Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Geïntegreerde cel manipulatie platform in combinatie met de single-probe voor massaspectrometrie analyse van drugs en metabolieten in enkele schorsing cellen

Published: June 21, 2019 doi: 10.3791/59875
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma

Summary

Een geïntegreerde cel manipulatie platform is ontwikkeld voor gebruik in combinatie met een single-probe massaspectrometrie Setup voor de on-line analyse van individuele schorsing cellen onder omgevingsomstandigheden.

Abstract

Single cell massaspectrometrie (SCMS) maakt gevoelige detectie en nauwkeurige analyse van de brede waaiers van cellulaire soorten op de individuele-cel niveau. De single-Probe, een Microscale bemonstering en ionisatie-apparaat, kan worden gekoppeld aan een massaspectrometer voor on-line, snelle SCMS analyse van cellulaire bestanddelen onder omgevingsomstandigheden. Voorheen werd de single-probe SCMS techniek voornamelijk gebruikt voor het meten van cellen immobiled op een substraat, het beperken van de soorten cellen voor studies. In de huidige studie, de single-probe SCMS technologie is geïntegreerd met een cel manipulatie systeem, meestal gebruikt voor in vitro fertilisatie. Deze geïntegreerde cel manipulatie en analyse platform maakt gebruik van een cel-selectie sonde vast te leggen geïdentificeerde individuele zwevende cellen en de overdracht van de cellen naar de single-probe tip voor Microscale lysis, gevolgd door onmiddellijke massaspectrometrie analyse. Deze Capture and transferproces verwijdert de cellen uit de omliggende oplossing voorafgaand aan de analyse, het minimaliseren van de invoering van matrix moleculen in de massaspectrometrie analyse. Deze geïntegreerde opstelling is in staat om SCMS analyse van gerichte patiënt-geïsoleerde cellen aanwezig in lichaamsvloeistoffen monsters (bijvoorbeeld urine, bloed, speeksel, enz.), waardoor potentiële toepassingen van SCMS analyse aan de menselijke geneeskunde en de ziekte biologie.

Introduction

De menselijke biologie, in het bijzonder ziekte biologie, wordt meer en meer begrepen om het resultaat van activiteiten op het niveau van individuele cellen te zijn, maar de traditionele analytische methodes, zoals vloeibare chromatografie massaspectrometrie (LCMS), worden over het algemeen gebruikt om te analyseren monsters bereid uit populaties van cellen, terwijl de verkregen moleculaire informatie niet nauwkeurig kan vertegenwoordigen de chemische processen op de individuele-cel niveau. Deze standaard, traditionele methoden zijn niet in staat om de effecten van cellulaire heterogeniteit te onderscheiden op een analytische meting, en het proces van het vernietigen en mengen van de cellen om de lysate voor te bereiden mogelijk leidt tot de wijziging of het verlies van cellulaire componenten1,2. Deze beperkingen van traditionele methodes zijn vooral belangrijk in de analyse van patiënt cellen, waarin de verkregen steekproeven een complex mengsel van vele verschillende cel types kunnen bevatten. Om deze tekortkomingen te overwinnen, worden de enkelvoudige moleculaire analysemethoden, met inbegrip van SCMS-methoden (single cell Mass spectrometrie), in toenemende mate ontwikkeld en toegepast op bioanalyse, met name van cellulaire metabolieten en laag moleculair gewicht biomoleculen3,4.

De eerste SCMS technieken ontwikkelden gebruikte vacuüm-gebaseerde technieken om de analyses uit te voeren onder niet-omgevingsomstandigheden2,5,6,7,8,9, 10,11. Niet-Ambient SCMS technieken zijn in staat de analyse van cellulaire lipiden en metabolieten, maar vereisen monster voor behandeling onder kunstmatige omstandigheden, en daarom zijn niet geschikt voor real-time analyse. Het monster bereidingsproces voor niet-Ambient analyse omvat de toevoeging van matrix componenten, en deze voorbereiding kan veranderen cellulaire componenten uit hun natuurlijke omgeving12. Daarom, ambient massaspectrometrie (MS) technieken, die niet nodig een vacuüm voor de bemonstering omgeving, worden gebruikt om cellen te analyseren in een bijna-native omgeving. Het niet hebben van een vacuüm milieu staat voor veelzijdigheid in het experimentele ontwerp toe; de camera's kunnen worden toegevoegd om het cellulaire proces te controleren en de zachtere ionisatie technieken kunnen met scheidingstechnieken worden gecombineerd om betere informatie van elk enig-cel experiment4,12,13 te ontvangen ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.

