Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera högkvalitativa, storskaliga transkriptome data av enskilda celler från isolerade mänskliga pankreasöar med hjälp av en droplet-baserade mikrofluidic Single-cell RNA sekvensering teknik.
Abstract
Pankreasöar består av endokrina celler med distinkta hormon uttrycksmönster. De endokrina cellerna uppvisar funktionella skillnader som svar på normala och patologiska tillstånd. Målet med detta protokoll är att generera högkvalitativa, storskaliga transkriptome data av varje endokrin celltyp med hjälp av en droplet-baserade mikroflödessystem Single-cell RNA sekvensering teknik. Sådana data kan utnyttjas för att bygga gen uttrycks profil av varje endokrin celltyp i normala eller specifika förhållanden. Processen kräver noggrann hantering, noggrann mätning och noggrann kvalitetskontroll. I detta protokoll beskriver vi detaljerade steg för mänskliga pankreasöar dissociation, sekvensering och dataanalys. De representativa resultaten av cirka 20 000 humana singelcellöar visar att protokollet har genomförts framgångsrikt.
Introduction
Pankreasöar släppa endokrina hormoner för att reglera blodsockernivåerna. Fem endokrina celltyper, som skiljer sig funktionellt och morfologiskt, är involverade i denna viktiga roll: α-celler producerar glukagon, β-cells insulin, δ-cells somatostatin, PP-celler pankreaspolypeptid och ε-celler ghrelin1. Profilering av genuttryck är en användbar metod för att karakterisera de endokrina cellerna under normala eller specifika förhållanden. Historiskt sett har hela Holmen gen uttrycks profilering genererats med hjälp av microarray och Next-generation RNA-sekvensering2,3,4,5,6,7 , 8. även om hela Holmen transkriptome är informativ för att identifiera organspecifika utskrifter och sjukdomar kandidat gener, det misslyckas med att avslöja molekyl heterogenitet av varje ö-celltyp. Laser Capture microdissection (LCM) teknik har tillämpats för att direkt erhålla specifika celltyper från öar9,10,11,12 men inte är av renhet av den riktade cellen Befolkningen. För att övervinna dessa begränsningar har fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) använts för att välja specifika endokrina cellpopulationer, såsom α-och β-celler13,14,15,16 , 17 , 18. Dessutom använde dorrell et al. en antikroppsbaserad FACS sortering metod för att klassificera β-celler i fyra subpopulationer19. FACS-sorterade ö-celler kan också pläteras för RNA-sekvensering av enstaka celler; dock ställs plattbaserade metoder inför utmaningar i skalbarheten20,21,22.
För att generera hög kvalitet, storskaliga transkriptome data av varje endokrin celltyp, tillämpade vi mikroflödessystem teknik för att mänskliga ö-celler. Den mikroflödessystem plattformen genererar transkriptome data från ett stort antal enskilda celler i ett högt dataflöde, hög kvalitet, och skalbara sätt23,24,25,26,27. Förutom att avslöja molekylära egenskaper hos en celltyp som fångas i en stor mängd, möjliggör mycket skalbar mikroflödessystem-plattform identifiering av sällsynta celltyper när tillräckligt många celler tillhandahålls. Därför, tillämpning av plattformen till mänskliga pankreasöar tillät profilering av ghrelin-utsöndra ε-celler, en sällsynt endokrin celltyp med föga känd funktion på grund av dess brist28. Under de senaste åren har flera studier publicerats av oss och andra som rapporterar storskaliga transkriptomdata från humana öar med hjälp av tekniken29,30,31,32, 33. Uppgifterna är allmänt tillgängliga och användbara resurser för Holmen samfundet att studera endokrina cellers heterogenitet och dess konsekvenser för sjukdomar.
Här beskriver vi en droplet-baserade mikroflödessystem Single-cell RNA sekvenserings protokoll, som har använts för att producera transkriptome data av cirka 20 000 mänskliga öar celler inklusive α-, β-, δ-, PP, ε-celler, och en mindre andel av icke-endokrina celler 32. arbetsflödet börjar med isolerade mänskliga öar och skildrar steg av holme cell dissociation, Single-cell Capture, och dataanalys. Protokollet kräver användning av nyligen isolerade öar och kan tillämpas på öar från människor och andra arter, såsom gnagare. Använda detta arbetsflöde, opartisk och omfattande Holmen cell Atlas under baslinjen och andra villkor kan byggas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dissociation av mänskliga öar
- Få humana öar isolerade från kadaver organdonatorer av antingen kön, åldrar mellan 15-80 år, utan redan existerande sjukdomar, om inte öar från givare med specifik demografi krävs för studiens syfte.
