Summary
Biologisk membran fusion katalyseres af specialiserede fusions proteiner. Måling af proteiner fusogenic egenskaber kan opnås ved lipid blanding assays. Vi præsenterer en metode til rensning af rekombinant Drosophila atlastin, et protein, der medierer homotypisk fusion af ER, og som danner det til præformerede Liposomer og test for fusions kapacitet.
Abstract
Membran fusion er en afgørende proces i den eukaryotiske celle. Specialiserede proteiner er nødvendige for at katalysere fusion. Atlastiner er endoplasmatiske reticulum (ER) hjemmehørende proteiner impliceret i homotypisk fusion af ER. Vi detalje her en metode til rensning af en glutathion S-transferase (GST) og poly-histidine mærkede Drosophila atlastin ved to runder af Affinity kromatografi. Undersøgelse af fusionsreaktioner in vitro kræver, at rensede fusions proteiner indsættes i et lipid-bilag. Liposomer er ideelle model membraner, som lipid sammensætning og størrelse kan justeres. Til dette formål beskriver vi en rekonstitutionsmetode ved fjernelse af vaskemiddel for Drosophila atlastin i præformerede Liposomer. Mens flere rekonstitueringsmetoder er tilgængelige, rekonstitution ved fjernelse af vaskemiddel har flere fordele, der gør det velegnet til atlastiner og andre lignende proteiner. Fordelen ved denne metode omfatter et højt rekonstitutionsudbytte og korrekt orientering af det rekonstituerede protein. Denne metode kan udvides til andre membran proteiner og til andre anvendelser, der kræver proteoliposomes. Derudover beskriver vi en FRET baseret lipid blanding assay af proteoliposomes anvendes som en måling af membran fusion.
Introduction
Membran fusion er en kritisk proces i mange biologiske reaktioner. Under biologiske forhold, membran fusion er ikke spontan og kræver specialiserede fusion proteiner til at katalysere sådanne reaktioner1. Er homotypisk membran fusion er medieret i dyr af dynamin relateret GTPase atlastin2. Atlastin rolle i homotypisk fusion er grundlæggende for tre-vejs vejkryds i perifer ER, som udgør et stort sammenkoblet netværk af tubuler, der strækker sig gennem hele cellen. Atlastins har en bevaret domæne morfologi bestående af en stor GTPase, en tre Helix Bundle midterste domæne, en hydrofobe membran anker, og en kort cytoplasmatiske C-Terminal hale3. In vitro undersøgelser med rekombinant Drosophila atlastin har vist, at når de er rekonstitueret til Liposomer, det bevarer sin fusogenic egenskaber. Andre atlastiner, herunder humane homologer har ikke været i stand til at rekapitulere fusion in vitro. Vi beskriver her en metode til rensning af en GST og poly-histidin Tagged rekombinant Drosophila atlastin, rekonstituerer det til Liposomer, og metaloid fusion.
Undersøgelse membran fusion in vitro udgør en udfordring som fusogenic proteiner normalt har et membran anker. For at studere dem, er det nødvendigt at rekonstruere dem i model lipid bilag. Store unilamellære vesikler (LUV) er et nyttigt redskab til at studere lipid protein interaktioner. Vi præsenterer her et system til at gøre LUVs af forskellige lipid kompositioner for protein rekonstitution og fusion assays. Rekonstitution af Integral proteiner til LUVs kan opnås ved en række forskellige metoder, herunder organisk opløsningsmiddel-medieret rekonstitution, mekaniske mekanismer eller opvaskemiddel assisteret rekonstitution4. Vi præsenterer her en metode til rekonstituering Drosophila atlastin i præformerede Liposomer ved fjernelse af vaskemiddel. Fordelene ved denne rekonstitutionsmetode omfatter høje rekonstitutionsudbytter og korrekt orientering af atlastin i lipid-bilaget. Desuden, gennem denne metode, proteinet er ikke tørret eller udsættes for organiske opløsningsmidler derved opretholde struktur og funktion. Blandt ulemperne kan tilstedeværelsen af vaskemidler ikke være ideelle for alle proteiner, og de endelige proteoliposomer kan have nogle indbyggede vaskemiddel i lipid-bilaget. Yderligere dialyse kan anvendes til at fjerne mere af vaskemidlet. Dialyse kan dog tage lang tid og kan derfor føre til tab af protein aktivitet.
