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Chemistry

एकीकृत सेल हेरफेर मंच एकल निलंबन कोशिकाओं में दवाओं और चयापचयों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए एकल जांच के साथ युग्मित

Published: June 21, 2019 doi: 10.3791/59875
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma

Summary

एक एकीकृत सेल हेरफेर मंच परिवेश की स्थिति के तहत व्यक्तिगत निलंबन कोशिकाओं की ऑन लाइन विश्लेषण के लिए एक एकल जांच मास स्पेक्ट्रोमेट्री सेटअप के साथ संयोजन के रूप में उपयोग के लिए विकसित की है.

Abstract

एकल सेल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (SCMS) संवेदनशील का पता लगाने और व्यक्तिगत सेल स्तर पर सेलुलर प्रजातियों की व्यापक श्रेणियों का सटीक विश्लेषण सक्षम बनाता है. एकल जांच, एक microscale नमूना और आयनन डिवाइस, पर लाइन के लिए एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित किया जा सकता है, परिवेश की स्थिति के तहत सेलुलर घटकों के तेजी से SCMS विश्लेषण. पहले, एकल-प्रोब SCMS तकनीक मुख्य रूप से कोशिकाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था एक सब्सट्रेट पर immobilized, अध्ययन के लिए कोशिकाओं के प्रकार सीमित. वर्तमान अध्ययन में, एकल जांच SCMS प्रौद्योगिकी एक सेल हेरफेर प्रणाली के साथ एकीकृत किया गया है, आम तौर पर इन विट्रो निषेचन के लिए इस्तेमाल किया. यह एकीकृत सेल हेरफेर और विश्लेषण मंच एक सेल चयन जांच का उपयोग करता है की पहचान की अस्थायी कोशिकाओं पर कब्जा और microscale lysis के लिए एकल जांच टिप करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित, तत्काल मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद. इस पर कब्जा और हस्तांतरण प्रक्रिया विश्लेषण करने से पहले आसपास के समाधान से कोशिकाओं को हटा, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में मैट्रिक्स अणुओं की शुरूआत को कम से कम. इस एकीकृत सेटअप लक्षित रोगी अलग शरीर के तरल पदार्थ के नमूनों में मौजूद कोशिकाओं के SCMS विश्लेषण करने में सक्षम है (उदाहरण के लिए, मूत्र, रक्त, लार, आदि), मानव चिकित्सा और रोग जीव विज्ञान के लिए SCMS विश्लेषण के संभावित अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है.

Introduction

मानव जीव विज्ञान, विशेष रूप से रोग जीव विज्ञान, तेजी से व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्तर पर गतिविधियों का परिणाम माना जाता है, लेकिन पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीकों, जैसे तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LCMS), आम तौर पर विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है कोशिकाओं की आबादी से तैयार किए गए नमूने, जबकि अर्जित आणविक जानकारी व्यक्तिगत-कोशिका स्तर पर रासायनिक प्रक्रियाओं का सही प्रतिनिधित्व नहीं कर सकती। इन मानक, पारंपरिक तरीकों के लिए एक विश्लेषणात्मक माप पर सेलुलर विषमता के प्रभाव को विचार करने में असमर्थ हैं, और को नष्ट करने और कोशिकाओं को मिश्रण की प्रक्रिया को नष्ट करने और कोशिकाओं को मिश्रण करने के लिए lysate संभावित परिवर्तन या सेलुलर के नुकसान की ओर जाता है घटक1,2. पारंपरिक तरीकों की इन सीमाओं रोगी कोशिकाओं के विश्लेषण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, जिसमें प्राप्त नमूने कई अलग अलग सेल प्रकार के एक जटिल मिश्रण शामिल कर सकते हैं. इन कमियों को दूर करने के लिए, एकल सेल आणविक विश्लेषण विधियों, एकल सेल द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री सहित (SCMS) तरीकों, तेजी से विकसित किया जा रहा है और जैव विश्लेषण के लिए लागू किया जा रहा है, विशेष रूप से सेलुलर चयापचयों और कम आणविक वजन की जैव अणु3,4.

