Summary
Die biologische Membranfusion wird durch spezialisierte Fusionsproteine katalysiert. Die Messung der fusogenen Eigenschaften von Proteinen kann durch Lipid-Mischtests erreicht werden. Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung des rekombinanten Drosophila Atlastin, ein Protein, das die homotypische Fusion des ER vermittelt, es zu vorgeformten Liposomen restituiert und auf Fusionskapazität getestet wird.
Abstract
Die Membranfusion ist ein entscheidender Prozess in der eukaryotischen Zelle. Spezielle Proteine sind notwendig, um die Fusion zu katalysieren. Atlastine sind endoplasmatische Retikulum (ER) gebietsansässige Proteine, die an der homotypischen Fusion des ER beteiligt sind. Wir beschreiben hier eine Methode zur Reinigung einer Glutathion-S-Transferase (GST) und Polyhistidin mit dem Tag Drosophila atlastin durch zwei Runden Affinitätschromatographie. Die Untersuchung von Fusionsreaktionen in vitro erfordert das Einsetzen gereinigter Fusionsproteine in eine Lipid-Bilayerin. Liposomen sind ideale Modellmembranen, da Lipidzusammensetzung und -größe angepasst werden können. Zu diesem Zweck beschreiben wir ein Rekonstitutionsverfahren durch Waschmittelentfernung für Drosophila Atlastin in vorgeformte Liposomen. Während mehrere Rekonstitutionsmethoden zur Verfügung stehen, hat die Rekonstitution durch Waschmittelentfernung mehrere Vorteile, die es für Atlastine und andere ähnliche Proteine geeignet machen. Der Vorteil dieser Methode ist eine hohe Rekonstitutionsausbeute und die korrekte Ausrichtung des rekonstituierten Proteins. Diese Methode kann auf andere Membranproteine und für andere Anwendungen ausgedehnt werden, die Proteoliposomen erfordern. Zusätzlich beschreiben wir einen FRET-basierten Lipid-Mischtest von Proteoliposomen, die als Messung der Membranfusion verwendet werden.
Introduction
Membranfusion ist ein kritischer Prozess in vielen biologischen Reaktionen. Unter biologischen Bedingungen ist die Membranfusion nicht spontan und erfordert spezielle Fusionsproteine, um solche Reaktionen zu katalysieren1. ER homotypische Membranfusion wird bei Tieren durch die Dynamin-ähnliche GTPase Atlastin2vermittelt. Atlastins Rolle bei der homotypischen Fusion ist von grundlegender Bedeutung für Drei-Wege-Kreuzungen im peripheren ER, das ein großes miteinander verbundenes Netz von Tubuli bildet, die sich über die gesamte Zelle erstrecken. Atlastine haben eine konservierte Domänenmorphologie, bestehend aus einer großen GTPase, einer drei Helix-Bundle-Mitteldomäne, einem hydrophoben Membrananker und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminalschwanz3. In-vitro-Studien mit rekombinantem Drosophila Atlastin haben gezeigt, dass es bei rekonstituiert er zu Liposomen seine fusogene Eigenschaften beibehält. Andere Atlastine, einschließlich menschlicher Homologe, konnten die Fusion in vitro nicht rekapitulieren. Wir beschreiben hier eine Methode zur Reinigung einer GST und Poly-Histidin getaggt rekombinanten Drosophila Atlastin, Rekonstituierung zu Liposomen, und Assaying Fusion.
Das Studium der Membranfusion in vitro stellt eine Herausforderung dar, da fusogene Proteine in der Regel einen Membrananker haben. Um sie zu studieren, ist es notwendig, sie in Modelllipid-Doppelschichten zu rekonstituieren. Große unilamellare Vesikel (LUV) sind ein nützliches Werkzeug, um Lipidprotein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Wir präsentieren hier ein System zur Herstellung von LUVs aus verschiedenen Lipidzusammensetzungen für Proteinrekonstitution und Fusionstests. Die Rekonstitution von integralen Proteinen in LUVs kann durch eine Vielzahl von Methoden erreicht werden, einschließlich organischer lösungsmittelvermittelter Rekonstitution, mechanischer Mechanismen oder waschmittelunterstützter Rekonstitution4. Wir präsentieren hier eine Methode zur Rekonstituierung von Drosophila-Atlastin in vorgeformte Liposomen durch Waschmittelentfernung. Zu den Vorteilen dieser Rekonstitutionsmethode gehören hohe Rekonstitutionsausbeuten und die richtige Ausrichtung von Atlastin in der Lipid-Bilayer. Darüber hinaus wird das Protein durch diese Methode nicht getrocknet oder organischen Lösungsmitteln ausgesetzt, wodurch Struktur und Funktion erhalten bleiben. Unter seinen Nachteilen ist das Vorhandensein von Detergenzien möglicherweise nicht ideal für alle Proteine und die endgültigen Proteoliposomen können ein eingebautes Reinigungsmittel in die Lipid-Bilayer haben. Weitere Dialyse kann verwendet werden, um mehr von dem Waschmittel zu beseitigen. Die Dialyse kann jedoch lange dauern und kann daher zum Verlust der Proteinaktivität führen.