- Efter isoleringen har de isolerade holarna hållits i vävnads odlingsanläggningen i 2-3 dagar hos leverantören. Det tar ofta mer än 1 dag för ö-skador att bli synlig.
- Placera kobbar i en flaska och doppa den helt i Holmen medium. Få det till laboratoriet med övernattning leverans.
- Få den ö-ekvivalent kvantitet (IEQ) av de levererade holarna från Holmen leverantören.
- Återhämta öar från transporten på dagen för Islet ankomst. Utför detta steg med hjälp av en huva för att minimera risken för kontaminering.
- Kyla hela Holmen media (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x penna-STREP, 2 mM glutamin) i ett kylskåp.
- Överför kobbar från flaskan till ett 50 mL koniskt rör.
- Tillsätt 10 mL förkyld komplett ö-media till den tömda flaskan för att tvätta de kvarvarande holarna. Överför mediet till det koniska röret.
- Centrifugera röret vid 200 x g i 2 min för att återvinna öar. Aspirera supernatanten lämnar ca 1-2 mL media med pelleten.
- Omsuspendera holarna med förkyld komplett holme. Baserat på den IEQ tillhandahållen av leverantören, tillsätt 12 mL Media per 5000 IEQ.
- Häll kobbar i medierna på en 10 cm icke-behandlad vävnad kultur skålen. Inkubera över natten i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 i Atmosfärisk luft.
- Separera holmar som visas nedan. Utför detta steg efter övernattning inkubering.
- Pre-Warm komplett ö media och cell dissociation lösning.
- Bered 1x PBS som innehåller 0,04% BSA vid rumstemperatur.
- Räkna och handplocka 200-300 holkar med en P200 pipett och överför kobbar till ett 15 mL koniskt rör innehållande 5 mL förvärmda hela Holmen media.
- Samla kobbar genom centrifugering på 200 x g för 2 min. försiktigt Aspirera supernatanten utan att störa pelleten på botten.
- Tillsätt 1,0 mL förvärmda cell dissociation lösning och störa pelleten genom pipettering försiktigt upp och ner. Inkubera kobbar vid 37 ° c i 9-11 min. Varje 3 min pipett upp och ner långsamt för 10 s att separera cellerna i enskilda celler.
- När ö-cellerna är väl separerade och lösningen blir grumlig, tillsätt 9 mL komplett ö-media och filtrera genom en 30 μm cell SIL i ett nytt 15 mL koniskt rör.
- Tvätta röret och cellen SIL med 2 mL komplett Holmen media att samla in de återstående öarna och tillsätt i samma rör.
- Samla celler genom centrifugering vid 400 x g i 5 min.
- Försiktigt aspirera media och Omsuspendera cellpelleten i 5 mL 1x PBS som innehåller 0,04% BSA (PBS-BSA).
- Filtrera genom en ny 30 μm cellsil i ett 15 mL koniskt rör och centrifugera vid 400 x g i 5 minuter för att samla in celler.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 200-300 μL 1x PBS-BSA-lösning.
- Mät cellkoncentrationen och justera volymen till en slutlig koncentration av 400-500 celler/μL.
2. kvalitetskontroll av en cellsuspension
- Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av en Fluorescence-baserad automatiserad cell räknare34.
- Blanda 10 μL-celler med 0,5 μL AO/DAPI. Pipetten blandas noggrant. Ladda 10,5 μL på bilden och kör cell räknings analysen för att bestämma antal och lönsamhet.
- Späd och/eller filtrera cellsuspensionen efter behov baserat på cell räkningen.
3. Single cell partitionering med hjälp av en mikroflödessystem chip. Följ protokoll från mikroflödessystem chip tillverkare35.
- Ta 3 ' gel pärlor och omvänd Transkription (RT) reagenser till rumstemperatur (> 30 min). Rekonstruera RT primer i TE buffert om det behövs.
- Förbered RT Master Mix i ett låg bindnings rör som beskrivs i tabell 1.
- Bestäm antalet celler som ska matas in för varje prov. Beräkna den cellsuspension volym (X) som krävs för att leverera önskat mål cell nummer. Den beräknade volymen av nukleasfritt vatten som ska läggas till varje prov kommer att vara 33,8-X μL.