पहले एससीएमएस तकनीक ों का इस्तेमाल किया वैक्यूम आधारित तकनीक का इस्तेमाल किया गैर-परिवेश की स्थिति2,5,6,7,8,9, के तहत विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिएविकसित 10,11. गैर-एम्बिएंट SCMS तकनीक सेलुलर लिपिड और चयापचयों का विश्लेषण करने में सक्षम हैं, लेकिन कृत्रिम परिस्थितियों के तहत नमूना pretreatment की आवश्यकता होती है, और इसलिए वास्तविक समय विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं. गैर-परिवेश विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी प्रक्रिया मैट्रिक्स घटकों के अलावा भी शामिल है, और इस तैयारी उनके प्राकृतिक वातावरण से सेलुलर घटकों को बदल सकते हैं12. इसलिए, परिवेश मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) तकनीक, जो नमूना वातावरण के लिए एक निर्वात की आवश्यकता नहीं है, एक के पास देशी वातावरण में कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है. एक वैक्यूम वातावरण नहीं होने प्रयोगात्मक डिजाइन में बहुमुखी प्रतिभा के लिए अनुमति देता है; कैमरों सेलुलर प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए जोड़ा जा सकता है और नरम आयनन तकनीक जुदाई तकनीक के साथ जोड़ा जा सकता है प्रत्येक एकल सेल प्रयोग से बेहतर जानकारी प्राप्त करने के लिए4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.

एकल जांच SCMS विधि एक परिवेश तकनीक है कि एक निकट देशी वातावरण में रहते विश्लेषण करती है, स्तनधारी कैंसर सेल लाइनों21,43,44,45,46. इसके अलावा, एकल जांच डिवाइस अन्य बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है, multicellular अगोलीय में extracellular अणुओं के विश्लेषण और ऊतकों के एमएस इमेजिंगसहित 47,48,49 ,50,51,52. तथापि, चूंकि इस विधि के लिए सबस्ट्राट्स पर सेल स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है, इसलिए निलंबन कोशिकाओं का इस तकनीक3,53का उपयोग करके सीधे विश्लेषित नहीं किया जा सकता। इसलिए, एकल जांच SCMS प्रणाली सीधे गैर-अनुकूल एकल कोशिकाओं, जैसे गैर-अनुकूल सेल लाइनों या निलंबन कोशिकाओं एक रोगी के रक्त या अन्य शारीरिक तरल पदार्थ54से अलग नमूना करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इस कार्य में, एक एकीकृत सेल जोड़-तोड़ मंच (आईसीएमपी) को एकल-प्रोब एससीएमएस तकनीक के साथ जोड़ा जाता है ताकि लाइव का विश्लेषण किया जा सके, निलंबन कोशिकाओं को न्यूनतम नमूना तैयारी के साथ ऑन-लाइन (चित्र 1)46. ICMP सेल चयन की निगरानी करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के होते हैं, एक ग्लास सेल चयन जांच, एक microinstor व्यक्तिगत अस्थायी कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए, सेलुलर तापमान बनाए रखने के लिए एक गर्म थाली, स्थानिक नियंत्रित करने के लिए दो सेल हेरफेर प्रणाली दोनों ग्लास सेल चयन जांच और एकल जांच के आंदोलनों, और एक डिजिटल माइक्रोस्कोप सेल चयन जांच टिप से एकल जांच टिप करने के लिए सेल हस्तांतरण का निरीक्षण करने के लिए। एकल जांच का निर्माण पिछले प्रकाशनों में विस्तृत है और यहाँ21,48संबोधित नहीं किया जाएगा . ICMP/एकल-प्रोब प्रणाली को उच्च रिज़ॉल्यूशन द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर में युग्मित किया जाता है। इस एकीकृत सेटअप मैट्रिक्स अणुओं से न्यूनतम प्रभाव के साथ जटिल जैविक नमूनों से पहचान की एकल कोशिकाओं के नमूने के लिए अनुमति देता है.