Die Beurteilung der Fusionsaktivität von Atlastin kann durch Lipid-Mischtests wie zuvor beschrieben bestimmt werden2. Hier wird ein Verfahren zur Messung der atlastin vermittelten Fusion durch N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl(NBD)/Lissamine rhodamine-B Sulfonyl (Rhodamine) mit Lipiden beschrieben. Dieser Test erfordert die Fusion von Spenderproteoliposomen und Akzeptor-Proteoliposomen. Eine FRET-Freisetzung kann während der Reaktion als Verdünnung eines Spender-Akzeptor-Paares von "markierten" Liposomen zu "unbeschrifteten" Liposomen als Folge der Lipidmischung während der Membranfusion gemessen werden (Abbildung 1)5. Während dieser Assay als Proxy für die Membranfusion dient, ist er bei der Unterscheidung zwischen Membranfusion und Hemifusion begrenzt, einem Zustand, in dem sich nur die äußeren Blättchen vermischen. Um dieses Problem zu beheben, ist eine Alternative das Abschrecken von NBD durch Dithionit. Nach der gleichen Methode wie NBD/Rhodamine Lipid-Mischtests, nach dem Abschrecken der äußeren Packungsbeilage wird jede NBD FRET Freisetzung durch Fusion durch innere Packungsbeilage Mischen8.
Alternative Fusionsassays durch innerwässriges Mischen adressieren voll fusion nur5. Beispiele hierfür sind Terbium (Tb)/Dipicolinsäure (DPA) Assays und Aminonaphthalintrisulfonsäure (ANTS)/p-Xylol bis(pyridinium) bromid (DPX) Assays. In Tb/DPA-Assays wird ein Pool von Liposomen mit gekapseltem Tb gemischt und mit Liposomen mit gekapseltem DPA verschmolzen; bei fusion wird die Fluoreszenz durch interne Energieübertragung von DPA zu Tb innerhalb des [Tb(DPA)3]3- Chelationskomplexes6erhöht. Im Gegensatz dazu wird ants Fluoreszenz bei ANTS/DPX-Assays durch DPX7abgeschreckt. Während diese Systeme die Mischung des inneren Inhalts betreffen, ist eine eingehendere Herstellung von Liposomen erforderlich, um nicht verkapselte Reagenzien sowie unbeabsichtigte Wechselwirkungen der Fluorophore zu entfernen.
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Protocol
1. Reinigung von GST-DAtl-His8
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Proteinexpression und Lysatzubereitung
- Transformieren Sie BL21 (DE3) E. coli mit dem GST-DAtl-His8-Konstrukt in pGEX4-T32 und wählen Sie auf einer Ampicillinplatte.
- Wählen Sie ein einzelnes Transformant und impfen 5 ml LB + Ampicillin (5 l von 100 mg/ml Ampicillin) in einem 14 ml Kulturrohr und inkubieren bei 25 °C mit Schütteln bei 200 U/min für 6-8 h.
HINWEIS: Aufgrund der undichten Expression wird nicht empfohlen, bei höheren Temperaturen zu brüten. Das Wachstum bei 25 °C reduziert die Proteinaggregation während dieser Wachstumsphase. - 200 ml LB + Ampicillin mit 1 ml der 5 ml Kultur impfen und über Nacht bei 25 °C inkubieren .15–18 h.
- Am nächsten Morgen ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation (2.000 x g für 10 min) und suspendieren Sie in 5 ml LB.
- 4 L LB + Ampicillin impfen und OD600 (0,05–0,15) messen. Bei 25 °C mit Schütteln bebrüten.
HINWEIS: Reservieren Sie einige Medien, um als Rohling für die OD600 Messungen zu dienen, bevor Sie Bakterien hinzufügen. - Messen Sie OD600 stündlich, bis ein OD zwischen 0,4 und 0,5 erreicht wird. An dieser Stelle die Temperatur auf 16 °C reduzieren.
- Induzieren mit 0,2 mM IPTG (800 l von 1 M Vorrat), 10 min nach dem Inkubator erreicht 16 °C. Über Nacht bei 16 °C inkubieren .15–18 h.