De single-probe SCMS methode is een ambient techniek die live analyseert, zoogdier kankercellen lijnen in een bijna-native omgeving21,43,44,45,46. Bovendien is de single-probe-apparaat is gebruikt voor andere massaspectrometrie toepassingen, met inbegrip van analyse van extracellulaire moleculen in multicellulaire sferoïden en MS Imaging van weefsels47,48,49 ,50,51,52. Nochtans, aangezien de cel immobilisatie op substraten voor deze methode wordt vereist, kunnen de opschortings cellen niet direct worden geanalyseerdgebruikend deze techniek53. Daarom kan de single-probe SCMS systeem niet direct worden gebruikt om niet-klevende enkele cellen, zoals niet-klevende cel lijnen of schorsing cellen geïsoleerd van het bloed van een patiënt of andere lichaamsvloeistoffen54te proeven. In dit werk, een geïntegreerde Cell manipulatie platform (ICMP) is gekoppeld aan de single-probe SCMS techniek om live te analyseren, schorsing cellen on-line met minimale monstervoorbereiding (Figuur 1)46. De ICMP bestaat uit een omgekeerde Microscoop om cel selectie, een glas cel-selectie sonde, een microinjector om individuele zwevende cellen vast te leggen, een verwarmde plaat te handhaven cellulaire temperatuur, twee cellen manipulatiesystemen te controleren ruimtelijke bewegingen van zowel de glas cel-selectie sonde en single-Probe, en een digitale microscoop om cel overdracht van de cel-selectie sonde Tip observeren om de single-probe tip. De fabricage van de single-probe is gedetailleerd in eerdere publicaties en zal niet worden aangepakt hier21,48. Het ICMP/single-probe systeem wordt gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometer. Deze geïntegreerde opstelling zorgt voor de bemonstering van geïdentificeerde enkelvoudige cellen van complexe biologische monsters met minimale effecten van matrix moleculen.

Protocol

1. glas cel-selectie probe fabricage

  1. Zet single-boring glasbuis in een taps toelopende sonde met een scherpe tip.
    1. Plaats een enkele boring glazen buis (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) in de klemmen van een verticale pipet houder, het centreren van het glas met betrekking tot de verwarming spoel en draai aan de buis op zijn plaats te beveiligen. De verwarming Coil bestaat uit een 18-gauge nikkel-chroom weerstand draad (~ 60 mm in lengte) opgerold rond een metalen staaf (diameter = 3,90 mm) 2,5 keer.
    2. Stel de glazen buis met temperatuur programma 19,5 (fabrikant eenheid). Deze parameter kan voor een bepaald instrument worden gewijzigd.
    3. Stel de solenoïde plunjer op 4 (fabrikant Unit). Deze parameter kan voor een bepaald instrument worden gewijzigd.
    4. Trigger de solenoïde om de glazen buis te trekken. Deze stap maakt twee sondes gesmolten op de tip.
    5. Gebruik een pincet te snijden ~ 1 mm uit de buurt van het puntje van elke sonde, het creëren van een opening van ~ 10 µm in diameter op de sonde tip.
  2. Buig de glazen sonde voor eenvoudige koppeling aan de ICMP/single-probe SCMS Setup.
    1. Stel een getrokken glazen sonde in de microforge, de positionering van de Tip ~ 3 mm boven de platina verwarming draad.
    2. Zet de warmte op de platinadraad tot 30% van de maximale temperatuur.
    3. Buig de sonde ~ 45 ° vanaf de oorspronkelijke positie (Figuur 2).