Protocol

1. ग्लास सेल चयन जांच निर्माण

  1. एक तेज टिप के साथ एक पतला जांच में एकल बोर ग्लास ट्यूबिंग कन्वर्ट।
    1. एक एकल बोर ग्लास ट्यूब (आईडी: 0.3 मिमी, OD: 1.1. मिमी) एक ऊर्ध्वाधर पिपेट धारक के clamps में रखें, हीटिंग कुंडली के संबंध में कांच केंद्रित और जगह में ट्यूब सुरक्षित करने के लिए कस. हीटिंग कुंडली में एक 18-गेज निकल-क्रोमियम प्रतिरोध तार ($60 मिमी लंबाई में) शामिल है जो धातु की छड़ (व्यास 3.90 मिमी) 2.5 बार चारों ओर काढता है।
    2. तापमान कार्यक्रम 19.5 (निर्माता की इकाई) के साथ ग्लास टयूबिंग सेट करें। इस पैरामीटर एक विशेष साधन के लिए संशोधित किया जा सकता है.
    3. 4 (निर्माता की इकाई) पर परिनालिका प्लंजर सेट करें। इस पैरामीटर एक विशेष साधन के लिए संशोधित किया जा सकता है.
    4. कांच टयूबिंग खींचने के लिए परिनालिका ट्रिगर करें। यह चरण दो जांच टिप पर जुड़े बनाता है.
    5. जांच टिप पर व्यास में $ 10 डिग्री मीटर का एक छिद्र बनाने, प्रत्येक जांच की नोक से दूर $ 1 मिमी कटौती करने के लिए tweezers का प्रयोग करें।
  2. ICMP/एकल-प्रोब SCMS सेटअप करने के लिए आसान युग्मन के लिए कांच की जांच मोड़ें।
    1. माइक्रोफोर्ज में एक खींचे गए कांच की जांच करें, प्लैटिनम हीटिंग तार के ऊपर टिप जेड 3 मिमी की स्थिति।
    2. अधिकतम तापमान के 30% करने के लिए प्लैटिनम तार पर गर्मी मुड़ें.
    3. जांच को मूल स्थिति से मोड़िए (चित्र 2)।

2. एकीकृत सेल हेरफेर मंच विधानसभा

  1. प्रतिलोमित माइक्रोस्कोप, माइक्रोइंजेक्टर, और दो सेल हेरफेर सिस्टम को द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के साथ आसान युग्मन के लिए एक मोटरीकृत टेबल पर रखें।
    1. एक हाथ दबाना के साथ अंत की जगह से एक एकल जांच को समायोजित करने के लिए सेल हेरफेर प्रणालियों में से एक को संशोधित करें।
    2. खनिज तेल के साथ microinector को भरने के लिए एक सुई के साथ एक प्लास्टिक सिरिंज का प्रयोग करें. ट्यूबिंग में बुलबुले से बचें क्योंकि यह चूषण को प्रभावित करेगा।
    3. उल्टे सूक्ष्मदर्शी के चरण सम्मिलित को गर्म प्लेट से बदलें। विश्लेषण से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट सेट करें।
  2. ग्लास सेल-चयन डिवाइस सेट करें.
    1. माइक्रोइंजेक्टर के धातु धारक के अंदर कांच सेल-चयन जांच डालें, लंबे (गैर-बंट) पक्ष को केशिका धारक में रखकर और जांच को सुरक्षित करने के लिए पेंच को कस कर रखें। जांच टिप के कोण को गर्म प्लेट के समानांतर रखें।
      चेतावनी: कांच की जांच बहुत तेज और नाजुक है, और यह आसानी से टूट जाती है। अपनी आंखों को सुरक्षित रखें और माइक्रोइंजेक्टर में जांच डालने के दौरान अतिरिक्त सतर्क रहें।
    2. माइक्रोइंजेक्टर के धातु धारक को सेल मैनीपुलेशन सिस्टम में सुरक्षित करें। जांच टिप को उल्टे माइक्रोस्कोप प्रकाश के मध्य के पास स्थित करें।

3. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर इनलेट के लिए एक विस्तारित आयन हस्तांतरण ट्यूब बनाएँ

  1. स्टेनलेस स्टील टयूबिंग का एक टुकड़ा कटौती करने के लिए एक धातु कटर का उपयोग करें (ओडी: 0.0625 (1/16) में, आईडी: 0.021 में) लंबाई में 250 मिमी.
  2. उपाय 135 मिमी अंत से और जगह एक धातु जंगली तो $135 मिमी वातावरण को उजागर किया जाएगा और $115 मिमी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के अंदर हो जाएगा. इसे कसने के लिए दो wrenches का उपयोग कर जंगली सुरक्षित.