HINWEIS: Die niedrigere Temperatur verbessert die Ausbeute des funktionellen Proteins, indem die Aggregation von Atlastin reduziert wird. - Am nächsten Morgen ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 7.500 x g bei 4 °C.
- Setzen Sie die Zellen in 200 ml A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) und 200 mM KCl) wieder aus.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 11.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Das Pellet in 40 ml Bruchpuffer (A200 plus 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mM Imidazol und eine EDTA-freie Protease-Hemmer-Cocktailtablette wieder aufsetzen.
HINWEIS: Fügen Sie TX-100 nach dem Wiederaufsetzen hinzu, um Blasen und Schaum zu vermeiden. - Durchqueren Sie eine 18 G Nadel und führen Sie die Zellen dreimal bei 10.000 psi durch einen Zellstörer.
- Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 125.000 x g für 1 h.
HINWEIS: Optional das Pellet 1:2 (w:v) in 8 M Harnstoff auflösen und bei Raumtemperatur über Nacht nussen. Harnstoff als Denaturierungsmittel löst für die SDS-PAGE-Analyse langsam jedes unlösliche Pelletprotein auf. Sparen Sie 1 L für die SDS-PAGE- und Coomassie-Fleckenanalyse. - Filtern Sie den Extrakt durch einen 0,45 m großen Zellstoffnitrat-Sterilmembranfilter, um Bakterien und große bakterielle Ablagerungen zu entfernen.
HINWEIS: Optional sparen Sie 1 L für sDS PAGE und Coomassie Fleckenanalyse.
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Proteinreinigung durch Affinitätschromatographie
- Das gefilterte Lysat auf eine immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) Harzsäule mit Ni2+laden, vorausgeglichen mit niedrigem Imidazolpuffer (A100 plus 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 1% TX-100, 40 mM Imidazol) mit einer Rate von 1 ml/ min bei 4 °C.
- Die Säule mit 25 ml A100 plus 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 ml Imidazol mit einer Rate von 1 ml/min bei 4°C waschen. Elute das Protein mit einem 30 ml linearen Gradienten von Imidazol von 40 mM bis 500 mM, und eine abschließende 5 ml Waschen bei 500 mM.
- Spitzenfraktionen zusammenspulen und 1 h bei 4 °C mit geschwollenen GSH-Agarose-Perlen, die zuvor in Wasser geschwollen und in A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 und 1 mM EDTA ausgeglichen wurden, inkubieren.
HINWEIS: GSH-Agarose Perlen können in 50 ml Wasser am Vortag geschwollen und über Nacht bei 4 °C oder für 1 h bei RT inkubiert werden. Um Wasser und Ausgleichspuffer zu entfernen, zentrifugieren Sie in einem schwingenden Schaufelrotor bei 500 x g für 1 min ohne Bremse. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 26 G Nadel. - Pellet GSH-Agarose Perlen durch Zentrifugieren in einem schwingenden Schaufelrotor bei 500 x g ohne Bremse und entfernen Sie den Lysatüberstand durch Aspiration mit einer 26 G Nadel.
- Die Perlen in eine 10 ml Polyprep-Säule geben und fünfmal mit 5 ml Ausgleichspuffer (A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 und 1 mM EDTA) durch Zentrifugieren bei 500 x g waschen.
- Elute das Protein mit 1–1,5 ml Gleichgewichtspuffer ergänzt mit 10 mM reduziertglutathion. Aliquot eluted Protein und Flash Gefrieren in flüssigem Stickstoff. Protein kann bei -80 °C unbegrenzt gelagert werden.
HINWEIS: PH des Elutionspuffers auf 7.4 einstellen. - Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration durch amido schwarzen Protein-Assay9 und bewerten Sie die Reinheit durch SDS-PAGE- und Coomassie-Färbung.
2. Rekonstitution von rekombinantes Atlastin in Liposomen
- Liposomenproduktion durch Extrusionsverfahren 10
- Herstellung von Lipidmischungsvorräten in Chloroform (10 mM Gesamtfett). Die notwendigen Lipide sind 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-Glycero-3-Phosphocholin (POPC), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin (DOPS), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) und 1,2- Dipalmitoyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin-N-(Lissamine Rhodamin B Sulfonyl) (Rh-DPPE). Akzeptor-Liposomen bestehen aus POPC: DOPS (85:15 Molarenverhältnis) und Spenderliposomen von POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 Molar ratio).