- För varje prov som skall partitioneras, tillsätt 33,8-X μL nukleasfritt vatten i 0,2 mL PCR-bandrör. Tillsätt sedan 66,2 μL Master Mix till varje bandtub. Lägg inte till cellerna till remsan röret på denna punkt. Pipettera försiktigt för att blanda. Placera de förberedda band rören på isen.
- Placera en mikroflödessystem chip i ett chip fall. Orientera spånfallet så att oljekällorna (rad märkt 3) är närmast den person som utför experimentet.
- Om du kör mindre än 8 prover, Använd 50% glycerol för att fylla oanvända kanaler i följande ordning:
- Tillsätt 90 μL av 50% glycerol i brunnarna i rad 1 för alla oanvända kanaler.
- Tillsätt 40 μL av 50% glycerol i brunnarna i rad 2 för alla oanvända kanaler.
- Tillsätt 270 μL av 50% glycerol i brunnarna i rad 3 för alla oanvända kanaler.
- Knäpp gel pärlorna i en virvel. Vortex i full fart under 30 s. Tryck på remsan på bänkskiva flera gånger för att samla pärlor. Bekräfta att det inte finns några bubblor närvarande.
- Tillsätt X μL av cellerna i de preparerade bandrören. Pipetten för att blanda 5 gånger. Utan att kasta pipettspetsarna, överför 90 μL cell blandning till rad 1 i chippet.
- Vänta 30 s, ladda sedan 40 μL gel pärlor till rad 2. Pipettera mycket långsamt för detta steg. Fördela 270 μL av partitionerings oljan till brunnarna på rad 3.
- Haka på spånpackningen på spånhållarens flikar. Placera den monterade spånhållaren i den enda cell partitionerings enheten och tryck på Run-knappen.
- Ta genast bort den monterade spånhållaren när körningen är slutförd.
- Ta bort spånpackningen från hållaren, öppna spånhöljet vid en vinkel på 45 ° och ta bort 100 μL av emulsionen från chipet till en blå plast 96-brunn-platta.
4. cDNA amplifiering med en cell. Följ protokoll från mikroflödessystem chip tillverkare35.
- Omvänd Transkription.
Obs: utför detta steg under en ren PCR-Only huva för att förhindra mikrobiell och annan kontaminering av det oförstärkta cDNA.- Försegla 96-väl blå plåt med en folie tätning på en uppvärmd tallrik sealer.
- Kör omvänd transkriptionsreaktion i en termisk apparat enligt följande: 53 ° c för 45 min à 85 ° c i 5 min à 4 ° c stadga.
Obs: Detta är en säker stopp punkt. Proverna kan hålla vid 4 ° c i upp till 72 h.
- Efter RT rening
- Ta med nukleinsyra bindande magnetiska pärlor och nukleinsyra storleksval magnetiska pärlor till rumstemperatur och Vortex att åter avbryta. Vid denna punkt, Tina provet rensning buffert för 10 min vid 65 ° c. Ta med alla andra reagenser till rumstemperatur och Vortex.
- Förbered buffertarna som visas i tabellerna 2 och tabell 3.
- Kemiskt bryta emulsionen och rena.
- För att göra det, ta försiktigt bort folietätningen från plattan.
- Fördela 125 μL av det rosa emulsion-brytande reagensmedlet i varje emulsion. Vänta i 1 min, sedan överföra hela volymen till en ren 0,2 mL Strip Tube. Se till att det finns ett lager av klar och ett lager av rosa i band röret.
- Ta bort 125 μL av det rosa skiktet från botten av band röret utan att störa det genomskinliga skiktet. Det är normalt för en liten volym (~ 15 μL) av det rosa skiktet att stanna kvar i röret.
- Tillsätt 200 μL rensnings blandning från tabell 2 till band röret och inkubera i rumstemperatur i 10 minuter.
- Överför band röret till ett magnetiskt stativ och låt lösningen rensa. Ta bort supernatanten och kassera, tvätta sedan pärlorna med 80% etanol två gånger. Låt pärlorna torka i 1 min.
- Ta bort band röret från magneten och tillsätt 35,5 μL elueringslösning från tabell 3 till pärlorna. Tillsätt pipetten för att Omsuspendera pärlorna i lösningen. Inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur.
