレットを邪魔することなく上清を静かに吸引する。
- 1.0 mLの予め温められた細胞の解離液を加え、上下にゆっくりとピペッティングしてペレットを破壊する。島を37°Cで9~11分間インキュベートします。3分ごとに上下にゆっくりと10sの細胞を単一の細胞に解離する。
- イレット細胞がよく解離され、溶液が濁ると、9 mLの完全な入り物培養物を追加し、30 μmセルストレーナーを通して新しい15 mL円錐管にフィルターを加えます。
- チューブとセルストレーナーを2mLの完全な島の培養物で洗浄し、残りの島を回収し、同じチューブに追加します。
- 400 x gで5分間遠心分離によって細胞を集める。
- メディアを穏やかに吸引し、0.04%BSA(PBS-BSA)を含む5 mL 1x PBSで細胞ペレットを再中断します。
- 新しい30 μmセルストレーナーを15 mLの円錐管にフィルターでフィルタリングし、遠心分離機を400 x gで5分間取り込み、細胞を集めます。
- 上清を吸引し、200-300 μL 1x PBS-BSA溶液で細胞ペレットを再中断します。
- 細胞濃度を測定し、400-500細胞/μLの最終濃度に体積を調整します。
2. シングルセルサスペンション品質管理
- 蛍光系自動細胞カウンター34を用いて細胞濃度を決定する。
- 10 μL セルを 0.5 μL AO/DAPI と混合します。ピペットミックスを徹底的に混ぜます。スライドに10.5 μLをロードし、セルカウントアッセイを実行して、カウントと生存率を判断します。
- セル数に基づいて、必要に応じてセル懸濁液を希釈またはフィルタリングします。
3. マイクロ流体チップを使用した単一セルパーティショニング。マイクロ流体チップメーカー35からのプロトコルに従ってください。
- 3'ゲルビーズと逆転写(RT)試薬を室温(>30分)に持参してください。必要に応じて、TE バッファ内の RT プライマーを再構成します。
- 表 1で説明するように、低バインド チューブで RT マスター ミックスを準備します。
- 各サンプルに入力するセルの数を決定します。目的のターゲットセル数を提供するために必要なセル懸濁量(X)を計算します。各サンプルに添加するヌクレアーゼフリー水の計算量は33.8-X μLになります。
- 各サンプルを仕切る場合は、33.8-X μLヌクレス料フリー水を0.2 mL PCRストリップチューブに追加します。次に、各ストリップチューブに66.2 μLマスターミックスを追加します。この時点で、セルをストリップ チューブに追加しないでください。ピペットをやさしく混ぜます。準備されたストリップチューブを氷の上に置きます。
- マイクロ流体チップをチップケースに入れておきます。オイルウェル(3行)が実験を行う人に最も近いチップケースの向きを整えます。
- 8サンプル未満を実行する場合は、50%のグリセロールを使用して、次の順序で未使用のチャネルを充填します。
- 50%グリセロールの90 μLを、未使用のチャネルの行1のウェルに追加します。
- 50%グリセロールの40 μLを、未使用のチャネルの行2のウェルに追加します。
- 50%グリセロールの270 μLを、未使用のチャネルの行3のウェルに追加します。
- ゲルビーズを渦にスナップします。30 s. のフルスピードで渦は、ビーズを収集するために、ベンチトップのストリップを数回タップします。気泡が存在することを確認します。
- 準備されたストリップチューブにセルのX μLを追加します。ピペットを5回混ぜます。ピペットチップを捨てずに、90μLのセル混合物をチップの行1に移します。
- 30 s を待ってから、40 μL のゲルビーズを 2 行目にロードします。このステップのために非常にゆっくりとピペット。3列目の井戸に270 μLの仕切りオイルを分配します。
- チップガスケットをチップホルダーのタブに引っ掛けます。組み立てられたチップホルダーを単一セルパーティショニングデバイスに入れ、実行ボタンを押します。
- 実行完了時に組み立てられたチップホルダーを直ちに取り外します。
- ホルダーからチップガスケットを取り出し、チップケースを45°の角度で開き、チップから100μLのエマルジョンを青いプラスチック96ウェルプレートに取り外します。
4. 単一細胞cDNA増幅。マイクロ流体チップメーカー35からのプロトコルに従ってください。
- 逆転写
注:クリーンなPCR専用フードの下でこの手順を実行して、増幅されていないcDNAの微生物やその他の汚染を防ぎます。- 96ウェルブループレートを加熱プレートシーラーにホイルシールでシールします。
- 次のように熱サイクラーで逆転転写反応を実行します: 53 °C 45 分 à 85 °C 5 分 à 4 °C ホールド.