HINWEIS: Während POPC:DOPS Lipidmischungen traditionell für In-vitro-Lipid-Mixing-Assays verwendet wurden, können alternative Lipidzusammensetzungen für verschiedene experimentelle Zwecke angepasst werden. POPC:DOPS Liposomen sind sehr stabil und schwerer zu verschmelzen, daher ist ein sehr strenges System für die Fusion. - Fügen Sie den Lipidmischungen 1 Ci/ml L-Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin (Cholinmethyl-3H) hinzu, um die Lipidkonzentrationen in späteren Schritten durch Flüssigszintillationszählung zu bestimmen. Reservieren Sie mindestens 8 L dieses Bestands.
- Übertragen Sie die gewünschte Menge an Lipidmischungen auf Feuersteinglasröhren.
- Trocknen Sie die Lipidmischungen unter einem sanften Strom von N2-Gas für 10 min, bis keine Chloroform mehr sichtbar ist.
- Trocknen Sie den Lipidfilm weiter in einem Trockenbau, indem Sie 30 min saugen.
- Fügen Sie genügend wässriges A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA in den Lipidfilm und bringen Sie die Konzentration wieder auf 10 mM. Den Lipidfilm durch leichtes Wirbeln 15 min bei Raumtemperatur wieder aufhängen. Ein Wirbel, der Feuersteinglasröhren aufnehmen kann, wird empfohlen.
- Zehnmal die hydratisierten Lipide in flüssigem Stickstoff einfrieren. Nach dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff, tauen Sie die Liposomen, indem Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 30 s sitzen lassen, dann in Wasser für schnelleres Auftauen übertragen. Dieses Gefrier-Tau-Zyklus minimiert multilamellare Vesikel.
ACHTUNG: Rohre können reißen, wenn sie Einbände größer als 0,5 ml enthalten und wenn sie direkt flüssigen Stickstoff ins Wasser übertragen werden. - Übergeben Sie das Lipid durch Polycarbonat-Filter mit 100 nm Porengröße 19 Mal mit Mini-Extruder.
- Bestimmung der Gesamtfettkonzentration von Liposomen durch Szintillationszählung
HINWEIS: Ein Teil des Lipids kann in Glasröhren und mini-Extruder zurückgelassen werden.- Fügen Sie 4 l Lipidstock und Liposomen in 3 ml Szintillationscocktail hinzu.
- Messen Sie die durchschnittliche Anzahl pro Minute (CPMA) für Vorrat und Liposomen. Und berechnen Liposomen Konzentration mit der folgenden Formel:
- Bewahren Sie die Liposomen bis zu einer Woche bei 4 °C auf. Längere Lagerung wird nicht empfohlen, da Liposomen mit der Zeit aggregieren können, was die Rekonstitutionseffizienz verringert.
- Herstellung von Lipidmischungsvorräten in Chloroform (10 mM Gesamtfett). Die notwendigen Lipide sind 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-Glycero-3-Phosphocholin (POPC), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin (DOPS), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) und 1,2- Dipalmitoyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin-N-(Lissamine Rhodamin B Sulfonyl) (Rh-DPPE). Akzeptor-Liposomen bestehen aus POPC: DOPS (85:15 Molarenverhältnis) und Spenderliposomen von POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 Molar ratio).
- Rekonstitution durch waschmittelunterstützte Aufnahme in vorgeformte Liposomen
- Berechnen Sie die Menge an Puffer, Protein, Liposomen und zusätzlichem Reinigungsmittel, die miteinander vermischt werden sollen:
- Bestimmen Sie das gewünschte Gesamtvolumen. Dieses Volumen besteht aus Puffer A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA. Volumen von weniger als 250 l mischen sich nicht gut in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhren.
- Berechnen Sie das Volumen der Liposomen, die benötigt werden, um eine endgültige Lipidkonzentration von etwa 1 mM zu ergeben. Subtrahieren Sie das Volume vom Puffervolume.
- Berechnen Sie das Proteinvolumen, das benötigt wird, um das gewünschte Protein zu Lipid-Molar-Verhältnis (in der Regel 1:400) zu geben. Verringern Sie das Puffervolumen entsprechend.
- Bestimmen Sie, wie viel zusätzliches Reinigungsmittel hinzugefügt werden muss, um dieLiposomen zu sättigen, die auf ein effektives Waschmittel-Lipid-Verhältnis (R eff) zwischen 0,64–0,8 abzielen. Denken Sie daran, das Waschmittel zu berücksichtigen, das mit dem Protein hinzugefügt wird. Die (Reff) wird
durch die Gleichung Dgesamt bestimmt ist die Gesamtwaschmittelkonzentration und DWasser ist die monomere Waschmittelkonzentration (0,18 mM für TX-100 und Anapoe X-100 in Gegenwart von Waschmittel)4, 11.