- Överför band röret till ett magnetiskt stativ och låt lösningen rensa. Ta bort det renade cDNA från band röret och fördela det till ren 0,2 mL bandrör.
- Förstärka cDNA.
- Förbered amplifiering Master Mix i tabell 4, nedan.
- Tillsätt 65 μL cDNA amplifiering Master Mix till varje prov. Placera band röret i en termisk apparat och kör följande program: 98 ° c 3 min à 15 cykler av [98 ° c 15 s à 67 ° c 20 s à 72 ° c 1 min] à 72 ° c 5 min à 4 ° c Hold
Obs: Detta är en säker stopp punkt. Proverna kan hålla vid 4 ° c i upp till 72 h. - Rengör det förstärkta cDNA med 0,6 x nukleinsyrafärgade magnet pärlor. Tvätta två gånger med 80% etanol och eluera med 40,5 μl.
- Kör kvalitetskontroll cDNA med hjälp av automatiserad gel elektrofores och fluorescensbaserad DNA-kvantitationsanalys36,37.
Obs: Detta är en säker stopp punkt. Proverna kan hålla vid 4 ° c i upp till 72 h eller vid-20 ° c på obestämd tid.
5. sekvensering bibliotek konstruktion
- Och sanering av cDNA38.
- Normalisera cDNA till 50 ng i 20 μL av den totala volymen. Exakt kvantifiering är kritisk i det här steget.
- Gör tagmentation blandningen i tabell 5 och alikvot 30 μl till varje 20 μl cDNA-prov på is. Sätt proverna i termisk apparat och kör den tagmentation protokoll: 55 ° c 5 min à 10 ° c Hold.
- Utför sanering av tagmented cDNA med kolonner38. Tillsätt 180 μL DNA-bindningsbuffert i varje prov. Överför 230 μL till en rotations kolumn.
- Centrifugera vid 1300 x g i 2 min och kassera genomflödet.
- Tvätta två gånger med 300 μL DNA-tvättbuffert. Centrifugera ytterligare 2 min vid 1300 x g för att säkerställa etanol avlägsnande.
- Elute renat tagmented cDNA genom att tillsätta 31 μL elutionsbuffert i kolonnen och inkubera vid rumstemperatur i 2 min.
- Centrifugera i 2 min vid 1300 x g för att återvinna den renade produkten.
- Exempel index PCR.
- Välj streckkoder som inte överlappar under en multiplexerad sekvenserings körning.
- Gör ett prov index PCR Master Mix som visas i tabell 6.
- Tillsätt 60 μL prov index PCR Master Mix till 30 μL av det renade provet.
- Tillsätt 10 μL av ett prov index på 20 μM, 4-oligo till varje prov (rekordindex som används). Den totala reaktions volymen är nu 100 μL.
- Placera i en termisk apparat med locket inställt på 105 ° c. Kör följande program: 98 ° c 45 s à 12-14 cykler av [98 ° c 20 s à 54 ° c 30 s à 72 ° c 20 s] à 72 ° c 1 min à 4 ° c Hold.
Obs: Detta är en säker stopp punkt. Proverna kan hålla vid 4 ° c i upp till 72 h.
- Rena bibliotek med dubbel pärla städa upp.
- Tillsätt 100 μL av nukleinsyrafärde magnetiska pärlor till provet och blanda noggrant med en pipett. Inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Överför till en magnet och låt den stå tills lösningen rensas. Ta bort och Kassera supernatanten.
- Tvätta två gånger med 200 μL 80% etanol.
- Torka av pärlorna på magneten i 2 min. ta bort från magneten och tillsätt 50,5 μL EB-buffert till pärlpelleten. Återsuspendera pärlorna i bufferten.
- Inkubera vid rumstemperatur i 2 min. överför till en magnet och låt stå i 2 min. överför 50 μL eluerat prov till ett rent band rör.
- Tillsätt 40 μL nukleinsyra storleksurval magnetiska pärlor till provet och inkubera i rumstemperatur i 5 min. överför till en magnet och låt lösningen vara klar. Ta bort och Kassera supernatanten.
- Tvätta två gånger med 125 μL 80% etanol.
- Torka av pärlorna på magneten i 2 min. ta bort från magneten och tillsätt 60,5 μL EB-buffert till pärlpelleten. Återsuspendera pärlorna i bufferten.