注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72の間4 °Cで保持することができる。
- ポストRT精製
- 核酸結合磁気ビーズと核酸サイズ選択磁気ビーズを室温と渦に持ち込み、再停止します。この時点で、65°Cで10分間サンプルクリーンアップバッファを解凍します。他のすべての試薬を室温および渦に持ち込む。
- 表 2および表 3に示すように、バッファーを準備します。
- 化学的にエマルジョンを壊し、浄化します。
- これを行うには、プレートからホイルシールを静かに取り外します。
- 各エマルションに125 μLのピンクエマルション破断試薬を分配します。1 分間待ってから、ボリューム全体をクリーンな 0.2 mL ストリップ チューブに転送します。ストリップチューブに透明な層とピンクの層があることを確認します。
- 明確な層を妨げることなく、ストリップチューブの底からピンク層の125 μLを取り外します。ピンク層の少量(約15μL)がチューブ内に残るのは正常です。
- 表2から200μLのクリーンアップミックスをストリップチューブに加え、室温で10分間インキュベートします。
- ストリップチューブを磁気スタンドに移し、溶液をクリアします。上清を取り出して廃棄し、80%エタノールでビーズを2回洗浄します。ビーズを1分間乾燥させます。
- 磁石からストリップチューブを取り出し、表3からビーズに35.5μLの溶出液を加えます。ピペットは、溶液中のビーズを再中断します。室温で2分間インキュベートします。
- ストリップチューブを磁気スタンドに移し、溶液をクリアします。精製したcDNAをストリップチューブから取り出し、0.2 mLのストリップチューブをきれいにするために分配します。
- cDNAを増幅します。
- 以下の表4で増幅マスターミックスを準備する。
- 各サンプルに65μLのcDNA増幅マスターミックスを追加します。ストリップチューブをサーマルサイクラーに入れ、次のプログラムを実行する:98 °C 3分の15サイクル[98 °C 15 s à 67 °C 20 s à 72 °C 1分] à 72 °C 5分 4 °C ホールド
注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72時間のための4°Cで保持することができる。 - 0.6倍の核酸サイズ選択磁気ビーズで増幅されたcDNAを浄化します。80%エタノールで2回洗浄し、40.5 μLで溶出します。
- 自動ゲル電気泳動および蛍光ベースのDNA定量アッセイ36、37を使用して品質管理cDNAを実行します。
注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72のか-20°Cで4°Cで保つことができる。
5. シーケンスライブラリ構築
- cDNA38のタグ付けとクリーンアップ .
- 総体積の20μLでcDNAを50ngに正規化します。この手順では、正確な定量が重要です。
- 表 5とアリコート 30 μL のタグ付けを、氷上の各 20 μL cDNA サンプルに合わせることができます。サンプルをサーマルサイクラーに入れ、タグ付けプロトコルを実行します:55 °C 5分à 10 °Cホールド。
- 列38を使用してタグ付き cDNA のクリーンアップを実行します。各サンプルに180 μLのDNA結合バッファーを追加します。230 μL をスピンカラムに転送します。
- 1300 x gで2分間遠心分離機を使用し、フロースルーを破棄します。
- 300 μL DNA洗浄バッファーで2回洗浄します。エタノール除去を確実にするために、1300 x gでさらに2分を遠心分離します。
- カラムに31μLの溶出バッファーを加えて精製したタグを精製し、室温で2分間インキュベートした。
- 精製された製品を回収するために1300 x gで2分間遠心分離機。
- サンプル インデックス PCR.