- Mischen Sie die Lösungen in einem 0,5 ml-Rohr in der folgenden Reihenfolge: Puffer, Waschmittel, Protein und Liposomen. Fügen Sie die Liposomen schnell und Wirbel sofort für 5 s, um die Mischung zu homogenisieren.
- Inkubieren Sie die Reaktion in einem Nutator für 1 h bei 4 °C.
- 0,2 g/ml unpolares Polystyrol adsorbierende Perle "Schlämme" in Wasser.
HINWEIS: Machen Sie die Polystyrol Adsorbent Perle "Schlämme" während der vorherigen 1 h Inkubation in Schritt 2.2.3. - 0,2 g Polystyroladsorbentperlen abwägen und in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen.
- Entgasen Sie die Perlen, indem Sie 1 ml Methanol in die Röhre geben und für 1 min mischen. Degassed Perlen werden sinken.
- Das Methanol ansaugen und den Perlen Wasser hinzufügen. Lassen Sie die Perlen mit Wasser für 5 min mischen, dann das Wasser aspirieren. Viermal wiederholen, dann die Polystyrol adsorbierende Perle "Schlämme" auf 1 ml Volumen mit Wasser und einer Endkonzentration von 0,2 g/ml bringen.
HINWEIS: Perlen sollten sich immer noch an der Unterseite der Röhre absetzen. Wenn sie es nicht tun, entgasen Sie wieder. Verwenden Sie eine 21 G oder höhere Nadel, um Methanol und Wasser aus Perlen zu aspirieren. - Berechnen Sie die Menge an Polystyrol adsorbent Perlen benötigt, um alle Reinigungsmittel in jeder Probe zu absorbieren. 1 g Polystyrol adsorbent Perlen absorbiert 70 mg TX-100. Um das Volumen der für jede Reaktion benötigten Polystyroladsorbent-Perle zu berechnen, dividieren Sie das gesamte Waschmittel in der Reaktion (Schritt 2.2.1.4) durch 70 mg und dann durch die Konzentration der Perlenschlämme (0,2 g/ml (Schritt 2.2.7).
- Berechnete Menge an Polystyrol adsorbierender Perle auf ein 0,5 ml Rohr übertragen und das Wasser ansaugen.
HINWEIS: Schneiden Sie das Ende einer 20–200 L-Spitze, um die Perlen zu übertragen, Wirbel das Rohr kurz vor dem Pipettieren, um abgesetzte Perlen wieder zu suspendieren. - Fügen Sie die Proben in das 0,5 ml-Rohr mit Polystyrol-Adsorbierperlen und inkubieren Sie die Probe für 1 h bei 4 °C.
- Wiederholen Sie zweimal alte Perlen zurück lassen und die Probe auf frische Perlen übertragen.
- Fügen Sie die Probe in eine vierte Röhre mit frischen Perlen und inkubieren über Nacht (15-18 h) bei 4 °C.
- Berechnen Sie die Menge an Puffer, Protein, Liposomen und zusätzlichem Reinigungsmittel, die miteinander vermischt werden sollen:
- Am Morgen die Probe von Polystyrol adsorbent Perlen und Pellet unlöslichen Proteinaggregaten durch Zentrifugieren für 10 min bei 16.000 x g bei 4 °C entfernen.
- Den Überstand wiederherstellen und die endgültige Lipidkonzentration durch Flüssigszintillationszählung bestimmen (siehe Schritt 2.1.9.2). Optional kann die Proteinkonzentration durch amido schwarzen Protein-Assay9bestimmt werden.
HINWEIS: Bei Atlastin-Proteoliposomen sollten enzymatische Assays mit frischen Liposomen durchgeführt werden. Lange Lagerung bei 4 °C oder Einfrieren führt zu signifikanten Verlusten in der Atlastinaktivität.
durch die Gleichung Dgesamt bestimmt ist die Gesamtwaschmittelkonzentration und DWasser ist die monomere Waschmittelkonzentration (0,18 mM für TX-100 und Anapoe X-100 in Gegenwart von Waschmittel)4, 11.3. Lipid Mixing Assays
- Bringen Sie die Spender- und Akzeptorproteoliposomen auf eine Konzentration von je 0,15 mM in A100 mit 10% Glycerin, 2 mM-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA und 5 mM MgCl2. Jede Reaktion (50 l) sollte einem Brunnen in einer flachen weißen 96-Well-Platte zugesetzt werden, die für Fluoreszenzmessungen geeignet ist. Bereiten Sie mindestens 4 Reaktionen vor, einschließlich einer Dreifach-Steuerung und einer negativen Kontrolle ohne GTP.