- Inkubera vid rumstemperatur i 2 min. överför till en magnet och låt den stå i 2 min. överför 50 μL eluerat prov till ett rent band rör. Detta är det slutliga biblioteket.
- Håll proverna vid 4 ° c i upp till 72 h eller vid-20 ° c på obestämd tid. Observera att detta är en säker stopp punkt.
- Kvantifiera och kör kvalitetskontroll av biblioteken med hjälp av automatiserad gel elektrofores och fluorescensbaserad DNA-kvantifiationsanalys36,37. Späd proverna 1:10 innan du kör kvalitetskontroll.
6. sekvensering av bibliotek
- Normalisera varje prov som ska sekvenseras till 2 ng/μL och pool 3 μL av varje normaliserat prov tillsammans.
- Mät poolkoncentrationen med fluorescensbaserad DNA-kvantifiationsanalys37.
- Späd ut poolen till 0,25 ng/μL.
- Denaturera poolen enligt följande: 12 μL av det utspädda poolprovet (0,25 ng/μL) + 1 μL DNA-kontroll (1 nM), 2 μL EB-buffert + 5 μL NaOH (0,4 N). Låt detta Inkubera i 5 minuter och tillsätt sedan 10 μL 200 mM Tris pH 8,0.
- Fyll på 4,05 μL i 1345,95 μL HT1. Ladda 1,3 mL i Sequencer ' s Cartridge och kör enligt tillverkarens riktlinjer39 använda en sekvensering recept med 26 cykler (Läs 1) + 8 cykler (i7 index) + 0 cykler (i5 index) + 55 cykler (Läs 2).
7. Läs justering (tilläggsfil 1)
- Kör Cell Ranger (v 2.0.0) till Avmultiplexera RAW Base Call (BCL) filer som genereras av sekvensering i fastq filer. Justera FASTQ-filer till Human B 37,3 genom-sammansättning och UCSC-genmodell för att erhålla uttryckskvantifiering.
- Justering kvalitetskontroll.
- Generera justerings mått och kontrollera Q30 baser, giltig streckkod fraktion, cell-associerade Läs fraktion, mappade Läs fraktion och läsningar upptäcks i varje cell.
- Undersök streckkoden för streckkods rankning för att se till att de cellassocierade streckkoderna och bakgrunden skiljs åt.
8. data analys (kompletterande fil 2)
- Cell kvalitetskontroll och förprocess.
- Utesluta celler med < 500 identifierade gener, < 3000 totalt antal unika molekylära identifierare (UMI), > 0,2 lönsamhet Poäng som tidigare beskrivits32. Justera cutoffs enligt vävnad och celltyper.
- Ta bort dubbletter.
- Bedöm de fem endokrina hormonerna (glukagon- GCG, insulin- ins, somatostatin- SST, pankreaspolypeptid- PPY, och ghrelin- ghrl) för bimodal uttrycksmönster (hög-och låg uttrycks läge) med hjälp av R paketet mclust40.
- Ta bort celler som uttrycker mer än en hormon gen, dvs, med två eller flera hormon gener i hög uttrycks läge.
- Normalisera genuttrycket av total UMI och multiplicera med skalfaktorn 10 000 på cellnivå med hjälp av R-paketet Seurat41.
- Ta bort gener som upptäcks i mindre än 3 celler.
- Detektera variabla gener med hjälp av genomsnittliga uttryck och spridning av alla celler. Justera cutoffs enligt vävnad och celltyper.
- Utföra den huvudsakliga komponent analysen med de variabla generna. Kluster celler med det valda antalet huvudkomponenter. Härleda cell kluster berikade gener genom att jämföra ett cell kluster med resten av cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det encelliga RNA-sekvenserings arbetsflödet består av tre steg: separerar intakta humana öar till en enda cellsuspension, fångar enstaka celler med hjälp av en droplet-baserad teknik och analyserar RNA-SEQ-data (figur 1). För det första inkuberades de förvärvade Human öarna över en natt. De intakta holarna undersöktes under mikroskopet (figur 2A). Integriteten hos dissocierade ö-celler har validerats med hjälp av RNA-fluorescens i situ-hybridisering (RNA-fisk). Som framgår i figur 2bvisualiserades separerade α-och β-celler med hjälp av GCG och ins mRNA-prober, respektive.