4. एक एकल जांच सेटअप के साथ ICMP युगल

  1. सेल हेरफेर प्रणाली के हाथ दबाना में एकल जांच युक्त कांच स्लाइड सुरक्षित।
    नोट: एकल-प्रोब्स वर्तमान अध्ययन में दो मामूली परिवर्तनों के साथ एक पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल48 के अनुसार निर्मित हैं: नैनो-ESI उत्सर्जक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए आसान युग्मन के लिए लंबे समय तक किया जाता है, और एकल-प्रोब्स कांच से चिपके हुए हैं कांच सेल-चयन उपकरण के स्थानिक आंदोलन के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए दाईं ओर की ओर (चित्र2)।
  2. प्लास्टिक फेरूल के आस्तीन (1/16 x .005 इंच) में केशिका डालकर विलायक-उपलब्धकर केशिका को प्रवाहकीय संघ से कनेक्ट करें और फिटिंग को उंगली से कसें।
    1. प्रवाहकीय संघ के दूसरे पक्ष को एक केशिका (आईडी: 40 डिग्री, ओडी: 150 डिग्री), जो नमूना विलायक युक्त सिरिंज से जुड़ा हुआ है, आस्तीन में केशिका रखकर कनेक्ट करें (1/32 x .007 में) और फिटिंग कस. इन प्रयोगों में नमूना विलायक के रूप में 0.1% formic एसिड के साथ एसीटोनिट्रिल का प्रयोग करें.
      नोट: नमूना विलायक लचीला है, लेकिन यह मुख्य रूप से एक तेजी से माइक्रोस्केल सेल lysis के लिए acetonitrile (या बेहतर आयनीकरण के लिए formic एसिड के साथ acetonitrile) शामिल होना चाहिए.
    2. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर पर सिरिंज पंप में सिरिंज सुरक्षित.
    3. आयनन वोल्टता रज्जु को प्रवाहकीय संघ से जुड़े तांबे के तार पर रखें।
  3. नैनो-ईएसआई उत्सर्जक को विस्तारित आयन अंतरण ट्यूब के छिद्र में 1 मिमी की स्थिति में रखना।
    1. एकल-प्रोब के स्थानिक आंदोलनों को नियंत्रित करने और विस्तारित आयन हस्तांतरण ट्यूबिंग के सामने नैनो-ईएसआई उत्सर्जक को केंद्रीय रूप से स्थिति बनाने के लिए सेल हेरफेर प्रणाली का उपयोग करें।

5. निलंबित सेल नमूना तैयारी

  1. विश्लेषण से पहले दिन ($ 18-24 एच), एक सेल संस्कृति फ्लास्क (T25) में परीक्षण के लिए कोशिकाओं से बाहर बीज. K562 मानव माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं इस अध्ययन में मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है।
    1. हीट 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) और Roswell पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) मध्यम 10% सिंथेटिक भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर.
    2. गर्म माध्यम के साथ कोशिकाओं के संयोजन से 10 एमएल की कुल मात्रा में बीज 1 x 106 कोशिकाओं। सामान्य तौर पर, एक सेल संस्कृति फ्लास्क में आरपीएमआई माध्यम के 8 एमएल जगह करने के लिए एक 10-एमएल पिपेट का उपयोग करें। फिर, $ 1 x 106 कोशिकाओं के लिए माध्यम confluent K562 कोशिकाओं के 2 एमएल डाल करने के लिए एक 2 एमएल पिपेट का उपयोग करें।
    3. विश्लेषण तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. विश्लेषण के लिए कक्षों को तैयार करें।
    1. कोशिका संवर्धन फ्लास्क से पिपेट कोशिकाओं को 15-एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखा जाता है।
    2. स्पिन कोशिकाओं 400 x g और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन और supernatant त्याग दें।
    3. आरपीएमआई माध्यम के 4 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें जिसमें वांछित उपचार एकाग्रता पर दवा यौगिक शामिल है।
      नोट: नियंत्रण कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए, RPMI माध्यम के 4 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और चरण 6के लिए छोड़ दें।
    4. उपचार के समय की अवधि के लिए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2में इनक्यूबेट करें .
    5. स्पिन कोशिकाओं 400 x g और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन कोशिकाओं supernatant Aspirate.
    6. कोशिकाओं को पीबीएस के 10 एमएल में फिर से निलंबित कर दिया जाता है, और 5 मिनट के लिए 400 x g और 37 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र। कताई के बाद, supernatant त्याग दें. इस चरण को दोहराएँ 3 बार extracellular घटकों से दवा का पता लगाने को कम करने के लिए.
    7. विश्लेषण के लिए पीबीएस के 4 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।