Vurdering af atlastin fusion aktivitet kan bestemmes ved lipid blanding analyser som tidligere beskrevet2. Her afgrænser vi en metode til måling af atlastin medieret fusion gennem N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamin rhodamine-B Methylsulfonylmethan (rhodamine) mærket lipider. Denne analyse kræver fusion af donor (mærket) proteoliposomes og lønarbejdstageren (ikke-mærkede) proteoliposomes. En FRET frigivelse kan måles under reaktionen som fortynding af et donor-acceptor par fra "mærket" Liposomer til "umærkede" Liposomer som følge af lipid blanding under membran fusion (figur 1)5. Mens denne analyse tjener som en proxy for membran fusion, er den begrænset til at skelne mellem membran fusion og hemifusion, en tilstand, hvor kun de ydre foldere blandes. For at løse dette problem, et alternativ er den ydre folder dæmper af NBD af dithionit. Efter den samme metode som NBD/rhodamin lipid blanding assays, ved slukning af den ydre indlægsseddel enhver NBD FRET frigivelse ved fusion vil være på grund af indre folder blanding8.
Alternative fusion analyser af indre vandige indhold blanding adresse fuld fusion kun5. Eksempler på dette er terbium (TB)/dipicolinic Acid (DPA) analyser og Aminonaphthalen trisulfonsyre (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) bromid (DPX)-analyser. I TB/DPA assays, en pulje af Liposomer med indkapslet TB er blandet og fusioneret med Liposomer med indkapslet DPA; ved fusion øges fluorescens via intern energioverførsel fra DPA til TB inden for [TB (DPA)3]3- cheleringkompleks6. I modsætning hertil slukkes ANTS-fluorescens for ANTS/DPX-assays af DPX7. Mens disse systemer adresse indre indhold blanding, mere dybtgående forberedelse af Liposomer er nødvendig for fjernelse af ikke-indkapslede reagenser, samt utilsigtet interaktion af fluorophores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. rensning af GST-DAtl-His8
-
Forberedelse af protein udtryk og lysat
- Transformer BL21 (DE3) E. coli med GST-datl-His8-konstruktionen i PGEX4-T32 , og vælg på en ampicillin plade.
- Vælg en enkelt transformerende og inokulere 5 mL LB + ampicillin (5 μL 100 mg/mL ampicillin) i et 14 mL dyrkningsglas og inkube ved 25 °C med omrystning ved 200 rpm for 6-8 h.
Bemærk: På grund af utætte udtryk, anbefales det ikke at inkuere ved højere temperaturer. Vækst ved 25 °C reducerer sammenlægning af protein i denne vækstperiode. - Der inokuleres 200 mL LB + ampicillin med 1 mL af 5 mL-kulturen, og der inkueres natten over (~ 15 – 18 timer) ved 25 °C.
- Næste morgen høstes cellerne ved centrifugering (2.000 x g i 10 min) og resuspension i 5 ml lb.
- Inokulere 4 L LB + ampicillin og mål OD600 (0,05 – 0,15). Der inkurueres ved 25 °C med rystelser.
Bemærk: Reserver nogle medier til at tjene som en blank for OD600 målinger før du tilføjer bakterier. - Mål OD600 hver time, indtil den når en OD mellem 0,4 – 0,5. På dette tidspunkt, reducere temperaturen til 16 °C.
- Inducerer med 0,2 mM IPTG (800 μL af 1 M lager), 10 min. efter at inkubatoren når 16 °C. Der inkurueres natten over (~ 15 – 18 timer) ved 16 °C.
Bemærk: Den lavere temperatur forbedrer udbyttet af funktionelt protein ved at reducere aggregering af atlastin. - Næste morgen høstes cellerne ved centrifugering ved 7.500 x g ved 4 °c.