- Legen Sie die Platte in einen vorgeheizten Plattenleser bei 37 °C. Messen Sie die NBD-Fluoreszenz (Erregung 460 nm und Emission 535 nm) für 5 min pro min.
- Induzieren Sie die Fusion durch Zugabe von 5 mM GTP (5 l von 50 mM GTP).
- Messen Sie die NBD-Fluoreszenz jede Minute für 1 h.
- Fügen Sie 5 l von 2,5% w/v n-Dodecyl-D-Maltosid hinzu, um die Proteoliposomen aufzulösen und die maximale NBD-Fluoreszenz zu messen. Lesen Sie NBD Fluoreszenz für 15 min pro min.
4. Liposomen-Floatation auf Iohexol Discontinuous Gradient12
- (optional) Analysieren Sie die Effizienz der Rekonstitution durch Floatationstests13.
- Bereiten Sie ein 80% und ein 30% w/v Iohexol in A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA vor. Iohexol löst sich nicht leicht auf, daher muss dies einen Tag vorher durch Übernacht bei 4 °C zubereitet werden.
- Mischen Sie 150 L 80% Iohexol-Bestand mit 150 L Proteoliposomen Probe, um es zu einem 40% Iohexol zu bringen. Fügen Sie dies zu einem 5 x 41 mm2 Ultra-Clear-Rohr hinzu, das Blasen vermeidet.
- Schicht 250 l von 30% Iohexol Bestand langsam auf der Oberseite der Probe, um eine mittlere Schicht zu machen. Vermeiden Sie Blasen und stören Sie die untere Schicht. Auf der Oberseite der mittleren Schicht, langsam 50 l A100 mit 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA hinzufügen.
- Zentrifugieren Sie den Gradienten in einem schwingenden Schaufelrotor bei 220.000 x g für 4 h bei 4 °C mit langsamer Beschleunigung und ohne Bruch.
- Ernten Sie die Schichten des Farbverlaufs und analysieren Sie durch SDS-PAGE und Coomassie Fleck, Quantifizierung kann durch Densitometrie durchgeführt werden. Rekonstituiertes Protein sollte in die obere Schicht schweben, während Protein- und Lipidaggregate am Boden oder in der mittleren Schicht sedimentieren.
5. Analyse der Ausrichtung des rekonstituierten Proteins durch Thrombin-Proteolyse
HINWEIS: Das hier gemeldete Atlastin-Konstrukt hat eine Thrombin-Schnittstelle zwischen dem Ende des N-Terminal-GST-Tags und dem Beginn von Atlastin. Atlastin in der richtigen Ausrichtung wird diese Schnittstelle für die Protease zugänglich haben, während Protein in der falschen Ausrichtung durch die Lipid-Bilayer geschützt wird.
- Um die atteoliposome-Orientierung zu assay atsay, reservieren Sie mindestens 8 l frisch rekonstituierte Proteoliposomen.
- Fügen Sie 8 L Proteoliposomen und 1 l von 1 U/L Thrombin hinzu. Bei 37 °C für 1 h inkubieren.
- Die Protease mit 1 l von 5 mg/ml EDTA-freiem Protease-Hemmer-Cocktail abwürgen und 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Analysieren Sie die Probe nach SDS-PAGE und Coomassie Fleck. Der Anteil des gehässierten und uncleaved Proteins kann durch Densitometrie bestimmt werden.
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Representative Results
Die Effizienz der Atlastin-Rekonstitution ist in Abbildung 2dargestellt. Rekonstituierte Proteoliposomen wurden in einem diskontinuierlichen Ozorgradienten von Iohexol geflogen. Das nicht inkorporierte Protein wurde in der unteren Schicht (B) oder in der mittleren Schicht (M) sedimentiert. Rekonstituiertes Protein würde in die oberste Schicht (T) schweben. Proben des Gradienten wurden geerntet und von SDS-PAGE und Coomassie Färbung analysiert. Die Quantifizierung des Gels durch Densitometrie zeigt eine sehr hohe Effizienz der Rekonstitution mit vernachlässigbaren Verlusten; 96% des gesamten Proteins wurden als Proteoliposomen gefunden, die in die oberste Schicht (T) schwammen. Weniger als 1 % des Proteins war nicht rekonstituiert und fand sich in der mittleren Schicht (M), und nur 3 % waren nicht rekonstituiert oder aggregiert und in die untere Schicht (B) sedimentiert.