6. ICMP/एकल-प्रोब सेटअप का उपयोग करSS माप निष्पादित करें

  1. प्रयोग के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए पैरामीटर अनुकूलित.
    1. उपकरण सॉफ्टवेयर के स्कैन मोड शीर्षक के तहत, स्कैन परिभाषित करें काचयन करें। उधज़ 400, 1 माइक्रोस्कैन, 100 एमएस अधिकतम इंजेक्शन समय, और स्वत: लाभ नियंत्रण (एजीसी) पर 60,000 उ/ प्रयोगों के लिए 100-1000 की एक द्रव्यमान श्रेणी (m/ पैरामीटर साधन मॉडल के आधार पर संशोधित किया जा सकता है।
    2. Syringe पम्पके अंतर्गत, प्रत्येक प्रयोग के लिए 150 nL/min. प्रवाह दर की प्रवाह दर ऑप्टिमाइज़ की जानी चाहिए.
    3. NSI स्रोत का चयन करें और $ 4.5 केवी की एक वोल्टेज लागू होते हैं. इस पैरामीटर को प्रत्येक प्रयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ करने की भी आवश्यकता है.
  2. उल्टे माइक्रोस्कोप चालू करें (40x आवर्धन के साथ दोनों शीर्ष प्लेट और नीचे लेंस के लिए चयनित) और यह एक लैपटॉप के यूएसबी-पोर्ट से कनेक्ट करने के लिए लाइव वीडियो फ़ीड पर कब्जा. गरम प्लेट को चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  3. कंप्यूटर पर, डेटा प्राप्त करें टैब पर जाएँ, और प्राप्त समयके अंतर्गत लगातार चयन करें.
  4. विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करें।
    1. पिपेट 2-3 एमएल का नमूना एक छोटे पेट्री डिश (35 मिमी x 12 मिमी) के ढक्कन में होता है।
    2. 6ण्4ण्2 तापित प्लेट के शीर्ष पर प्रतिलोमित सूक्ष्मदर्शी से प्रकाश के मध्य में प्रतिदर्श को स्थिति में रखिए।
  5. विश्लेषण के लिए कांच सेल-चयन जांच तैयार करें। इसकी टिप कोशिकाओं के रूप में एक ही विमान में उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत ध्यान केंद्रित किया है तो जांच को स्थानांतरित करने के लिए सेल हेरफेर प्रणाली का प्रयोग करें।
  6. विश्लेषण के लिए किसी व्यक्तिगत कक्ष का चयन करें.
    1. सेल-चयन जांच टिप को लक्षित सेल में ले जाने के लिए सेल मैनीपुलेशन सिस्टम का उपयोग करें। इस प्रक्रिया को उल्टे सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके मनिगरानी किया जाता है।
      नोट: यदि सेल-चयन जांच की नोक कोशिकाओं के रूप में एक ही विमान में केंद्रित नहीं किया जा सकता है, यह संभव है कि जांच के तुला हिस्सा उचित कोण नहीं है. सेल-चयन जांच की स्थिति को तब तक समायोजित करें जब तक कि दोनों जांच युक्तियों को माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं के साथ ध्यान केंद्रित नहीं किया जा सकता।
    2. ट्यूबिंग के अंदर खनिज तेल की स्थिति को समायोजित करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर के हैंडल को धीरे से चालू करें। एक कोमल चूषण सेल चयन जांच टिप करने के लिए लक्षित सेल को सुरक्षित करने के लिए microinstor द्वारा प्रदान की जाती है.
      नोट: यदि सेल को चूषण बल के माध्यम से सेल-चयन जांच द्वारा कैप्चर नहीं किया जा सकता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए सेल-चयन जांच की जांच करें कि यह पूरी तरह से केशिका धारक में डाला गया है। इसके अलावा, microinector और ट्यूबिंग में खनिज तेल के स्तर का निरीक्षण, और हवा निष्कासित अगर कोई है.
    3. सेल हेरफेर प्रणाली का उपयोग करने के लिए सेल-चयन जांच टिप पर सेल ले जाने के लिए एकल जांच टिप, एक डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इस प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए एकल जांच टिप पर ध्यान केंद्रित. जब छू, एकल जांच टिप पर एक छोटे से एसीटोनिट्रिल छोटी बूंद सेल के एक तेजी से lyses लाती है, और फिर सेल lysate तुरंत ऑन लाइन एमएस विश्लेषण के लिए ionized है.
      नोट: क्योंकि चयनित सेल एक कोमल चूषण के माध्यम से सेल चयन जांच टिप करने के लिए सुरक्षित है, इस सेल संभावित एकल जांच टिप करने के लिए अपने हस्तांतरण के दौरान अलग किया जा सकता है. इसलिए, यदि विशिष्ट सेलुलर लिपिड के आयन संकेत (नीचे प्रतिनिधि परिणाम देखें) 5 s के भीतर नहीं देखे जाते हैं, तो यह संभव है कि सेल असंबद्ध हो गया है, और एक अलग सेल के चयन की आवश्यकता है।