2. geïntegreerde cel manipulatie platform assemblage

  1. Plaats de omgekeerde Microscoop, microinjector, en twee Cell manipulatiesystemen op een gemotoriseerde tafel voor eenvoudige koppeling met de massaspectrometer.
    1. Wijzig een van de cel manipulatiesystemen om een single-probe tegemoet door het vervangen van het einde met een arm klem.
    2. Gebruik een plastic spuit met een naald om de microinjector met minerale olie te vullen. Vermijd bubbels in de buis, omdat dit zal van invloed zijn zuigen.
    3. Vervang de plaats van de omgekeerde Microscoop met de verwarmde plaat. Zet de verwarmde plaat op 37 °C voorafgaand aan de analyse.
  2. Stel het glas cel-selectie apparaat in.
    1. Plaats de glazen cel-selectie sonde in de metalen houder van de microinjector door het plaatsen van de lange (niet-gebogen) kant in de capillaire houder en aanscherping van de schroef om de sonde op zijn plaats te beveiligen. Plaats de hoek van de sondepunt evenwijdig aan de verwarmde plaat.
      Let op: de glazen sonde is zeer scherp en breekbaar, en het breekt gemakkelijk. Bescherm uw ogen en wees extra voorzichtig tijdens het plaatsen van de sonde in de microinjector.
    2. Beveilig de metalen houder van de microinjector in de cel manipulatie systeem. Plaats de sonde tip in de buurt van het midden van de omgekeerde Microscoop licht.

3. Maak een Extended Ion Transfer tube voor de massaspectrometer inlaat

  1. Gebruik een metalen mes om een stuk van roestvrijstalen buizen snijden (OD: 0,0625 (1/16) in, ID: 0,021 in) ~ 250 mm in lengte.
  2. Maatregel 135 mm van het einde en plaats een metalen wilde zo ~ 135 mm zal worden blootgesteld aan de atmosfeer en ~ 115 mm zal worden in de massaspectrometer. Beveilig de wilde met behulp van twee sleutels aan te scherpen.

4. Koppel de ICMP met een single-probe Setup

  1. Beveilig de glazen glijbaan met de single-probe in de arm klem van de cel manipulatie systeem.
    Nota: de enig-sondes worden vervaardigd volgens een eerder-gepubliceerd protocol48 met twee minder belangrijke veranderingen in de huidige studie: de nano-ESI zender wordt gemaakt langer voor gemakkelijke koppeling aan de massaspectrometer, en de enig-sondes worden gelijmd aan het glas aan de rechterkant om te voorkomen dat de ruimtelijke beweging van het glas-cel-selectie apparaat wordt verstoord (Figuur 2).
  2. Sluit het oplosmiddel-het verstrekken van capillaire aan een geleidende Unie door het plaatsen van de capillaire in de mouw (1/16 x .005 in) van de plastic fitting en vinger-aanscherping van de fitting.
    1. Sluit de andere kant van de geleidende Unie aan een capillaire (ID: 40 µm, OD: 150 µm), die is aangesloten op een spuit met de bemonstering oplosmiddel, door het plaatsen van de capillaire in de mouw (1/32 x .007 in) en aanscherping van de fitting. Gebruik acetonitril met 0,1% vorm zuur als de bemonstering oplosmiddel in deze experimenten.
      Nota: het bemonsterings oplosmiddel is flexibel, maar het zou hoofdzakelijk acetonitril (of acetonitril met vormend zuur voor betere ionisatie) voor een snelle Microscale cel lysis moeten bevatten.
    2. Beveilig de spuit in de spuitpomp op de massaspectrometer.
    3. Plaats het ionisatie spannings koord op een koperdraad die aan de geleidende Unie wordt gehecht.
  3. Plaats de nano-ESI emitter ~ 1 mm aan de opening van de Extended Ion Transfer Tube.
    1. Gebruik de cel manipulatie systeem om de ruimtelijke bewegingen van de single-probe controle en de positie van de nano-ESI emitter centraal in de voorkant van de Extended Ion Transfer slang.