- Cellerne resuspenderes i 200 mL A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) og 200 mM KCl).
- Cellerne centrifugeres ved 11.000 x g i 5 min ved 4 °c.
- Resuspension af pellet i 40 mL brud buffer (A200 plus 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mM imidazol, og en EDTA-fri proteasehæmmer cocktail Tablet).
Bemærk: Tilføj TX-100 efter resuspension for at undgå generering af bobler og skum. - Passere gennem en 18 G nål og køre cellerne gennem en celleforstyrrende tre gange på ~ 10.000 PSI.
- Ekstraktet centrifugeres ved 125.000 x g i 1 time.
Bemærk: Eventuelt opløse pellet 1:2 (w:v) i 8 M urea og nutate ved stuetemperatur natten. Urinstof som denatureringsmiddel vil langsomt opløse ethvert uopløseligt pelleteret protein til SDS-Page analyse. Spar 1 μL til SDS-PAGE og Coomassie plet analyse. - Filtrer ekstraktet gennem et 0,45 μm cellulosenitrat sterilt membranfilter for at fjerne bakterier og store bakterie rester.
Bemærk: du kan også gemme 1 μL til SDS PAGE og Coomassie plet analyse.
-
Protein rensning ved affinitet kromatografi
- Det filtrerede lysat indlæses på en immobiliseret metalaffinitet kromatografi (IMAC) harpiks kolonne, der er påladet med ni2 +, præ-ækvilibreret med lav imidazol-buffer (A100 plus 10% glycerol, 2 mm 2-mercaptoethanol, 1% TX-100, 40 mm imidazol) med en hastighed på 1 ml/ min. ved 4 °C.
- Kolonnen vaskes med 25 mL A100 plus 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazol med en hastighed på 1 mL/min ved 4 °C. Proteinet elueret med en 30 mL lineær gradient af imidazol fra 40 mM til 500 mM og en endelig 5 mL vask ved 500 mM.
- Der samles spids fraktioner, og der inkube i 1 time ved 4 °C med hævede GSH-Agopstået perler, tidligere opsvulmet i vand og ækvilibreret i A100 med 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 og 1 mM EDTA.
Bemærk: GSH-Agrose perler kan være hævede i 50 mL vand dagen før og inkuperet natten ved 4 °C, eller i 1 time ved RT. For at fjerne vand-og ækvilibrerings buffer skal der centrifugeres i en sving skovl rotor ved 500 x g i 1 min. uden bremse. Supernatanten aspirerer med en 26 G kanyle. - Pellet GSH-Agopstået perler ved centrifugering i en svingende skovl rotor ved 500 x g uden bremse og fjern lysatet supernatanten ved aspiration med en 26 g nål.
- Perlerne overføres til en 10 mL polyprep-kolonne, og der vaskes fem gange med 5 mL ækvilibrerings buffer (A100 med 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 og 1 mM EDTA) ved centrifugering ved 500 X g.
- Proteinet elueres med 1 – 1,5 mL ækvilibrerings buffer suppleret med 10 mM reduceret glutathion. Alikvoteret protein og flash fryse i flydende nitrogen. Protein kan opbevares ved-80 °C på ubestemt tid.
Bemærk: Juster pH-værdien af elutions bufferen til 7,4. - Kvantificere proteinkoncentrationen af Amido sort protein assay9 og vurdere renhed ved SDS-side og Coomassie farvning.
2. rekonstitution af rekombinant Atlastin til Liposomer
- Liposome produktion ved ekstrudering metode 10 stk.
- Lav lipid mix bestande i chloroform (10 mM total lipid). De nødvendige lipider er 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-foshocholine (POPC), 1, 2-dioleoyl-SN-glycero-3-fosho-L-Serin (DOPS), 1, 2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(7-Nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) og 1, 2- dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(lissamin rhodamin B sulfonyl) (RH-dppe). Acceptor Liposomer består af POPC: DOPS (85:15 molær ratio) og donor Liposomer af POPC: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molær ratio).