Representative Results

सबसे पहले, अनुपचारित K562 कोशिकाओं प्रयोगात्मक विधि स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक ठेठ SCMS प्रयोग में, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम के स्पष्ट परिवर्तन एक सेल स्थानांतरित करने से देखा जा सकता है, सेलुलर सामग्री का पता लगाने के दौरान, और माप खत्म करने के बाद (चित्र S1). तीन आम सेलुलर लिपिड चोटियों (phosphatidylcholine, पीसी), पीसी सहित (34:4) (m/z 754.536), पीसी (36:4) (m/z 782.567), और पीसी (38:5) (m/z 808.583), सेल सफलतापूर्वक स्थानांतरित और सेलुलर सुनिश्चित करने के लिए निगरानी कर रहे हैं सामग्री का पता लगाया जाता है (चित्र S2)21,43,46,55,56. यदि लिपिड चोटियों 5 s के भीतर नहीं देखा जाता है, तो माइक्रोइंजेक्टर में खनिज तेल स्तर सेल-चयन जांच टिप पर सेल पकड़े चूषण को कम करने के लिए बदल जाता है; सावधानी बरतने की जरूरत है ताकि कोई खनिज तेल सेल चयन जांच से बाहर धकेल दिया है. m/z 750-850 के द्रव्यमान श्रेणी में कई PC की पहचान की पुष्टि अनुपचारित सेल lysate नमूनों पर MS/MS का उपयोग करके की जाती है (चित्र 3, चित्र S2, तालिका 1)46.

K562 कोशिकाओं को भी विधि की बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करने के लिए विभिन्न दवा यौगिकों के साथ उपचार के अधीन हैं. K562 कोशिकाओं gemcitabine के साथ इनक्यूबेट कर रहे हैं (1 $M) और taxol (1 $M) के लिए 1 एच और OSW-1 (100 एनएम, 1 $M) के लिए 4 एच और 2 एच, क्रमशः. कोशिकाओं तो PBS के साथ धोया जाता है extracellular सामग्री से दवा यौगिकों का पता लगाने को कम करने के लिए. मैट्रिक्स का योगदान (जैसे, सेल संस्कृति माध्यम से आयनों, पीबीएस, और विलायक) सेलुलर सामग्री के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम के लिए डेटा घटाव के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है, उनके काफी अलग आयन संकेतों के कारण (चित्र S3). आईसीएमपी/एकल-प्रोब एमएस सेटअप (चित्र एस44 )46का उपयोग करके सभी तीन औषध यौगिकों का पता लगाया जाता है . इन परिणामों का सुझाव है कि इस विधि intracellular लिपिड का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, दवाओं, और चयापचयों के समाधान में एक से एकल कोशिका स्तर पर एक निकट देशी वातावरण में.