- 多重シーケンス実行中に重複しないバーコードを選択します。
- 表 6に示すように、サンプル インデックス PCR マスター ミックスを作成します。
- 精製サンプルの30 μLにサンプルインデックスPCRマスターミックスの60 μLを追加します。
- 各サンプルに20 μMの10 μL、4オリゴサンプルインデックスを追加します(使用されるレコードインデックス)。総反応量は100μLになりました。
- 蓋を105°Cに設定したサーマルサイクラーに入れます。次のプログラムを実行する:98 °C 45 s à 12-14 サイクル [98 °C 20 s à 54 °C 30 s à 72 °C 20 s] à 72 °C 1 分 à 4 °C ホールド。
注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72の間4 °Cで保持することができる。
- 二重ビーズクリーンアップでライブラリを浄化します。
- サンプルに100μLの核酸サイズ選択磁気ビーズを加え、ピペットと十分に混ぜます。室温で5分間インキュベートします。
- 磁石に移し、溶液がクリアされるまで放置します。上清を取り除いて捨てます。
- 80%エタノールの200 μLで2回洗います。
- 磁石のビーズを2分間乾燥させ、磁石から取り出し、ビーズペレットに50.5 μLのEBバッファーを加えます。バッファ内のビーズを再中断するピペット。
- 室温で2分間インキュベート磁石に移し、2分間放置し、50μLのelutedサンプルをきれいなストリップチューブに移します。
- 40μL核酸サイズ選択磁気ビーズを試料に加え、室温で5分間インキュベートし、磁石に移し、溶液を透明にします。上清を取り除いて廃棄します。
- 80%エタノールの125 μLで2回洗います。
- 磁石のビーズを2分間乾燥させ、磁石から取り出し、ビーズペレットに60.5 μLのEBバッファーを加えます。バッファ内のビーズを再中断するピペット。
- 室温で2分間インキュベート磁石に移し、2分間放置し、50μLのelutedサンプルをきれいなストリップチューブに移します。これが最後のライブラリです。
- 最大72時間、または-20°Cで4°Cでサンプルを無期限に保持します。これは安全な停止ポイントに注意してください。
- 自動化ゲル電気泳動および蛍光ベースのDNA定量アッセイ36、37を用いて最終ライブラリの品質管理を定量し、実行する。品質管理を実行する前に、サンプルを 1:10 に希釈します。
6. ライブラリのシーケンス
- 各サンプルを2 ng/μLに配列し、各正規化されたサンプルのプール3 μLを一緒に正規化します。
- 蛍光ベースのDNA定量アッセイ37でプール濃度を測定する。
- プールを 0.25 ng/μL に希釈します。
- プールを次のように変性:希釈プールサンプルの12 μL(0.25 ng/μL)+1 μL DNA制御(1 nM)、2 μL EBバッファー+ 5 μL NaOH(0.4N)。これを5分間インキュベートし、200 mMトリスpH 8.0の10 μLを加えます。
- 4.05 μL を 1345.95 μL HT1 にロードします。シーケンサーのカートリッジに1.3 mLをロードし、26サイクル(読み取り1)+8サイクル(i7インデックス)+0サイクル(i5インデックス)+55サイクル(読み取り2)のシーケンスレシピを使用して、製造元のガイドライン39に従って実行します。
7. 位置合わせを読み取る (補足ファイル 1)
- セル レンジャー (v2.0.0) を実行して、FASTQ ファイルへのシーケンスによって生成された未加工基本呼び出し (BCL) ファイルを多重化解除します。FASTQファイルをヒトB37.3ゲノムアセンブリおよびUCSC遺伝子モデルに合わせ、発現定量を得る。
- アライメント品質管理。
- 位置合わせメトリックを生成し、Q30 ベース、有効なバーコード分数、セル関連の読み取り分率、マップされた読み取り分率、および各セルで検出された読み取り値を確認します。
- バーコードランクプロットを調べて、セルに関連付けられたバーコードと背景の分離を確認します。
8. データ分析(補足ファイル2)
- 細胞の品質管理と前処理。
- < 500 検出された遺伝子を持つ細胞を除外し、< 3000 一意の分子識別子(UMI)の合計数、> 0.2 生存率スコアを前述の32.組織および細胞のタイプに従ってカットオフを調節する。
- ダレットを取り外します。
- Rを用いて5つの内分泌ホルモン遺伝子(グルカゴン - GCG、インスリン-INS、ソマトスタチン-SST、膵臓ポリペプチド-PPY、およびグレリン-GHRL)を評価し、Rを用いて二モーダル発現パターン(高発現および低発現モード)を評価する。 パッケージmclust40.