Bemærk: Mens POPC: DOPS lipid blandinger har været traditionelt anvendes til in vitro lipid blanding assays, alternative lipid kompositioner kan tilpasses til forskellige eksperimentelle formål. POPC: DOPS Liposomer er meget stabile og sværere at smelte, derfor er et meget stramt system til fusion. - Tilsæt 1 μCi/mL L-α-dipalmitoyl-phosphatidylcholin (cholin methyl-3H) til lipid blandinger for at bestemme lipid koncentrationer på senere trin af flydende scintilllation optælling. Reserver mindst 8 μL af denne bestand.
- Overfør den ønskede mængde lipid-blandinger til glasset med flintglas.
- Lipid-blandingerne tørres under en blid strøm af N2 -gas i ~ 10 minutter, indtil der ikke længere er nogen chloroform synlig.
- Lipidfilmen tørres yderligere i en Ekssikator ved støvsugning i 30 min.
- Der tilsættes nok vandig A100 med 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol og 1 mM EDTA til lipid-filmen og bringe koncentrationen tilbage til 10 mM. Genopslæmning af lipid-filmen ved at vortexning let i 15 minutter ved stuetemperatur. En vortexer, der kan rumme glasset glas rør anbefales.
- Freeze-optøning af hydrerede lipider i flydende nitrogen ti gange. Efter frysning i flydende nitrogen, optøes Liposomer ved at lade opløsningen sidde ved stuetemperatur i 30 s, derefter overføres til vand for hurtigere optøning. Denne frost-tø cykling vil minimere multilamellære vesikler.
Forsigtig: Rør kan revne, hvis de indeholder mængder større end 0,5 mL, og hvis de overføres direkte form flydende kvælstof til vand. - Overfør lipid gennem polycarbonat filtre med 100 nm porestørrelse 19 gange ved hjælp af mini-ekstruder.
- Bestemmelse af den totale lipid koncentration af Liposomer ved scintilllation tælling
Bemærk: Nogle af lipid kan efterlades i glas rør og i mini-ekstruder.- Der tilsættes 4 μL lipidbestand og Liposomer i 3 mL scintillationscocktail.
- Mål gennemsnitligt antal pr. minut (CPMA) for lager og Liposomer. Og Beregn Liposomer koncentration med følgende formel:
- Liposomerne opbevares ved 4 °C i op til en uge. Længere opbevaring anbefales ikke som Liposomer kan aggregeres med tiden, faldende rekonstitution effektivitetsgevinster.
- Lav lipid mix bestande i chloroform (10 mM total lipid). De nødvendige lipider er 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-foshocholine (POPC), 1, 2-dioleoyl-SN-glycero-3-fosho-L-Serin (DOPS), 1, 2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(7-Nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) og 1, 2- dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(lissamin rhodamin B sulfonyl) (RH-dppe). Acceptor Liposomer består af POPC: DOPS (85:15 molær ratio) og donor Liposomer af POPC: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molær ratio).
- Rekonstitution ved hjælp af opvaskemiddel assisteret inkorporering i præformerede Liposomer
- Beregn mængden af buffer, protein, Liposomer og ekstra vaskemiddel, der skal blandes sammen:
- Bestem den ønskede totale lydstyrke. Denne mængde består af buffer A100 med 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol og 1 mM EDTA. Volumener mindre end 250 μL blandes ikke godt i 0,5 mL mikrocentrifugerings glas.
- Beregn den mængde Liposomer, der er nødvendig for at give en endelig lipid koncentration på ca. 1 mM. Fratræk lydstyrken fra buffer enheden.
- Beregn mængden af protein, der er nødvendig for at give det ønskede protein til lipid molært forhold (normalt 1:400). Reducer buffer lydstyrken tilsvarende.