Figure 1
चित्र 1. एकल निलंबन सेल एमएस प्रयोगों के लिए प्रायोगिक सेटअप. (क) एकीकृत सेल हेरफेर मंच (आईसीएमपी) एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित। (B) निलंबित कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए योजना तैयार की गई है। (C) कक्ष-चयन जांच का उपयोग करके चयनित किए जाने वाले K562 कक्षों का प्रायोगिक दृश्य. Standke एट अल से अनुमति के साथ reprinted46. कॉपीराइट 2019 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. एक संशोधित एकल जांच और एक सेल चयन जांच की तस्वीरें एकल निलंबन सेल एमएस प्रयोगों के लिए उपयोग किया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. प्रतिनिधि प्रजाति को दर्शाने वाली एकल कोशिका से ज़ूम-इन मास स्पेक्ट्रम (m/z 750-850)| एमएस/एमएस विश्लेषण (चित्रS1)का उपयोग करके रासायनिक संरचनाओं की पुष्टि की जाती है। Standke एट अल46से अनुमति के साथ reprinted . कॉपीराइट 2019 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

दवा अणु* m/z मास त्रुटि (पीपीएम)
[Gemcitabine + एच] + 264.076 11.32
[टैक्सॉल + ना] + 876.318 2.74
[OSW-1 + ना] + 895.445 0.89
सेलुलर लिपिड
[पीसी (34:4) + एच] + 754.535 3.71
[पीसी (34:3) + एच] + 756.551 3.44
[पीसी (34:2) + एच] + 758.569 0.66
[पीसी (36:5) + एच] + 780.551 3.07
[पीसी (36:4) + एच] + 782.568 2.17
[पीसी (36:3) + एच] + 784.585 0.64
[पीसी (38:7) + एच] + 804.551 4.1
[पीसी (38:6) + एच] + 806.567 2.48
[पीसी (38:5) + एच] + 808.583 2.72
[पीसी (38:4) + एच] + 810.601 0
[पीसी (40:7) + एच] + 832.583 3.12

तालिका 1. आईसीएमपी/एकल-प्रोब सेटअप का उपयोग करके सेल्युलर घटकों की पहचान की। एमएस/एमएस परिणामों की मानक यौगिक के साथ तुलना करके सभी औषध यौगिकों का पता लगाने की पुष्टि की गई थी।

Discussion

एकीकृत सेल हेरफेर और विश्लेषण मंच एकल जांच एमएस विधि की बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करने के लिए निर्माण किया है, ऑन लाइन के लिए अनुमति देता है, एक के पास देशी वातावरण में गैर-अनुकूल कोशिकाओं के तेजी से विश्लेषण. तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि कम से कम नमूना तैयारी की आवश्यकता है, तो कोशिकाओं की स्थिति है कि उनके मानक राज्य की नकल में विश्लेषण कर रहे हैं. विशेष रूप से, ब्याज की व्यक्तिगत कोशिकाओं नेत्रहीन की पहचान की और चयनित किया जा सकता है, एमएस आयनन दक्षता पर मैट्रिक्स प्रभाव के प्रभाव को कम करते हुए उनके प्राकृतिक वातावरण में कोशिकाओं को बनाए रखने, तो परिणाम अधिक प्रतिनिधि कोशिकाओं 'मूल हैं स्थिति (चित्र S3)। इस तकनीक संभावित भविष्य के अध्ययन में biofluids में निलंबित रोगी कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक का एक और लाभ नमूना विलायक के लचीला चयन है. यह मुख्य नमूना विलायक के रूप में एसीटोनिट्रिल शामिल करने के लिए इतना है कि microscale lysis तेजी से हो सकता है महत्वपूर्ण है. संभावित रूप से, आंतरिक मानकों (जैसे, isotopically लेबल दवा यौगिकों) ब्याज के अणुओं के परिमाणीकरण के लिए नमूना विलायक में जोड़ा जा सकता है (उदाहरण के लिए, दवा अणुओं) अलग-अलग कोशिकाओं से, उन सहित क्रांति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं भविष्य में दवा उपचार personalizing54|