- 複数のホルモン遺伝子を発現する細胞、すなわち、高発現モードで2つ以上のホルモン遺伝子を発現する細胞を除去する。
- 全UMIによる遺伝子発現を正規化し、RパッケージSeurat41を用いて細胞レベルで10,000のスケール因子を乗算する。
- 3未満の細胞で検出された遺伝子を除去します。
- すべての細胞の平均発現と分散を使用して可変遺伝子を検出します。組織および細胞のタイプに従ってカットオフを調節する。
- 可変遺伝子を使用して主成分分析を実行します。選択した数の主成分を含むクラスターセル。1つの細胞クラスターと他の細胞を比較することにより、細胞クラスターを濃縮した遺伝子を導出する。
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Representative Results
単細胞RNAシーケンシングワークフローは、無傷のヒト島を単一細胞懸濁液に解離すること、液滴ベースの技術を用いて単一細胞を捕捉すること、およびRNA-seqデータを解析するという3つのステップで構成されています(図1)。まず、後天したヒト島を一晩インキュベートした。無傷の島を顕微鏡下で調べた(図2A)。解離されたイブリゲーション細胞の完全性は、その中のハイブリダイゼーションにおけるRNA蛍光(RNA-FISH)を用いて検証された。図2Bに示すように、解離されたα細胞およびβ細胞は、それぞれGCGおよびINS mRNAプローブを用いて可視化した。
単一細胞捕捉ステップの前に、細胞数と生存率を決定する必要があります。生存率が低いセルやデブリが高いセルは、さらなる処理には適していません。良好な細胞濃度は、通常、400~500セル/μLの範囲であり、約6000個の細胞を単一細胞分割工程でマイクロ流体チップにロードし、エマルジョン中のゲルビーズの100μLをチップから除去した。図3Aは、分割ステップに続くエマルションの成功例を例示する。各ピペットの先端の液体はゲルビーズから分離された最小限の仕切りオイルと均一な淡い曇りである。これに対し、図3Bは、ゲルビーズと油との間の明確な相分離を伴う低品質のエマルションを示す。これは、チップの実行中に目詰まりが原因である可能性があります。
単一細胞のパーティショニングに続いて、cDNA増幅を行った。図4Aは、cDNA増幅後の代表的なフラグメントサイズ分布を示す。良質のcDNAサンプルの典型的なピークは1000-2000 bpの近くに存在し、興味深いことに、600 bp近くのスパイクは、イレットcDNAに特異的であった。RNA-seqライブラリのフラグメントサイズ分布は300~500bp(図4B)でした。
シーケンシング後、単一セル RNA-seq データ品質を評価するために一連の読み取り位置合わせメトリックを採用しました (表7)。最初の 3 つのメトリックは、単一セルシーケンス ライブラリの品質をまとめた点です。平均して、読み取りの92%は無傷の細胞から派生し、読み取りの72%はエクソンにマッピングされました。液滴で捕捉されたすべてのエキソン読み取りのうち、90%は無傷の細胞によって産生され、残りは無細胞液滴中の周囲RNAである可能性が高かった。これらの位置合わせメトリックは、良好なデータ品質を示唆しています。エキソン読み取りとUMIの比率は、シーケンシング飽和度を評価するための経験的測定であり、通常、10:1比は良好な指標であった。さらに、検出された遺伝子の数(UMI> 0)は、異なる細胞型を特徴付ける有用な特徴であった。ヒトのイレット細胞の検出遺伝子数は、各細胞で約1,900個です。
12人の非糖尿病ドナーから合計20,811個の膵物細胞を配列した。細胞の約6%で複数のホルモンの発現が検出された。これらの多ホルモン細胞は、我々の前の研究は、単一のイストレ細胞の0.1%未満が複数の内分泌ホルモン33を共発現していることを示したので、最も可能性の高い二重である。同定された多ホルモン細胞をすべて取り除いた。また、全UMI、検出遺伝子、および細胞生存率33に基づいて低品質の細胞を除外することも重要である。これらの品質管理手順の後、19,174はさらなる分析のために残った。クラスタリング解析では、α、β-、δ-、PP、ε細胞、アシナー、ダクサル、静止ステラー、活性化ステラ、内皮、マクロファージ、およびマスト細胞の12種類の細胞が明らかになった(図5)。予想通り、内分泌細胞が過半数であった(表8)。α細胞のトップ濃縮遺伝子(すなわち、GCG、TTR、CRYBA2、TM4SF4、TMEM176B)およびβ細胞(すなわち、IAPP、INS、HADH、DLK1、RBP4)は他の遺伝子と一致している。 研究13,15,16,17,18,20,21,22,29 、30、31、33.興味深いことに、α細胞とβ細胞の両方がいくつかの亜集団から構成されていました。3つのβ細胞亜集団であるβsub1、2、および3は、少数の亜集団富化遺伝子と類似していた(ベータサブ1では18、ベータサブ2では33、ベータサブ3では18)。第4の亜集団は488個の濃縮遺伝子を持っていた。小さなα細胞亜集団(αsub3)は増殖細胞を含み、MKI67、CDK1、およびTOP2Aの濃縮発現によって特徴付けられた。
図1:単一細胞RNAシーケンシングワークフローの概略図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:無傷および解離されたヒト島の代表的な画像。(A) 一晩インキュベーション後に撮影された島の画像。(B)INS(白色)及びGCG(赤色)に対するRNA-FISH染色により可視化した解離性化したイレット細胞。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:逆転転写前の単細胞エマルジョンの品質の検討(A) 良質の単細胞エマルジョン。各ピペット先端の液体は均質に曇っていた。(B) 品質の悪い単細胞エマルジョン。ピペット先端の液体は均質ではなく、油とゲルビーズとの間の分離を示した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:単細胞cDNAおよびライブラリーの品質の検討(A) 代表的なcDNAトレース。このcDNAは良好な品質と収率で、サンプルの主なピークは1000-2000 bp付近で発生しました。約600 bpのトレースのスパイクは典型的で、イレットcDNAの特徴でした。(B) 代表的な最終シーケンス ライブラリ トレース。このライブラリは、300-500 bpの間に発生する主なピークで、良好な品質と収率でした。
図5:ヒト膵島の単細胞RNAシーケンシングで同定された細胞型および亜集団。細胞は、t分布確率的近傍埋め込み(tSNE)寸法の空間に特徴的な細胞タイプによってクラスタ化された。分析はまた、α細胞で3つの亜集団とβ細胞の4つのサブ集団を明らかにした。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬名 | 反応あたりの使用(μL) |
| RT 試薬ミックス | 50歳 |
| RT プライマー | 3.8件 |
| 添加剤A | 2.4年 |
| RT 酵素ミックス | 10歳 |
| 合計 | 66.2歳 |
表 1: 逆転トランスクリプトミックス。
| 試薬名 | 反応あたりの使用量(uL) |
| ヌクレス料フリー水 | 9 |
| バッファ サンプル クリーンアップ 1 | 182年 |
| ダイナビーズ マイワン シラン | 4 |
| 添加剤A | 5 |
| 合計 | 200年 |
表 2: クリーンアップ ミックス。
| 試薬名 | 反応あたりの使用量(uL) |
| バッファ EB | 98歳 |
| 10% トウェン 20 | 1 |
| 添加剤A | 1 |
| 合計 | 100人 |
表 3: 溶出ソリューション。
| 試薬名 | 反応あたりの使用量(uL) |
| ヌクレス料フリー水 | 8 |
| 増幅マスターミックス | 50歳 |
| cDNA添加剤 | 5 |
| cDNAプライマーミックス | 2 |
| 合計 | 65歳 |
表4:cDNA増幅ミックス。
| 試薬名 | 反応あたりの使用量(μL) |
| タグ化酵素 | 5 |
| タグ付けバッファ | 25名 |
| 合計 | 30歳 |
表 5: タグ付けミックス。
| 試薬名 | 反応あたりの使用量(μL) |
| ヌクレス料フリー水 | 8 |
| 増幅マスターミックス | 50歳 |
| SI-PCR プライマー | 2 |
| 合計 | 60歳 |
表 6: サンプル インデックス PCR マスター ミックス。
| サンプル ID | 有効なセル バーコードを使用した読み取り数 | % エクソンは、総セル間でキャプチャされたセルで読み取ります | 合計読み取り中の %エクソン読み取り | セルあたりの平均エキソン読み取り | セルあたりの中央値 UMI | 細胞あたりの中央値遺伝子 |
| サンプル-1 | 92パーセント | 93パーセント | 76パーセント | 142,015の | 10,310の | 1,747の |
| サンプル-2 | 92パーセント | 91パーセント | 74パーセント | 151,395の | 11,350の | 1,754の |
| サンプル-3 | 94パーセント | 92パーセント | 75パーセント | 120,538の | 19,604の | 2,180の |
| サンプル-4 | 95パーセント | 93パーセント | 67パーセント | 160,657の | 11,870の | 2,111の |
| サンプル-5 | 94パーセント | 92パーセント | 62パーセント | 177,809の | 13,821の | 2,288の |
| サンプル-6 | 95パーセント | 89パーセント | 67パーセント | 138,208の | 8,235の | 1,296の |
| サンプル-7 | 94パーセント | 89パーセント | 72パーセント | 147,484の | 13,606の | 2,272の |
| サンプル-8 | 94パーセント | 91パーセント | 69パーセント | 159,793の | 9,505の | 1,865の |
| サンプル-9 | 95パーセント | 92パーセント | 72パーセント | 168,436の | 12,794の | 2,389の |
| サンプル-10 | 83パーセント | 83パーセント | 74パーセント | 88,067の | 13,323の | 1,805の |
| サンプル-11 | 82パーセント | 88パーセント | 77パーセント | 67,752の | 9,295の | 1,278の |
| サンプル-12 | 91パーセント | 85パーセント | 74パーセント | 194,781の | 14,877の | 1,746の |
表 7: 位置合わせメトリックを読み取ります。
| セルの種類 | セル数 | ドナー当たりの細胞(標準偏差) |
| アルファ | 6546の | 546(258) |
| Beta | 7361の | 613(252) |
| デルタ | 922の | 77(37) |
| 頁 | 545の | 45(25) |
| イプシロン | 11歳 | 1 (1) |
| アシナール | 836の | 70(71) |
| 管 | 1313年 | 109(95) |
| 静止ステラー | 225名 | 19(14) |
| 活性化ステラー | 890の | 74(58) |
| 内皮 | 408の | 34(21) |
| マクロファージ | 80歳 | 7(6) |
| シュワン | 37歳 | 3(3) |
表 8: セル型組成。各細胞タイプの細胞の合計数と各ドナーの平均細胞数。
補足ファイル 1: シーケンスの配置に使用されるコマンド。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:細胞品質管理、細胞クラスタリング、および細胞型濃縮遺伝子を同定するためのRスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
近年開発された単細胞技術は、細胞型を特徴付け、ヒト膵島の分子不均一性を研究する新しいプラットフォームを提供します。我々は、ヒトの島を研究するために、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞単一細胞単一細胞単一細胞単一細胞の単一細胞分離とデータ解析のプロトコルを採用した。我々のプロトコルは、配列の品質とバッチ効果の比較的小さな変動を持つ20,000以上の単一ヒトイストレット細胞からのRNAシーケンシングデータを正常に生成しました。
特に、このプロトコルでは、高品質の結果を生み出すには、2 つの手順が重要です。人間の島を解離する際には注意が必要です。島を消化し過ぎないようにすることが重要です。単一セルのパーティション分割は、単一セル実験を成功させるためのもう 1 つの重要なステップです。図3で良質および低品質のエマルションの例を示した。明確なエマルションは、通常、パーティション分割ステップで収集されるセルの数が不十分であることを示します。
単離された一次ヒト個体へのアクセスは、大規模なヒト島単細胞転写物を生成するための速度制限ステップである。個々の死体ドナーからの単離された島は、通常、異なる時間に処理されるため、潜在的なサンプル依存バッチ効果は、データ分析中に慎重に検討する必要があります。統合分析を使用すると、個々のバッチ41間で共通のセルタイプと亜母集団を識別できます。バッチ効果は、バッチ補正式定量42によって調整することもできる。単一細胞RNA-seqデータを分析するもう一つの課題は、二重を同定することです。データ前処理では、複数のホルモン遺伝子(GCG、INS、SST、PPY、GHRL)を発現する細胞を同定することにより内分泌二重化を除去する対策を講じた。 2つの異なる細胞タイプによって形成された二重の同定は、内分泌ホルモンの非常に高い発現のために比較的容易な作業である。本当の課題は、細胞型の二重、例えば、2つのα細胞によって二重を同定することです。より高いUMIと検出された遺伝子の数が多い方が潜在的な二重化を示唆しているため、1つの解決策は、細胞QCステップ中に多数の遺伝子およびUMIを持つ外れ値を除去することです。さらに、ダレットを検出するためのツールは、43、44、45を利用できます。
単一細胞RNAシーケンシングの主な制限は、低感度です。スパイクイン外部RNAコントロールコンソーシアム(ERCC)RNAを用いて、現行プロトコルを用いて発現した全ての遺伝子の10%のみが検出され、検出されたものは高量遺伝子46に偏っていると推定した。膵臓内分泌細胞は、ホルモン遺伝子の非常に高いレベルを発現する(すなわち、GCG、INS、SST、およびPPY)。 その結果、これらの遺伝子のmRNAは周囲RNAになる危険性がある。このようなバックグラウンド ノイズは完全に回避できません。しかし、このステップバイステッププロトコルは、研究者が望ましくない実験ノイズを最小限に抑えるのに役立ちます。現在のプロトコルは新しく隔離されたティッシュのために設計されている。単核RNAシーケンシング47、48などの他の技術は、新鮮な、凍結した、または軽く固定された組織のRNA-seqのために利用できる。さらに、最近開発された細胞ハッシュ技術49は、サンプル多重化を可能にする高度なマイクロ流体単一細胞プロトコルと考えることができる。
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Disclosures
著者はいずれもリージェロン・ファーマシューティカルズ社の従業員および株主です。
Acknowledgments
なし
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
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