- Bestem hvor meget ekstra vaskemiddel der skal tilsættes for at mægle Liposomer, der sigter mod en effektiv vaskemiddel til lipid ratio (REFF) mellem 0.64 – 0,8. Husk at overveje det vaskemiddel, der tilsættes med proteinet. (REFF) bestemmes
af ligningen DTotal er den totale vaskemiddel koncentration, og Dvand er den monomerisk VASKEMIDDEL koncentration (0,18 mm for TX-100 og anapoe X-100 ved tilstedeværelse af vaskemiddel)4 11. der er
- Bland løsningerne sammen i et 0,5 mL rør i følgende rækkefølge: buffer, vaskemiddel, protein og Liposomer. Tilsæt Liposomer hurtigt og vortex straks for 5 s at homogenisere blandingen.
- Reaktionen inkubieres i en nutator i 1 time ved 4 °C.
- Lav 0,2 g/mL nonpolær polystyren adsorbent perle "gylle" i vand.
Bemærk: Gør polystyren adsorbent perle "gylle" under tidligere 1 h inkubation i trin 2.2.3. - Der afvejes 0,2 g polystyren adsorbent perler og overføres til et mikrocentrifuge glas.
- Degas perlerne ved at tilføje 1 mL methanol til røret og bland i 1 min. afgassede perler vil synke.
- Aspirer methanol og tilsæt vand til perlerne. Lad perlerne blandes med vand i 5 min., derefter Aspirer vandet. Gentag fire gange, og Bring derefter polystyren adsorbent perle "gylle" til 1 mL volumen med vand og en endelig koncentration på 0,2 g/mL.
Bemærk: Perler bør stadig slå sig ned til bunden af røret. Hvis de ikke gør det, Degas igen. Brug en 21 G eller højere nål til at aspirering methanol og vand fra perler. - Beregn mængden af polystyren adsorbent perler, der er nødvendige for at absorbere hele vaskemidlet i hver prøve. 1 g polystyren adsorbent perler absorberer 70 mg TX-100. Til beregning af mængden af polystyren adsorbent perle gylle, der er nødvendig for hver reaktion, divideres det totale vaskemiddel i reaktionen (trin 2.2.1.4) med 70 mg og derefter ved koncentrationen af perlen gylle (0,2 g/mL (trin 2.2.7).
- Overfør beregnet mængde polystyren adsorbent perle gylle til et 0,5 mL rør og Aspirer vandet.
Bemærk: Skær enden af en 20 – 200 μL spids til at overføre perlerne, vortex røret lige før pipettering for at gensuspendere afgjort perler. - Prøverne tilsættes til 0,5 mL-røret indeholdende polystyren adsorbent perler, og prøven inkuberes i 1 time ved 4 °C.
- Gentag to gange efterlader gamle perler bag og overføre prøven til friske perler.
- Prøven tilsættes til et fjerde rør med friske perler, og der inkubeeres natten over (~ 15 – 18 timer) ved 4 °C.
- Beregn mængden af buffer, protein, Liposomer og ekstra vaskemiddel, der skal blandes sammen:
- Om morgenen udtages prøven fra polystyren adsorbent perler og pellet uopløselige protein aggregater ved centrifugering i 10 min ved 16.000 x g ved 4 °c.
- Supernatanten genoprettes, og den endelige lipid-koncentration bestemmes ved flydende scintillationstælling (Se trin 2.1.9.2). Eventuelt kan proteinkoncentrationen bestemmes ved Amido Black protein assay9.
Bemærk: For atlastin proteoliposomes bør enzymatiske analyser udføres med friske Liposomer. Lang opbevaring ved 4 °C eller frysning fører til betydelige tab i atlastin aktivitet.
af ligningen DTotal er den totale vaskemiddel koncentration, og Dvand er den monomerisk VASKEMIDDEL koncentration (0,18 mm for TX-100 og anapoe X-100 ved tilstedeværelse af vaskemiddel)4 11. der er3. lipid blanding assays
- Donor og lønarbejdstageren proteoliposomes bringes i en koncentration på 0,15 mm hver i A100 med 10% glycerol, 2 mm β-mercaptoethanol, 1 mm EDTA og 5 mm mgcl2. Hver reaktion (50 μL) skal tilsættes til en brønd i en flad hvid 96 brønd plade, der egner sig til fluorescens aflæsninger. Forbered mindst 4 reaktioner, herunder en triplicat, og en no-GTP negativ kontrol.
- Anbring pladen i en forvarmet plade læser ved 37 °C. Mål NBD fluorescens (excitation 460 nm og emission 535 nm) i 5 min hver min.
- Inducerer fusion ved tilsætning af 5 mM GTP (5 μL 50 mM GTP).
- Mål NBD fluorescens hvert minut i 1 time.
- Der tilsættes 5 μL 2,5% w/v n-dodecyl β-D-maltosid for at opløse proteoliposomerne og måle den maksimale NBD-fluorescens. Læs NBD-fluorescens i 15 min. hver min.
4. liposome floatation på Iohexol diskontinuerlig gradient12
- valgfri Analysér effektiviteten af rekonstitution ved floatationsassays13.
- Forbered en 80% og en 30% w/v Iohexol i A100 med 10% glycerol, 2 mM 2-mercaptoethanol og 1 mM EDTA. Iohexol opløses ikke let, så dette skal tilberedes en dag før ved at nutating natten over ved 4 °C.
- Bland 150 μL af 80% iohexolbestanden grundigt med 150 μL proteoliposomes-prøve for at bringe den til en 40% Iohexol. Tilsæt dette til en 5 x 41 mm2 ultra-Clear tube undgå bobler.
- Lag 250 μL af 30% Iohexol bestand langsomt på toppen af prøven for at gøre et mellemlag. Undgå bobler og forstyrre det nederste lag. Oven på midterlaget tilsættes langsomt 50 μL A100 med 2 mM 2-mercaptoethanol og 1 mM EDTA.
- Der centrifugeres gradient i en sving skovl rotor ved 220.000 x g i 4 timer ved 4 °c med langsom acceleration og ingen afbrydelse.
- Høst lag af gradienten og analysere ved SDS-PAGE og Coomassie pletter, kvantificering kan gøres ved densitometri. Rekonstitueret protein skal flyde til det øverste lag, mens protein og lipid aggregater vil sediment i bunden eller i det midterste lag.
5. analyse af det rekonstituerede proteins orientering ved thrombin proteolyse
Bemærk: Den her rapporterede atlastin konstruktion har et Trombin cut-sted mellem enden af N-terminalens GST-tag og begyndelsen af atlastin. Atlastin i den korrekte orientering vil have denne cut site tilgængelig for protease, mens protein i den forkerte retning vil blive beskyttet af lipid bilayer.
- Til analyse af atlastin proteoliponovis orientering skal der reserveres mindst 8 μL frisk rekonstitueret proteoliposomes.
- Der tilsættes 8 μL proteoliposomer og 1 μL 1 U/μL thrombin. Der inkubeeres ved 37 °C i 1 time.
- Proteasen slukkes med 1 μL 5 mg/mL EDTA-fri proteasehæmmer cocktail og inkueres i 30 min ved 37 °C.
- Analysér prøven ved SDS-PAGE og Coomassie pletten. Andelen af kløvet og ukløvet protein kan bestemmes ved densitometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten af atlastin rekonstitution er præsenteret i figur 2. Rekonstituerede proteoliposomer blev fremstillet i en diskontinuerlig gradient med Iohexol. Uindarbejdet protein blev sedimenteret i det nederste lag (B) eller i det midterste lag (M). Rekonstitueret protein ville flyde til det øverste lag (T). Prøver af gradienten blev høstet og analyseret af SDS-PAGE og Coomassie farvning. Kvantificeringen af gelen ved densitometri viser en meget høj virkningsgrad ved rekonstitution med ubetydelig taber; 96% af det totale protein blev fundet som proteoliposomer, der flåede til det øverste lag (T). Mindre end 1% af proteinet blev ikke rekonstitueret og fundet i mellemlag (M), og kun 3% var urekonstitueret eller aggregeret og sedimenteret til det nederste lag (B).
Ud over at beskrive omfanget af rekonstitution, analyseres orienteringen af atlastin efter rekonstitution blev kvantificeret ved thrombin spaltning analyser14. Rekonstitueret protein kan potentielt være i den forkerte retning, der er, vender det lumenale rum af liposome. Protein i den forkerte retning bør beskyttes mod proteolyse af lipid-bilaget. Et thrombin spaltnings sted er kodet mellem enden af N-terminalens GST-tag og begyndelsen af atlastin. Flåede proteoliposomer blev inkueret med thrombin i 1 time ved 37 °C, efterfulgt af en 30 min inaktivering med EDTA-fri proteasehæmmer. Prøverne blev analyseret af SDS-PAGE og Coomassie pletten og kvantificeret ved densitometri figur 3. Som negativ kontrol vises en prøve af ubehandlede proteoliposomer i venstre vejbane. Vaskemiddel opløselig proteoliposomes (højre Lane) tjente som en positiv kontrol og for at vise omfanget af thrombin spaltning, med kun 1% venstre un-kløvet. I alt, denne analyse viser, at de fleste af de rekonstituerede protein blev kløvet med kun 7% er beskyttet mod proteasehæmmere (midterste Lane). Det er værd at bemærke, at resten af ubeskåret protein kan være et resultat af rekonstituerede protein aggregater, der måske ikke har skåret site tilgængelig. Disse resultater beskriver i alt et robust system til rekonstituering af atlastin.
Kinetikken og omfanget af atlastin-medieret proteoliponofusion blev analyseret ved lipid blanding analyser (figur 1). En prøve af atlastin fusions kinetik og kvantificering er vist i figur 4. Det fulde kinetiske løb er afbildet i figur 4a. En 5 min inkubation blev gjort før inducerende fusion med GTP på nul-tidspunktet og efter 1 time, n-dodecyl β-D-maltoside blev tilføjet til solubilize proteoliposomer og få den maksimale FRET frigivelse. Det maksimale fusions maksimum i løbet var på 11% af den maksimale fluorescens (figur 4B, C). Ikke-inducerede (ingen GTP) kontrolelementer kan bruges til at bestemme baggrunds grundlinjen.
Figur 1: fusion assay model af Liposom fusion. En population af mærkede Liposomer med optælling Tagged fluorescerende donor lipider NBD-phosphatidylethanolamin (repræsenteret som grønne kugler) og acceptoren rhodamine-phosphatidylethanolamin (repræsenteret som røde kugler) blandes med en umærket puljen af Liposomer. Før fusion, NBD'S Fluorescens er lav på grund af nærhed med acceptoren fluorophore, rhodamine. Ved fusion med umærkede Liposomer fører en stigning i overfladearealet til fortynding af proberne, og en FRET-frigivelse af NBD kan måles. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: rekonstitution effektivitet analyseret ved floatation assays. Den rekonstituerede effektivitet af atlastin kan måles ved floatation af proteoliposomer i en diskontinuerlig gradient med Iohexol. Rekonstitueret protein skal flyde som proteoliposomes til det øverste lag (T), mens urekonstitueret og aggregeret protein skal sediment til det nederste lag (B) eller det midterste lag (M). En Coomassie-plettet SDS-side gel blev kvantificeret ved densitometri og målte 96% af det totale protein, der blev flænset som proteoliposomer med ubetydelig taber (~ 4%).
Figur 3: analyse af rekonstitueret atlastin i proteoliposomes ved proteasefordøjelse. Rekombinant atlastin har en N-terminal GST-tag efterfulgt af en Trombin cut sekvens. Proteoliposomer af rekombinant atlastin blev behandlet med Serin proteasethrombin for at analysere orienteringen af det rekonstituerede protein i forhold til lipid-bilaget. Efter trombinbehandling hæmmes proteasen, og prøverne analyseres af SDS-PAGE, Coomassie Stain og kvantificeres ved densitometri. De præsenterede proteoliposomes har en lav andel af beskyttet protein, med kun 4%, der forblev ufordøjet (midterste Lane). Som en positiv kontrol blev nogle proteoliposomer opløst med vaskemiddel (0,5% TX100) (højre vognbane); den negative kontrol, ubehandlet proteoliposomes, blev ikke kløvet (venstre Lane).