हालांकि इस एकीकृत प्रणाली आसानी से कोशिकाओं की व्यापक श्रेणियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विधि की एक सीमा है कि न तो एकल जांच और न ही सेल चयन जांच व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है; प्रत्येक प्रयोग से पहले कई पैरामीटर (जैसे, प्रवाह दर, वोल्टेज, नैनो-ईएसआई उत्सर्जक और आयन स्थानांतरण टयूबिंग, आदि के बीच लंबाई) के अनुकूलन की आवश्यकता को आदेश देना। इसके अलावा, एकल जांच और सेल चयन जांच की छोटीता के कारण, पर्यावरणक्ष (उदा., वायु प्रवाह) के कारण दो जांचों के बीच एक जंक्शन स्थापित करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ सकता है। एक अल्पकालिक समाधान टेपिंग की लंबाई को कम करने के लिए अंत के करीब सेल-चयन जांच के झुकने है। भविष्य के काम में पर्यावरणीय प्रभावों को कम करने के लिए सेटअप के महत्वपूर्ण भागों को संलग्न करने के लिए एक आवास का विकास शामिल है। किसी सेल से सेलकी सामग्री और अल्प अर्जन समय ($2-3 s) की सीमित मात्रा के कारण, एमएस/एमएस विश्लेषण केवल अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में प्रजातियों के लिए ही आयोजित किया जा सकता है। पता लगाने संवेदनशीलता को प्रभावित करने वाले अन्य कारकों में विस्तारित आयन स्थानांतरण टयूबिंग के माध्यम से सेल और संभावित आयन हानि के साथ मैट्रिक्स की शुरूआत के कारण दबा आयनन दक्षता शामिल है।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों दोनों निलंबन कोशिकाओं और सेल lysate प्रयोगों के लिए नमूना तैयारी के विकास में अपने काम के लिए नागा राम कोठापल्ली धन्यवाद. इसके अतिरिक्त, लेखकों NIH धन्यवाद (R01GM116116 और R21CA204706) धन के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetontrile Millipore Co. AX0145-1 Sampling solvent
CellTram Vario Eppendorf 6221 ICMP
Copper wire stores.ebay.com/jewelerheaven Dead soft, round, 20 guage, 25 ft Conductive union setup
Digital stereomicroscope Shenzhen D&F Co. Supereyes T004 Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µL Rochester Scientific 5065 Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" Friedrich & Dimmock, Inc. MBT-005-020-2Q Single-probe fabrication
Epoxy resin Devcon Part No. 20945 Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation system Eppendorf Transferman NK517800397-U.R. ICMP
External nut VALCO*CHEMINERT EN1 Ion transfer tube fabrication
Formic acid Sigma-Aldrich 399388-500ML Sampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm Polymicro Technologies TSP040105 Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm Polymicro Technologies 1068150015 Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) Fischer Sci SH3006603 Cell culture
Inline MicroFilter IDEX Health & Science LLC M-520 Conductive union setup
Laser puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 Single-probe fabrication
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment LY-C240 Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL Analysis
Microforge Narishige, Co. MF-9 Cell-selection probe fabrication
Microunion IDEX Health & Science LLC M-539 Conductive union
PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft IDEX Health & Science LLC 1576 Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft IDEX Health & Science LLC 1577 Conductive union setup
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies 15140-122 Cell culture
Petri dish, 35x10 mm VWR 25382-334 Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 0780-50L Cell culture
Platinum wire Narishige, Co. Model PT-A Microforge
Power supply Nikon PSM-2120 ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagro Corning 10-104-CV Cell culture
Single-bore tubes Boralex 5065 Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD IDEX Health & Science LLC VHP-200-01x Ion transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm IDEX Health & Science LLC U-1128 Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µL Hamilton 1725LTN250UL Sampling syringe
T25 flask CellStar 690160 Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective PB5500 Analysis
ThermoPlate TokaiHit 55R30N ICMP
TrypLE Express Gibco 12605-010 Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steel SUPELCO 58692-U Ion transfer tube fabrication
USB digital photography microscope dx.com SO2 25~500X Analysis
UV curing resin Prime Dental Item No. 006.030 Single-probe fabrication
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Cell-selection probe fabrication
Voltage housing PicoChip PCH-A00120 ICMP/MS interface
Wire cutter Craftsman 4 1/2 in end nipper Conductive union setup

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एकीकृत सेल हेरफेर मंच एकल निलंबन कोशिकाओं में दवाओं और चयापचयों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए एकल जांच के साथ युग्मित
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Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells. J. Vis. Exp. (148), e59875, doi:10.3791/59875 (2019).

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