5. geschorste cel monstervoorbereiding

  1. De dag voor de analyse (~ 18-24 h), zaad uit cellen voor het testen in een cel cultuur kolf (T25). K562 menselijke myeloïde leukemie cellen worden gebruikt als modellen in deze studie.
    1. Warmte 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium aangevuld met 10% synthetisch foetale boviene serum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C voor 30 min.
    2. Zaad ~ 1 x 106 cellen in een totaal volume van 10 ml door het combineren van cellen met warm medium. Gebruik in het algemeen een pipet van 10 mL om 8 mL RPMI medium in een cel kweek kolf te plaatsen. Gebruik vervolgens een pipet van 2 mL om 2 mL Confluent K562 cellen het medium voor ~ 1 x 106 cellen te zetten.
    3. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 tot analyse.
  2. Cellen voorbereiden voor analyse.
    1. Pipet cellen uit de cel cultuur kolf in een 15-mL centrifugebuis.
    2. Spin cellen naar beneden bij 400 x g en 37 ° c voor 5 min en gooi de bovendrijvende.
    3. De cellen opnieuw op te schorten in 4 mL RPMI medium dat de geneesmiddelen bevat bij de gewenste behandelings concentratie.
      Opmerking: voor de analyse van de controlecellen, de cellen opnieuw op te schorten in 4 mL van RPMI medium en ga naar stap 6.
    4. Incubeer de cellen voor de duur van de behandelingstijd bij 37 °C en 5% CO2.
    5. Spin cellen neer bij 400 x g en 37 °c voor 5 min. aspireren de bovendrijvende.
    6. De cellen worden opnieuw opgeschort in 10 mL PBS, en centrifugeren bij 400 x g en 37 °c voor 5 min. Na het spinnen, gooi de bovendrijvende. Herhaal deze stap 3 keer om de opsporing van drugs te minimaliseren van extracellulaire bestanddelen.
    7. Hersuspendeer de cellen in 4 mL PBS voor analyse.

6. Voer SCMS metingen uit met behulp van de ICMP/single-probe Setup

  1. Parameters voor de massaspectrometer voor het experiment aanpassen.
    1. Selecteer in het onderdeel scanmodus van de instrument software de optie Scan definiëren. Gebruik een resolutie van 60.000 m/∆ m bij m/z 400, 1 MICROSCAN, 100 MS maximale injectietijd, en automatische Gain controle (AGC) op. Een massa bereik (m/z) van 100-1000 werd gebruikt voor de experimenten. Parameters kunnen worden aangepast op basis van het instrumentmodel.
    2. Selecteer onder spuitpompeen debiet van 150 nl/min. debiet moet worden geoptimaliseerd voor elk experiment.
    3. Selecteer NSI bron en breng een spanning van ~ 4,5 kV. Deze parameter moet ook voor elk experiment worden geoptimaliseerd.
  2. Zet de omgekeerde Microscoop (met 40x vergroting geselecteerd voor zowel de bovenste plaat en onderkant lens) en sluit deze aan op de USB-poort van een laptop om live-video-feeds vast te leggen. Zet de verwarmde plaat aan en zet deze op 37 °C.
  3. Ga op de computer naar het tabblad gegevens ophalen en selecteer continu onder tijd ophalen .
  4. Bereid steekproef voor analyse.
    1. Pipetteer 2-3 mL monster in het deksel van een klein Petri schaaltje (35 mm x 12 mm).
    2. 6.4.2 positie van de steekproef in het midden van het licht van de omgekeerde Microscoop op de top van de verwarmde plaat.
  5. Bereid de glas cel-selectie sonde voor analyse. Gebruik de cel manipulatie systeem om de sonde te verplaatsen, zodat de tip is gericht onder de omgekeerde Microscoop in hetzelfde vlak als de cellen.
  6. Selecteer een afzonderlijke cel voor analyse.
    1. Gebruik de cel manipulatie systeem om de cel-selectie sonde Tip verplaatsen naar een gerichte cel. Dit proces wordt gecontroleerd met behulp van de omgekeerde Microscoop.
      Opmerking: als de punt van de cel-selectie sonde niet kan worden gericht in hetzelfde vlak als de cellen, is het mogelijk dat de gebogen deel van de sonde niet geschikt is schuin. Pas de positie van de cel-selectie sonde totdat beide sonde tips kunnen worden gericht, samen met de cellen onder de Microscoop.
    2. Draai voorzichtig de hendel van de microinjector om de positie van de minerale olie in de slang aan te passen. Een zachte zuiging wordt verstrekt door de microinjector om de gerichte cel aan de cel-selectie sonde uiteinde te beveiligen.
      Opmerking: als de cel niet kan worden gevangen door de cel-selectie sonde door de zuigkracht, controleer dan de cel-selectie sonde om ervoor te zorgen dat het volledig is opgenomen in de capillaire houder. Bovendien, Inspecteer de minerale olieniveaus in de microinjector en buizen, en verdrijven lucht als er sprake is.
    3. Gebruik de Cell manipulatie systeem om de cel te verplaatsen op de cel-selectie sonde tip om de single-probe tip, met behulp van een digitale microscoop gericht op de single-probe tip om dit proces te controleren. Bij het aanraken, een kleine acetonitril druppel op de single-probe Tip induceert een snelle lyses van de cel, en vervolgens cel lysate wordt onmiddellijk geioniseerd voor on-line MS analyse.
      Opmerking: omdat de geselecteerde cel is beveiligd naar de cel-selectie sonde Tip door middel van een zachte zuigkracht, kan deze cel mogelijk los tijdens de overdracht aan de single-probe tip. Daarom, als Ion signalen van typische cellulaire lipiden (Zie representatieve resultaten hieronder) niet worden waargenomen binnen 5 s, is het mogelijk dat de cel werd onbevestigd, en de selectie van een andere cel nodig is.