Cell antal och lönsamhet måste bestämmas innan Single-cell Capture steg. Celler med låg lönsamhet eller hög smuts är inte lämpliga för vidare bearbetning. En bra cell koncentration varierar vanligtvis från 400 till 500 celler/μl. cirka 6000 celler laddades till mikroflödessystem chip i Single-cell partitionering steg, och 100 μl av gel pärlor i emulsion avlägsnades från chip. Figur 3a exemplifierar ett lyckat exempel på emulsion efter partitionerings steget. Vätskan i varje pipett tips är enhetlig blek Molnigt med minimal partitionering olja separeras från gelen pärlor. Figur 3b visar däremot en emulsion av dålig kvalitet med tydlig fasseparation mellan gel pärlor och olja. Detta kan bero på en täppa under chip Run.
Efter en enda cell partitionering utfördes cDNA-amplifiering. Figur 4a illustrerar en representativ fördelning av fragmentstorlek efter cDNA-amplifiering. Den typiska toppen för en god kvalitet cDNA prov bodde nära 1000-2000 BP. intressant, en spik nära 600 BP var specifik för Holmen cDNA. Fragmentets storleksfördelning för RNA-SEQ-biblioteken var mellan 300 och 500 BP (figur 4b).
Efter sekvenseringen använde vi en uppsättning Läs justerings mått för att utvärdera datakvalitet för encellig RNA-SEQ (tabell 7). De första tre måtten väl sammanfattade en enda cell sekvensering biblioteks kvalitet. I genomsnitt var 92% av läsningar härrör från intakt celler och 72% av läsningar kartlades till exoner. Av alla exon läser fångas i droppar, 90% av dem producerades av intakt celler och resten var sannolikt omgivande RNAs i cell-fria droppar. Dessa justerings mått tyder på god datakvalitet. Förhållandet mellan exon läsningar och UMI var en empirisk mätning för att utvärdera sekvensering mättnad och vanligtvis, 10:1 förhållandet var en bra indikator. Dessutom var antalet identifierade gener (UMI > 0) en användbar funktion för att karakterisera olika celltyper. För humana ö-celler är antalet upptäckta gener cirka 1 900 i varje cell.
Vi sekvenserade totalt 20 811 ö-celler från 12 icke-diabetiska givare. Uttryck för mer än ett hormon upptäcktes i cirka 6% av cellerna. Dessa multi-hormonella celler är mest sannolikt dubletter eftersom vårt tidigare arbete visade att mindre än < 0,1% av enstaka holme celler Co-uttryckte mer än ett endokrina hormon33. Vi bort alla identifierade multi-hormonella celler. Det är också viktigt att utesluta celler av låg kvalitet baserat på totalt UMI, upptäckta gener och cellviabilitet33. Efter dessa kvalitetskontroll steg förblev 19 174 för vidare analys. Kluster analysen avslöjade 12 celltyper: α-, β-, δ-, PP, ε-celler, acinar, duktal, quiescent stellat, aktiverat stellat, endotelial, makrofagoch mastceller (figur 5). Som väntat var de endokrina cellerna majoriteten (tabell 8). De översta berikade generna i α-celler (dvs. GCG, TTR, CRYBA2, TM4SF4, TMEM176B) och β-celler (t. ex. IAPP, ins, hadh, DLK1, RBP4) är förenliga med andra studierna13,15,16,17,18,20,21,22,29 ,30,31,33. Intressant nog bestod både α-och β-celler av flera subpopulationer. Tre β-cell subpopulations, beta sub1, 2, och 3, var liknande med litet antal subpopulationsberikad gener (18 i beta sub1, 33 i beta sub 2, och 18 i beta sub 3). Den fjärde subpopulationen hade 488 anrikade gener. Den lilla α-cell-subpopulationen (alfa sub3) bestod av prolifererande celler, kännetecknad av berikat uttryck av MKI67, CDK1och TOP2A.
Bild 1: Schematiskt diagram över ett arbetsflöde för enkelcellig RNA-sekvensering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa bilder av intakta och separerade humana öar. A) en bild av öar som tagits efter inkubation över natten. (B) separerade ö-celler visualiseras av RNA-fisk färgning för ins (vit) och GCG (röd). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: undersökning av kvaliteten på encellig emulsion före omvänd Transkription. Aen enkelcellig emulsion av god kvalitet. Vätskan i varje pipspets var homogen i grumlig form. Ben encellig emulsion av dålig kvalitet. Vätskan i pipettspetsen var inte homogen och visade separation mellan olja och gel pärlor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: undersökning av kvaliteten på cDNA med en cell och ett bibliotek. A) ett representativt cDNA-spår. Detta cDNA var av god kvalitet och avkastning, med den viktigaste toppen för provet som inträffar nära 1000-2000 BP. Spetsen i spåret runt 600 BP var typiskt och utmärkande för Holmen cDNA. B) en representativ slutlig sekvenserings biblioteks spårning. Detta bibliotek var av god kvalitet och avkastning, med den största toppen inträffar mellan 300-500 BP. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: cell typer och subpopulationer identifierade i encelliga RNA-sekvensering av humana pankreasöar. Celler grupperades av distinkta celltyper i utrymmet för t-distribuerad stokastisk granne inbäddning (tSNE) dimensioner. Analysen avslöjade också tre subpopulationer i α-celler och fyra i β-celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagensmedlets namn | Vol. att använda (μL) per reaktion |
| RT reagens mix | 50 |
| RT primer | 3,8 |
| Tillsats A | 2,4 |
| RT-Enzymblandning | 10 |
| Totala | 66,2 |
Tabell 1: omvänd avskrift mix.
| Reagensmedlets namn | Volym att använda (uL) per reaktion |
| Nukleasfritt vatten | 9 |
| Buffertprov städa upp 1 | 182 |
| Dynabeads MyOne SILANE | 4 |
| Tillsats A | 5 |
| Totala | 200 |
Tabell 2: rensnings blandning.
| Reagensmedlets namn | Volym att använda (uL) per reaktion |
| Buffert EB | 98 |
| 10% Tween 20 | 1 |
| Tillsats A | 1 |
| Totala | 100 |
Tabell 3: elueringslösning.
| Reagensmedlets namn | Volym att använda (uL) per reaktion |
| Nukleasfritt vatten | 8 |
| Förstärknings Master Mix | 50 |
| cDNA-tillsats | 5 |
| cDNA primer mix | 2 |
| Totala | 65 |
Tabell 4: blandning av cDNA-amplifiering.
| Reagensmedlets namn | Volym att använda (μL) per reaktion |
| Tagmentation enzym | 5 |
| Tagmentation buffert | 25 |
| Totala | 30 |
Tabell 5: blandning av Tagmentation.
| Reagensmedlets namn | Volym att använda (μL) per reaktion |
| Nukleasfritt vatten | 8 |
| Förstärknings Master Mix | 50 |
| SI-PCR primer | 2 |
| Totala | 60 |
Tabell 6: exempel på index-PCR-Mastermix.
| Exempel-ID | % Läsningar med giltiga cell streckkoder | % Exon läser i fångade celler bland totala celler | % Exon läser bland totalt antal läsningar | Medelvärde exon läser per cell | Median-UMI per cell | Median-gener per cell |
| Sample-1 | 92% | 93% | 76% | 142 015 | 10 310 | 1 747 |
| Sample-2 | 92% | 91% | 74% | 151 395 | 11 350 | 1 754 |
| Sample-3 | 94% | 92% | 75% | 120 538 | 19 604 | 2 180 |
| Sample-4 | 95% | 93% | 67% | 160 657 | 11 870 | 2 111 |
| Sample-5 | 94% | 92% | 62% | 177 809 | 13 821 | 2 288 |
| Sample-6 | 95% | 89% | 67% | 138 208 | 8 235 | 1 296 |
| Sample-7 | 94% | 89% | 72% | 147 484 | 13 606 | 2 272 |
| Prov-8 | 94% | 91% | 69% | 159 793 | 9 505 | 1 865 |
| Sample-9 | 95% | 92% | 72% | 168 436 | 12 794 | 2 389 |
| Sample-10 | 83% | 83% | 74% | 88 067 | 13 323 | 1 805 |
| Sample-11 | 82% | 88% | 77% | 67 752 | 9 295 | 1 278 |
| Sample-12 | 91% | 85% | 74% | 194 781 | 14 877 | 1 746 |
Tabell 7: Läs justerings måtten.
| Cell typ | Antal celler | Ave. celler per givare (standardavvikelse) |
| Alpha | 6546 | 546 (258) |
| Beta | 7361 | 613 (252) |
| Delta | 922 | 77 (37) |
| Pp | 545 | 45 (25) |
| Epsilon | 11 | 1 (1) |
| Acinar | 836 | 70 (71) |
| Duktal | 1313 | 109 (95) |
| Quiescent stellate | 225 | 19 (14) |
| Aktiverad stellate | 890 | 74 (58) |
| Endothelial | 408 | 34 (21) |
| Makrofag | 80 | 7 (6) |
| Schwann | 37 | 3 (3) |
Tabell 8: cell typs sammansättning. Totalt antal celler för varje celltyp och genomsnittliga celler för varje givare i varje celltyp.