Neben der Beschreibung des Ausmaßes der Rekonstitution wurde die Analyse der Ausrichtung von Atlastin nach Rekonstitution durch Thrombinspaltungs-Assays14quantifiziert. Rekonstituiertes Protein könnte sich möglicherweise in der falschen Ausrichtung befänden, d. h. dem Lumenalraum des Liposoms zugewandt sind. Protein in der falschen Ausrichtung sollte durch die Lipid-Bilayer vor Proteolyse geschützt werden. Eine Thrombinspaltungsstelle ist zwischen dem Ende des N-Terminal GST-Tags und dem Beginn von Atlastin codiert. Floated Proteoliposomen wurden mit Thrombin für 1 h bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einer 30 min Inaktivierung mit EDTA-freiem Proteasehemmer. Die Proben wurden mit SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert und durch Densitometrie Quantifiziert Abbildung 3. Als Negativkontrolle wird in der linken Spur eine Probe unbehandelter Proteoliposomen angezeigt. Waschmittel-solubilisierte Proteoliposomen (rechte Spur) dienten als positiver Schutz und zeigten das Ausmaß der Thrombinspaltung, wobei nur 1% un-cleaved blieben. Insgesamt zeigt dieser Test, dass der größte Teil des rekonstituierten Proteins zerkpft war und nur 7% vor der Protease (mittlere Spur) geschützt waren. Es ist erwähnenswert, dass der Rest des ungeschnittenen Proteins das Ergebnis rekonstituierter Proteinaggregate sein kann, die möglicherweise nicht zugänglich sind. Insgesamt beschreiben diese Ergebnisse ein robustes System zur Rekonstituierung von Atlastin.
Die Kinetik und das Ausmaß der atlastinvermittelten proteoliposomfusion wurden durch Lipid-Mixing-Assays analysiert (Abbildung 1). Abbildung 4zeigt eine Probe der Atlastinfusionskinetik und Quantifizierung. Der vollständige kinetische Lauf ist in Abbildung 4Adargestellt. Eine 5 min Inkubation wurde durchgeführt, bevor die Fusion mit GTP zum Nullzeitpunkt induziert wurde und nach 1 h wurde n-Dodecyl-D-Maltoside hinzugefügt, um die Proteoliposomen zu lösen und die maximale FRET-Freisetzung zu erhalten. Das Fusionsmaximum betrug 11 % der maximalen Fluoreszenz (Abbildung 4B,C). Nicht induzierte (keine GTP)-Steuerelemente können verwendet werden, um die Hintergrundbasislinie zu bestimmen.
Abbildung 1: Fusions-Assay-Modell der Liposomenfusion. Eine Population von markierten Liposomen mit fluoreszierenden fluoreszierenden Spenderlipiden NBD-Phosphatidylethanolamin (als grüne Sphären dargestellt) und dem Akzeptor Rhodamin-Phosphatidylethanolamin (dargestellt als rote Kugeln) wird mit einem unbeschrifteten Pool von Liposomen. Vor der Fusion ist die Fluoreszenz von NBD aufgrund der Nähe zum Akzeptor Fluorophor, Rhodamine, gering. Bei der Fusion mit unbeschrifteten Liposomen führt eine Flächenvergrößerung zu einer Verdünnung der Sonden und eine FRET-Freisetzung von NBD kann gemessen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Rekonstitutionseffizienz, die durch Floatationstests analysiert wird. Die Rekonstitutionseffizienz von Atlastin kann durch Floatn von Proteoliposomen in einem diskontinuierlichen Iohexolgradienten gemessen werden. Rekonstituiertes Protein sollte als Proteoliposomen zur obersten Schicht (T) schweben, während nicht rekonstituiertes und aggregiertes Protein auf die untere Schicht (B) oder die mittlere Schicht (M) sedimentieren sollte. Ein Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel wurde durch Densitometrie quantifiziert und maß 96% des gesamten Proteins, das als Proteoliposomen mit vernachlässigbaren Verlusten (ca. 4 %) geflogen wurde.
Abbildung 3: Analyse des rekonstituierten Atlastins in Proteoliposomen durch Proteaseverdauung. Rekombinantes Atlastin hat ein N-Terminal GST-Tag gefolgt von einer Thrombin-Schnittsequenz. Proteoliposomen des rekombinanten Atlastins wurden mit dem Serinproteasethrombin behandelt, um die Ausrichtung des rekonstituierten Proteins in Bezug auf die Lipid-Bilayer zu analysieren. Nach der Thrombin-Behandlung wird die Protease gehemmt und die Proben werden mit SDS-PAGE, Coomassie-Färbung, analysiert und durch Densitometrie quantifiziert. Die vorgestellten Proteoliposomen haben einen geringen Anteil an geschütztem Protein, nur 4% blieben unverdaute (mittlere Spur). Als Positivkontrolle wurden einige Proteoliposomen mit Waschmittel (0,5% TX100) (rechte Spur) slubilisiert; die Negativkontrolle, unbehandelte Proteoliposomen, wurde nicht geklammert (linke Spur).