Representative Results

Eerste, onbehandelde K562 cellen worden gebruikt om de experimentele methode vast te stellen. In een typisch SCMS experiment, kunnen de duidelijke veranderingen van massaspectra worden waargenomen van het overbrengen van een cel, tijdens de opsporing van cellulaire inhoud, en na het afronden van de meting (figuur S1). Drie gemeenschappelijke cellulaire lipiden pieken (fosfatidylcholine, PC), met inbegrip van PC (34:4) (m/z 754,536), PC (36:4) (m/z 782,567), en PC (38:5) (m/z 808,583), worden gecontroleerd om de cel te verzekeren met succes wordt overgebracht en cellulair de inhoud wordt gedetecteerd (figuur S2)21,43,46,55,56. Als de lipiden pieken niet binnen 5 s worden gezien, wordt het minerale olieniveau in de microinjector veranderd om de zuiging te verminderen die de cel bij de cel-selectie sonde uiteinde houdt; voorzichtigheid moet worden genomen, zodat er geen minerale olie wordt geduwd uit de cel-selectie sonde. De identiteit van veel PC'S in de massa range van m/z 750-850 worden bevestigd met behulp van MS/MS op onbehandelde cel lysate monsters (Figuur 3, figuur S2, tabel 1)46.

K562 cellen zijn ook onderworpen aan behandeling met verschillende geneesmiddelen om de veelzijdigheid van de methode uit te breiden. K562 cellen worden uitgebroed met Gemcitabine (1 µ M) en taxol (1 µ M) voor 1 h en OSW-1 (100 nM, 1 µ M) voor 4 h en 2 h, respectievelijk. De cellen worden dan gewassen met PBS om de opsporing van drug samenstellingen van extracellulaire inhoud te minimaliseren. De bijdrage van matrijs (b.v., ionen van het middel van de cel cultuur, PBS, en oplosmiddel) aan massaspectra van cellulaire inhoud kan door gegevens aftrekking, wegens hun beduidend verschillende ionen signalen worden geëlimineerd (figuur S3). Alle drie de drugs verbindingen worden gedetecteerd met behulp van de ICMP/single-probe MS Setup (figuur S4)46. Deze resultaten suggereren deze methode kan worden gebruikt om intracellulaire lipiden, drugs en metabolieten studie op de single-cell niveau van cellen in oplossing in een bijna-native omgeving.