Tilläggsfil 1: kommandon som används för sekvensjustering. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande fil 2: R skript för att utföra cell kvalitetskontroll, cell kluster, och för att identifiera cell-typ berikade gener. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single-cell-teknik som utvecklats under de senaste åren ger en ny plattform för att karakterisera celltyper och studera molekylära heterogenitet i mänskliga pankreasöar. Vi antog ett protokoll av droplet-baserade mikroflödessystem Single-cell isolering och dataanalys för att studera mänskliga öar. Vårt protokoll producerade framgångsrikt RNA-sekvenserings data från över 20 000 enstaka humana ö-celler med relativt små variationer i sekvenskvalitet och batcheffekter.
I synnerhet är två steg kritiska i detta protokoll för högkvalitativa resultat. Försiktighet måste iakttas vid separering av mänskliga öar. Det är viktigt att inte över smälta kobbar. Single-cell partitionering är en annan viktig steg för en lyckad Single-cell experiment. Vi demonstrerade exempel på bra-och dålig kvalitet emulsioner i figur 3. En klar emulsion är vanligtvis ett tecken på otillräckligt antal celler som samlas in i partitionerings steget.
Tillgången till isolerade primära humana öar är ett hastighetsbegränsande steg för att generera storskaliga mänskliga holme encelliga transkriptomer. Isolerade öar från enskilda kadaver givare bearbetas vanligtvis vid olika tidpunkter, så potentiella prov beroende batcheffekter bör undersökas noggrant under dataanalys. Integrativ analys kan användas för att identifiera vanliga celltyper och subpopulationer i enskilda partier41. Batcheffekten kan också justeras med batchkorrigerad uttryckskvantifiering42. En annan utmaning att analysera enkelcellig RNA-SEQ-data är att identifiera dubbletter. I data förbehandling, vi vidtog åtgärder för att ta bort endokrina dubletter genom att identifiera celler som uttrycker flera hormon gener (GCG, ins, SST, PPY, och ghrl). Identifiering av dubbletter som bildas av två olika celltyper är en relativt lätt uppgift på grund av det extremt höga uttrycket av endokrina hormoner. Den verkliga utmaningen är att identifiera i-cell-typ dubletter, e.g., dubletter av två α-celler. Eftersom högre UMI och högre antal upptäckta gener är suggestiva av potentiella dubbletter, är en lösning att ta bort extremvärden med ett stort antal gener och UMI under cell QC steg. Dessutom är verktyg för att upptäcka dubbletter tillgängliga43,44,45.
En stor begränsning av enkelcellig RNA-sekvensering är låg känslighet. Med hjälp av Spike-in externa RNA Controls Consortium (ERCC) RNAs, vi uppskattade att endast 10% av alla uttryckta gener upptäcktes med hjälp av det nuvarande protokollet och att upptäckta dem var partiska mot hög förekomst gener46. Bukspottskörteln endokrina celler uttrycker extremt hög nivå av hormon gener (dvs., GCG, ins, SST, och PPY). Som ett resultat, den mRNAs av dessa gener har risken att bli omgivande RNA. Sådana bakgrundsljud kan inte helt undvikas. Emellertid, detta steg-för-steg-protokollet kommer att hjälpa forskare minimera oönskade experimentella ljud. Det aktuella protokollet är utformat för nyisolerade vävnader. Andra teknologier, som Single-Nucleus RNA-sekvensering47,48, finns tillgängliga för RNA-SEQ av färska, frysta eller lätt fixerade vävnader. Dessutom, en nyligen utvecklad cell hash Technology49 kan betraktas som en avancerad mikroflödessystem encellig protokoll som tillåter prov Multiplexing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Samtliga författare är anställda och aktieägare i Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , 10X Genomics. (2017).
- Agilent Technologies. Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent Technologies. (2013).
- Thermo Fischer Scientific. Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , Thermo Fischer Scientific. (2015).
- Illumina. Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , Illumina. (2016).
- Illumina. llumina NextSeq 500 System Guide. , Illumina. (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