Abbildung 4: Lipid-Mischtests von Atlastin-Proteoliposomen. (A) Probe kinetische Spur der Fusionsreaktion mit einer Inkubationszeit von 5 min, bevor die Fusion mit GTP bei 0 min induziert wird. Nach 1 h Lauf wurde die Waschmittellöslichkeit (schwarzer Pfeil) verwendet, um die maximale FRET-Freisetzung von NBD zu bestimmen. (B) Zoomed in View of the trace from timepoint 0 to 1 h with and (C) average fusion (n = 3) von 11.3%. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die hier beschriebenen Methoden eine effiziente Methode zur Reinigung, Rekonstituierung und Messung der Fusionsaktivität von rekombinantem Atlastin. Um eine hohe Ausbeute an funktionellem Atlastin zu gewährleisten, müssen einige kritische Schritte in Betracht gezogen werden. Die Expression von Atlastin muss bei niedrigen Temperaturen (16 °C) erfolgen, um eine Aggregation zu vermeiden, und man sollte eine Endkonzentration zwischen 0,4 und 1,5 mg/ml anstreben. Sehr verdünntes Protein wird nicht optimal mit einem Protein-Lipid-Verhältnis von 1:400 rekonstituiert. Die Rekonstitutionseffizienz kann optional durch hier beschriebene Floatationstests analysiert werden (Abbildung 2). Einer der Vorteile von Liposomen Floatation Assays ist, dass sie erweitert werden können, um lösliche Proteine zu analysieren, die mit Lipid-Doppelschichten13assoziieren. Zusätzlich kann die Ausrichtung des rekonstituierten Proteins auch durch Proteaseverdauung14analysiert werden, dies kann jedoch nicht zwischen rekonstituiertem falsch gefaltetem oder aggregiertem Protein oder Rekonstitution in falscher Ausrichtung unterscheiden (Abbildung3 ). Die mit dieser Methode entwickelten Proteoliposomen können auf den Assay für die Fusion oder für Studien von Atlastin in einem Modell Lipid-Bilayer angewendet werden. Während das Rekonstitutionsverfahren relativ einfach ist, können kleine Abweichungen von optimalen Waschmittel- und Lipidkonzentrationen die Effizienz der Rekonstitution reduzieren. Zum Beispiel kann eine übermäßige Menge an Reinigungsmittel zu einer Liposomenlöslichkeit führen.
Lipid-Misch-Assays erfordern einen Pool von Spender- und Akzeptor-Liposomen (Abbildung 1). Diese Methode verwendet Radioaktivität durch tritiated Lipid für die Quantifizierung der Lipidkonzentration bei jedem Schritt. Jedoch, alternative Quantifizierungsmethoden wurden berichtet, mit der intrinsischen Fluoreszenz von Spender-Liposomen und Akzeptor-Liposomen mit Dansyl-Phosphoethanolamin15,16. Die Dimensionierung von Liposomen kann auch während der Extrusion modifiziert werden, da die Polycarbonat-Membranporengröße entsprechend angepasst werden kann.
Während Lipid-Misch-Assays eine effiziente Möglichkeit sind, die Fusion zu analysieren, kann es nicht zwischen Fusion und Hemifusion unterscheiden. Mehrere Studien zur Visualisierung von Atlastin-Proteoliposomen nach Derfusion durch Elektronenmikroskopie15 und durch Lipidfluoreszenz16,17 unterstützen die vollständige Fusion von Atlastin. Bei der Analyse spezifischer Atlastin-Mutationen oder anderer Fusionsproteine ist es jedoch von Interesse, eine vollständige Fusion zu gewährleisten. Zusätzliche Schritte, um dies zu beheben, könnte durch Abschrecken der äußeren Packungsbeilage mit Dithionit und Messung der inneren Packungsbeilage Lipidmischung erfolgen. Dazu können alternative Fusionsassays wie innenwässrige Inhaltsmischungen eingesetzt werden, jedoch sind zusätzliche Schritte und dialysehaltige Liposomen erforderlich.
Es ist von Interesse, dass diese Methode auf andere Membranproteine für In-vitro-Studien von Proteinen in Modelllipid-Doppelschichten angewendet werden kann. Andere Membranproteine wurden berichtet, mit dieser Methode zu rekonstituieren16,17. Diese Methode kann daher auf eine Vielzahl von Membran- und Fusionsproteinen angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Michael Stern und seinem Labor für ihre Erkenntnisse und Ihr Feedback zu atlastin bezogenen Projekten. Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] und dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke [R01NS102676] unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
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