Figure 1
Figuur 1. Experimentele Setup voor enkele schorsing cel MS experimenten. (A) het geïntegreerde platform voor de manipulatie van cellen (ICMP) in combinatie met een massaspectrometer. Bschematische analyse van zwevende cellen. (C) experimentele weergave van K562 cellen die moeten worden geselecteerd met behulp van de cel-selectie sonde. Herdrukt met toestemming van Standke et al.46. Auteursrecht 2019 de Amerikaanse chemische maatschappij. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Foto's van een aangepaste single-probe en een cel-selectie sonde gebruikt voor enkele schorsing cel MS experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Ingezoomd massaspectrum van een enkele cel met de representatieve soort (m/z 750-850). Chemische structuren worden bevestigd met behulp van MS/MS analyse (figuur S1). Herdrukt met toestemming van Standke et al.46. Auteursrecht 2019 de Amerikaanse chemische maatschappij. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Drug molecule* m/z Massa fout (ppm)
[Gemcitabine + H] + 264,076 11,32
[Taxol + na] + 876,318 2,74
[OSW-1 + na] + 895,445 0,89
Cellulaire lipiden
[PC (34:4) + H] + 754,535 3,71
[PC (34:3) + H] + 756,551 3,44
[PC (34:2) + H] + 758,569 0,66
[PC (36:5) + H] + 780,551 3,07
[PC (36:4) + H] + 782,568 2,17
[PC (36:3) + H] + 784,585 0,64
[PC (38:7) + H] + 804,551 4,1
[PC (38:6) + H] + 806,567 2,48
[PC (38:5) + H] + 808,583 2,72
[PC (38:4) + H] + 810,601 0
[PC (40:7) + H] + 832,583 3,12

Tabel 1. Geïdentificeerde cellulaire componenten met behulp van de ICMP/single-probe Setup. De opsporing van alle drugs verbindingen werd bevestigd door de resultaten van MS/MS met standaardsamenstelling te vergelijken.

Discussion

De geïntegreerde cel manipulatie en analyse platform is gebouwd om de veelzijdigheid van de single-probe MS-methode uit te breiden, waardoor on-line, snelle analyse van niet-aanhangende cellen in een bijna-native omgeving. Een groot voordeel van de techniek is dat minimale monstervoorbereiding nodig is, zodat de cellen worden geanalyseerd in omstandigheden die hun standaard staat na te bootsen. In het bijzonder, individuele cellen van belang kunnen visueel worden geïdentificeerd en geselecteerd, het minimaliseren van de invloed van matrix effect op MS ionisatie-efficiëntie met behoud van cellen in hun natuurlijke omgeving, zodat de resultaten zijn meer representatieve cellen ' native status (figuur S3). Deze techniek kan worden gebruikt voor de studie van patiënt cellen geschorst in biovloeistoffen in toekomstige studies. Een ander voordeel van deze techniek is de flexibele selectie van het sampling oplosmiddel. Het is belangrijk om acetonitril te nemen als de belangrijkste bemonstering oplosmiddel, zodat Microscale lysis kan snel voorkomen. Mogelijk kunnen interne normen (bijv. isotopically-gelabelde geneesmiddelen) worden toegevoegd aan het bemonsterings middel voor de kwantificering van moleculen die van belang zijn (bijv. drug moleculen) uit individuele cellen, waaronder die een sleutelrol kunnen spelen bij een revolutie personaliseren van geneesmiddelen behandelingen in de toekomst54.