Figur 4: lipid blanding analyser af atlastin proteoliposomes. A) prøvens kinetiske spor af fusionsreaktion med en 5 min inkubationstid før inducerende fusion med GTP ved 0 min. Efter 1 h løb, vaskemiddel solubilisering (sort pil) blev brugt til at bestemme den maksimale fret frigivelse af NBD. (B) zoomet i betragtning af spor fra tidspunkt 0 til 1 h med og (c) gennemsnitlig fusion (n = 3) af 11,3%. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderne her afgrænser en effektiv metode til at rense, rekonstituere og måle fusion aktivitet af rekombinant atlastin. For at sikre høje udbytter af funktionel atlastin nogle kritiske skridt skal overvejes. Ekspression skal ske ved lave temperaturer (16 °C) for at undgå sammenlægning, og man bør tilstræbe en endelig koncentration på mellem 0,4 – 1,5 mg/mL. Meget fortyndet protein vil ikke blive rekonstitueret optimalt ved et 1:400 protein til lipid ratio. Rekonstitution effektivitet kan eventuelt analyseres ved floatation analyser beskrevet her (figur 2). En af fordelene ved Liposomer floatation analyser er, at de kan udvides til at analysere opløselige proteiner, der forbinder med lipid bilag13. Derudover kan orientering af det rekonstituerede protein også analyseres ved proteasefordøjelse14, men dette kan ikke skelne mellem rekonstitueret, falset eller aggregeret protein eller rekonstituering i den forkerte retning (figur 3 ). De proteoliposomer udviklet ved denne metode kan anvendes til analyse for fusion eller for undersøgelser af atlastin i en model lipid bilag. Mens rekonstitution procedure er relativt enkel, små afvigelser fra optimale vaskemiddel og lipid koncentrationer kan reducere effektiviteten af rekonstitution. For eksempel kan en overdreven mængde af vaskemiddel føre til Liposom solubilization.
Lipid blanding analyser kræver en pulje af donor og lønarbejdstageren Liposomer (figur 1). Denne metode bruger radioaktivitet ved indtaget lipid til kvantificering af lipid koncentration ved hvert trin. Der er imidlertid indberettet alternative kvantificeringsmetoder ved hjælp af den iboende fluorescens af donor Liposomer og lønarbejdstageren Liposomer med dansyl-fosfoethanolamin15,16. Dimensionering af Liposomer kan også ændres under ekstrudering, da polycarbonat membran porestørrelse kan justeres i overensstemmelse hermed.
Mens lipid blanding analyser er en effektiv måde at analysere fusion, kan det ikke skelne mellem fusion og hemifusion. Flere undersøgelser visualiserer atlastin proteoliposomes efter fusion ved elektronmikroskopi15 og ved lipid fluorescens16,17 yderligere støtte fuld fusion af atlastin. Men ved analyse af specifikke atlastin mutanter eller andre fusions proteiner er det af interesse at sikre fuld fusion. Yderligere trin til at foretage fejlfinding af dette kan gøres ved at slukke den ydre indlægsseddel med dithionit og måle den indvendige lipidblanding af indlægssedlen. Alternative fusion assays, såsom indre vandige indhold blanding kan anvendes til dette, dog, yderligere trin og dialyse af Liposomer vil være nødvendigt.
Det er interessant, at denne metode kan anvendes på andre membran proteiner til in vitro-undersøgelser af proteiner i model lipid bilag. Andre membran proteiner er blevet rapporteret til at rekonstruere med denne metode16,17. Denne metode kan derfor anvendes på en række forskellige membran-og fusions proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Michael Stern og hans laboratorium for deres indsigt og feedback på atlastin relaterede projekter. Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] og National Institute of neurologiske lidelser og Stroke [R01NS102676].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