Hoewel dit geïntegreerde systeem gemakkelijk kan worden gebruikt om brede waaiers van cellen te analyseren, is een beperking van de methode dat noch de enig-sonde noch cel-selectie sonde commercieel-beschikbaar is; het dicteren van de behoefte aan optimalisering van vele parameters (b.v., stroomtarief, voltage, lengte tussen nano-ESI emitter en ionen overdrachts buizenstelsel, enz.) voorafgaand aan elk experiment. Bovendien, wegens de kleinheid van de enig-sonde en cel-selectie sonde, kunnen de milieuverstoring (b.v., luchtstroom) in moeilijkheden resulteren die een verbinding tussen de twee sondes vestigen. Een oplossing op korte termijn is het buigen van de cel-selectie sonde dicht bij het einde van de lengte van de tapering te minimaliseren. Het toekomstige werk omvat de ontwikkeling van een huisvesting om de kritieke delen van de opstelling te omsluiten om milieugevolgen te minimaliseren. Wegens de beperkte hoeveelheid cellulaire inhoud en de korte verwervings tijd (~ 2-3 s) van een cel, kan de analyse van MS/MS slechts voor vrij overvloedige soorten worden geleid. Andere factoren die de opsporings gevoeligheid beïnvloeden omvatten de onderdrukte ionisatie efficiency toe te schrijven aan de introductie van matrijs samen met de cel en het potentiële ionen verlies door het uitgebreide ionen overdrachts buizenstelsel.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs danken Naga Rama Ninne voor haar werk in het ontwikkelen van sample voorbereiding voor zowel schorsing cellen en cel lysate experimenten. Bovendien, de auteurs bedanken de NIH (R01GM116116 en R21CA204706) voor de financiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetontrile Millipore Co. AX0145-1 Sampling solvent
CellTram Vario Eppendorf 6221 ICMP
Copper wire stores.ebay.com/jewelerheaven Dead soft, round, 20 guage, 25 ft Conductive union setup
Digital stereomicroscope Shenzhen D&F Co. Supereyes T004 Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µL Rochester Scientific 5065 Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" Friedrich & Dimmock, Inc. MBT-005-020-2Q Single-probe fabrication
Epoxy resin Devcon Part No. 20945 Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation system Eppendorf Transferman NK517800397-U.R. ICMP
External nut VALCO*CHEMINERT EN1 Ion transfer tube fabrication
Formic acid Sigma-Aldrich 399388-500ML Sampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm Polymicro Technologies TSP040105 Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm Polymicro Technologies 1068150015 Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) Fischer Sci SH3006603 Cell culture
Inline MicroFilter IDEX Health & Science LLC M-520 Conductive union setup
Laser puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 Single-probe fabrication
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment LY-C240 Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL Analysis
Microforge Narishige, Co. MF-9 Cell-selection probe fabrication
Microunion IDEX Health & Science LLC M-539 Conductive union
PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft IDEX Health & Science LLC 1576 Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft IDEX Health & Science LLC 1577 Conductive union setup
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies 15140-122 Cell culture
Petri dish, 35x10 mm VWR 25382-334 Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 0780-50L Cell culture
Platinum wire Narishige, Co. Model PT-A Microforge
Power supply Nikon PSM-2120 ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagro Corning 10-104-CV Cell culture
Single-bore tubes Boralex 5065 Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD IDEX Health & Science LLC VHP-200-01x Ion transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm IDEX Health & Science LLC U-1128 Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µL Hamilton 1725LTN250UL Sampling syringe
T25 flask CellStar 690160 Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective PB5500 Analysis
ThermoPlate TokaiHit 55R30N ICMP
TrypLE Express Gibco 12605-010 Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steel SUPELCO 58692-U Ion transfer tube fabrication
USB digital photography microscope dx.com SO2 25~500X Analysis
UV curing resin Prime Dental Item No. 006.030 Single-probe fabrication
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Cell-selection probe fabrication
Voltage housing PicoChip PCH-A00120 ICMP/MS interface
Wire cutter Craftsman 4 1/2 in end nipper Conductive union setup

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111 (2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445 (2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101 (2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891 (2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201 (2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT - Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981 (2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173 (2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6545 LP-6550 (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911 (2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Tags

Chemie eencellige massaspectrometrie schorsing cellen geïntegreerde cel manipulatie platform single-Probe ambient ionisatie Microscale sampling
Geïntegreerde cel manipulatie platform in combinatie met de single-probe voor massaspectrometrie analyse van drugs en metabolieten in enkele schorsing cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Standke, S. J., Colby, D. H.,… More

Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells. J. Vis. Exp. (148), e59875, doi:10.3791/59875 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter