Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Integrerad cell manipulation Platform tillsammans med Single-Probe för masspektrometri analys av droger och metaboliter i singel SUS pension celler

Published: June 21, 2019 doi: 10.3791/59875

Summary

En integrerad cell manipulation plattform är utvecklad för användning i samband med en enda sond masspektrometri setup för on-line analys av enskilda SUS pension celler under omgivnings förhållanden.

Abstract

Single cell masspektrometri (SCMS) möjliggör känslig detektering och noggrann analys av breda spektrum av cellulära arter på individ-cell nivå. Single-Probe, en Micro provtagning och jonisering enhet, kan kombineras med en masspektrometer för on-line, snabb SCMS analys av cellulära bestånds delar under omgivnings förhållanden. Tidigare användes Single-Probe SCMS-tekniken främst för att mäta celler immobiliserade på ett substrat, vilket begränsar de typer av celler för studier. I den aktuella studien, Single-Probe SCMS-teknik har integrerats med en cell manipulation system, som vanligt vis används för provrörsbefruktning. Denna integrerade cell manipulation och analys plattform använder en cell-urval sond för att fånga identifierade enskilda flytande celler och överföra cellerna till Single-sond spetsen för Micro Lys, följt av omedelbar masspektrometri analys. Denna infångnings-och överförings process avlägsnar cellerna från den omgivande lösningen före analysen, vilket minimerar introduktionen av mat ris molekyler i masspektrometrianalysen. Denna integrerade installation kan SCMS analys av riktade patientisolerade celler som finns i kropps vätskor prover (t. ex., urin, blod, saliv, etc.), vilket möjliggör potentiella tillämpningar av SCMS analys för Human medicin och sjukdoms bio Logi.

Introduction

Mänsklig biologi, särskilt sjukdoms bio logi, uppfattas i allt högre grad som ett resultat av aktiviteter på individ nivå, men de traditionella analys metoderna, såsom vätskekromatografimasspektrometri (LCMS), används i allmänhet för att analysera prover som framställts från populationer av celler, medan den förvärvade molekyl ära informationen inte korrekt kan representera de kemiska processerna på individ-cellnivå. Dessa standard, traditionella metoder är oförmögna att urskilja effekterna av cellulär heterogenitet på en analytisk mätning, och processen att förstöra och blanda cellerna för att förbereda lysat potentiellt leder till förändring eller förlust av cellulära komponenter1,2. Dessa begränsningar av traditionella metoder är särskilt viktiga i analysen av patient celler, där de erhållna proverna kan innehålla en komplex blandning av många olika cell typer. För att övervinna dessa brister, är encelliga molekyl ära analys metoder, inklusive Single cell masspektrometri (SCMS) metoder, alltmer utvecklas och tillämpas på bio analys, särskilt av cellulära metaboliter och låg molekyl vikt biomoleculer3,4.

Den första SCMS tekniker som utvecklats används vakuum-baserade tekniker för att utföra analyserna under icke-omgivande förhållanden2,5,6,7,8,9, 10,11. Icke-ambient SCMS tekniker kan analysera cellulära lipider och metaboliter, men kräver prov förbehandling under konstgjorda förhållanden, och därför är inte lämpliga för Real tids analys. Prov berednings processen för icke-ambient analys omfattar tillsats av mat ris komponenter, och denna beredning kan förändra cellulära komponenter från deras naturliga miljö12. Därför används ambient masspektrometri (MS) tekniker, som inte kräver ett vakuum för provtagning miljö, för att analysera celler i en nära-Native miljö. Att inte ha en vakuum miljö möjliggör mångsidighet i experimentell design; kameror kan läggas till för att övervaka den cellulära processen och mjukare joniseringstekniker kan kombineras med separations tekniker för att få bättre information från varje Single-cell experiment4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.

Den Single-Probe SCMS metoden är en omgivande teknik som analyserar levande, däggdjurs cancer cellinjer i en nära-Native miljö21,43,44,45,46. Dessutom har enheten med en sond använts för andra masspektrometriska tillämpningar, inklusive analys av extracellulära molekyler i multicellulära sfäroider och MS Imaging av vävnader47,48,49 ,50,51,52. Men eftersom cell immobilisering på substrat krävs för denna metod, SUS pensions celler kan inte analyseras direkt med denna teknik3,53. Därför kunde Single-Probe SCMS system inte direkt användas för att prova icke-anhängare enstaka celler, såsom icke-anhängare cellinjer eller SUS pension celler isolerade från patientens blod eller andra kropps vätskor54. I detta arbete är en integrerad cell manipulation plattform (ICMP) tillsammans med Single-Probe SCMS teknik för att analysera levande, SUS pension celler on-line med minimal prov beredning (figur 1)46. ICMP består av ett inverterat Mikroskop för att övervaka cell val, en sond för cell val av glas, en mikroinjektor för att fånga enskilda flytande celler, en uppvärmd platta för att bibehålla cellulär temperatur, två cell manipulation system för att kontrol lera rumsliga förflyttning av både sonden för val av glas cell och en enda sond, och ett digitalt mikroskop för att observera cell överföring från sond spetsen för cell urval till den enda sond spetsen. Tillverkningen av single-Probe är detaljerad i tidigare publikationer och kommer inte att behandlas här21,48. ICMP/Single-Probe systemet är kopplat till en hög upplöst masspektrometer. Denna integrerade installation möjliggör provtagning av identifierade enstaka celler från komplexa biologiska prover med minimala effekter från mat ris molekyler.

Protocol

1. sond tillverkning för val av glas celler

  1. Omvandla enkelborrade glas slangar till en avsmalnande sond med en vass spets.
    1. Placera ett glas rör med ett hål (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) i klämmorna på en vertikal pipetthållare, centrera glaset med avseende på värme spolen och dra åt för att säkra röret på plats. Värme batteriet består av en 18-gauge nickel-krom motstånd tråd (~ 60 mm lång) rullade runt en metall stav (diameter = 3,90 mm) 2,5 gånger.
    2. Ställ in glas slangen med temperatur program 19,5 (tillverkarens enhet). Den här parametern kan ändras för ett visst instrument.
    3. Ställ in magnet kolven på 4 (tillverkarens enhet). Den här parametern kan ändras för ett visst instrument.
    4. Utlös solenoiden för att dra glas slangen. Detta steg skapar två sonder smält på spetsen.
    5. Använd pincett för att klippa ~ 1 mm bort från spetsen på varje sond, vilket skapar en öppning av ~ 10 μm i diameter vid sond spetsen.
  2. Böj glas sonden för enkel koppling till ICMP/Single-Probe SCMS setup.
    1. Ställ en dragen glas sond i microforge, positionering spetsen ~ 3 mm ovanför platina värme tråden.
    2. Vrid värmen på platina tråden till 30% av den maximala temperaturen.
    3. Böj sonden ~ 45 ° från den ursprungliga positionen (figur 2).

2. integrerad cell manipulation plattform montering

  1. Placera det inverterade Mikroskop, mikroinjektor, och två cell manipulation system på ett motoriserat bord för enkel koppling med masspektrometer.
    1. Modifiera en om cell manipulationen systemen till inhysa en enkel-sond vid ersättande den ände med en arm klämma.
    2. Använd en plast spruta med en nål för att fylla mikroinjektorn med mineral olja. Undvik bubblor i slangen eftersom detta kommer att påverka suctioning.
    3. Byt ut steg insatsen på det inverterade mikroskopet mot den uppvärmda plattan. Ställ den uppvärmda plattan vid 37 ° c före analys.
  2. Ställ in enheten för cell val av glas.
    1. Sätt in sonden för cell val av glas inuti metall hållaren på mikroinjektorn genom att placera den långa (icke-böjda) sidan i kapillärhållaren och dra åt skruven för att fästa sonden på plats. Placera sond Spetsens vinkel parallellt med den uppvärmda plattan.
      Varning: glas sonden är mycket skarp och ömtålig, och den bryts lätt. Skydda dina ögon och vara extra försiktig när du sätter in sonden i microinjektor.
    2. Fäst metall hållaren på mikroinjektorn i cell manipulations systemet. Placera sond spetsen nära mitten av det inverterade Mikroskop ljuset.

3. skapa ett utökat Jon överförings rör för masspektromometerns inlopp

  1. Använd en metall fräs för att skära en bit av rost fritt stål slangar (OD: 0,0625 (1/16) i, ID: 0,021 i) ~ 250 mm i längd.
  2. Mät 135 mm från änden och placera en metall förvildade så ~ 135 mm kommer att utsättas för atmosfären och ~ 115 mm kommer att vara inne i masspektrometer. Säkra Feral med hjälp av två SKIFT nycklar för att dra åt den.

4. koppla ihop ICMP med en ensondinställning

  1. Fäst glas glaset som innehåller den enkla sonden i arm klämman på cell manipulations systemet.
    Obs: Single-sonder tillverkas enligt ett tidigare publicerat protokoll48 med två smärre förändringar i den aktuella studien: Nano-ESI emitter görs längre för enkel koppling till masspektrometer, och de enda sonderna är limmade till glaset sidan på höger sida för att undvika att störa den rumsliga förflyttningen av enheten för cell val av glas (figur 2).
  2. Anslut lösnings medlet-som ger kapillär till en ledande förening genom att placera kapillär i hylsan (1/16 x .005 i) av plast hylsan och finger-åtdragning tillbehöret.
    1. Anslut den andra sidan av den ledande föreningen till en kapillär (ID: 40 μm, OD: 150 μm), som är ansluten till en spruta som innehåller provtagning lösnings medel, genom att placera kapillär i hylsan (1/32 x .007 i) och åtdragning av tillbehöret. Använd acetonitril med 0,1% myrsyra som provtagnings vätska i dessa experiment.
      Anmärkning: provtagnings vätskan är flexibel, men den bör i första hand innehålla acetonitril (eller acetonitril med myrsyra för bättre jonisering) för en snabb mikroskalscell Lys.
    2. Fäst sprutan i sprutpumpen på masspektrometer.
    3. Placera joniseringsspänningssladden på en koppar tråd som fästs vid den ledande föreningen.
  3. Placera nano-ESI-sändaren ~ 1 mm till öppningen på det utökade Jon överförings röret.
    1. Använd cell manipulations systemet för att kontrol lera de rumsliga rörelserna hos Single-Probe och placera nano-ESI-sändaren centralt framför den utökade Jon överförings slangen.

5. suspenderad cell prov beredning

  1. Dagen före analys (~ 18-24 h), frö ut celler för testning i en cell kulturkolv (T25). K562 humana myeloida leukemiceller används som modeller i denna studie.
    1. Värm 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium kompletterat med 10% syntetiskt fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° c i 30 min.
    2. Seed ~ 1 x 106 celler i en total volym av 10 ml genom att kombinera celler med varmt medium. Använd i allmänhet en 10 mL pipett för att placera 8 mL RPMI-medium i en cellkulturkolv. Använd sedan en 2 ml pipett för att sätta 2 ml konfluenta K562 celler mediet för ~ 1 x 106 celler.
    3. Inkubera cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 fram till analysen.
  2. Förbered cellerna för analys.
    1. Pipettera cellerna från cell odlings kol ven till ett 15 mL centrifugerör.
    2. Snurra cellerna ner vid 400 x g och 37 ° c i 5 min och Kassera supernatanten.
    3. Omsuspendera cellerna i 4 mL RPMI-medium som innehåller läkemedels substansen vid önskad behandlings koncentration.
      Anmärkning: för analys av kontroll celler, omsuspendera cellerna i 4 mL RPMI-medium och hoppa till steg 6.
    4. Inkubera cellerna under behandlings tiden vid 37 ° c och 5% CO2.
    5. Snurra cellerna ner vid 400 x g och 37 ° c i 5 min. aspirera supernatanten.
    6. Cellerna resuspenderas i 10 mL PBS och centrifugera vid 400 x g och 37 ° c i 5 min. Kassera supernatanten efter spinning. Upprepa detta steg 3 gånger för att minimera upptäckten av läkemedel från extracellulära bestånds delar.
    7. Omsuspendera cellerna i 4 mL PBS för analys.

6. utför SCMS-mätningar med hjälp av ICMP/Single-Probe setup

  1. Anpassa parametrar för masspektrometer för experimentet.
    1. Välj definiera skanningunder rubriken skannings läge på instrumentets program vara. Använd en upplösning på 60 000 m/∆ m vid m/z 400, 1 microscan, 100 ms maximal injektions tid och automatisk förstärknings kontroll (AGC) på. Ett Mass intervall (m/z) på 100-1000 utnyttjades för experimenten. Parametrarna kan ändras baserat på instrument modellen.
    2. Under sprutpump, Välj en flödes hastighet på 150 nl/min. flödes hastigheten måste optimeras för varje experiment.
    3. Välj NSI source och tillämpa en spänning på ~ 4,5 kV. Den här parametern måste också optimeras för varje experiment.
  2. Slå på det inverterade mikroskopet (med 40x förstoring valt för både den övre plattan och botten linsen) och Anslut den till USB-porten på en bärbar dator för att fånga live-video-feeds. Slå på den uppvärmda plattan och Ställ in den på 37 ° c.
  3. Gå till fliken Hämta data på datorn och välj kontinuerligt under Hämta tid.
  4. Förbered provet för analys.
    1. Pipettera 2-3 mL av provet i locket på en liten petriskål (35 mm x 12 mm).
    2. 6.4.2 Placera provet i mitten av ljuset från det inverterade mikroskopet ovanpå den uppvärmda plattan.
  5. Förbered glaset cell urvals sonden för analys. Använd cell manipulation systemet för att flytta sonden så dess spetsen är fokuserad under inverterade Mikroskop i samma plan som cellerna.
  6. Välj en enskild cell för analys.
    1. Använd cell manipulation systemet för att flytta cell markeringen sond spetsen till en riktad cell. Denna process övervakas med hjälp av inverterat Mikroskop.
      Obs: om spetsen på cell markerings sonden inte kan fokuseras i samma plan som cellerna, är det möjligt att den böjda delen av sonden inte är korrekt vinklad. Justera positionen för cell markerings sonden tills båda sond spetsarna kan fokuseras tillsammans med celler under mikroskopet.
    2. Vrid försiktigt handtaget på mikroinjektorn för att justera placeringen av mineral oljan inuti slangen. En mild sugning tillhandahålls av mikroinjektorn för att säkra den riktade cellen till cell-urval sond spetsen.
      Anmärkning: om cellen inte kan fångas upp av cell urvals sonden genom sug kraften, kontrol lera cell urvals sonden för att säkerställa att den är helt insatt i kapillärhållaren. Dessutom inspektera mineral olja nivåer i mikroinjektor och slangar, och utvisa luft om det finns någon.
    3. Använd cell manipulation systemet för att flytta cellen vid cell-markeringen sond spetsen till Single-sond spetsen, med hjälp av ett digitalt mikroskop fokuserat på Single-sond spetsen för att övervaka denna process. Vid beröring, en liten acetonitril droplet vid Single-sond spetsen inducerar en snabb lyserar av cellen, och sedan cell lysate omedelbart joniseras för on-line MS analys.
      Anmärkning: eftersom den valda cellen är säkrad till cell-markeringen sond spetsen genom en skonsam sugning, kan denna cell potentiellt lossas under dess överföring till Single-Probe spets. Därför, om Jon signaler av typiska cellulära lipider (se representativa resultat nedan) inte observeras inom 5 s, det är möjligt att cellen blev utan fäste, och valet av en annan cell behövs.

Representative Results

Först, obehandlade K562 celler används för att fastställa den experimentella metoden. I en typisk SCMS experiment, uppenbara förändringar av massa spektra kan observeras från att överföra en cell, under upptäckten av cellulära innehåll, och efter avslutad mätningen (figur S1). Tre vanliga cellulära lipidtoppar (fosfatidylkolin, PC), inklusive PC (34:4) (m/z 754,536), PC (36:4) (m/z 782,567), och PC (38:5) (m/z 808,583), övervakas för att säkerställa att cellen överförs framgångs rikt och cellulära innehållet detekteras (figur S2)21,43,46,55,56. Om lipidtoppar inte ses inom 5 s, är mineral olje nivån i microinjektorn ändras för att minska sug hålla cellen vid cell-urval sond spetsen; försiktighet måste iakttas så att ingen mineral olja trycks ut från cell urvals sonden. Identiteten för många datorer i massa intervallet m/z 750-850 bekräftas med MS/MS på obehandlade celllysat prover (figur 3, figur S2, tabell 1)46.

K562 celler utsätts också för behandling med olika läkemedels föreningar för att utöka mångsidigheten hos metoden. K562-celler inkuberas med gemcitabin (1 μM) och Taxol (1 μM) för 1 h och OSW-1 (100 nM, 1 μM) i 4 h respektive 2 h. Cellerna tvättas sedan med PBS för att minimera upptäckten av läkemedels föreningar från extracellulära innehåll. Matrisens bidrag (t. ex. joner från cell odlings mediet, PBS och lösnings medel) till Mass spektrum av cellulära innehåll kan elimineras genom data subtraktion, på grund av deras signifikant olika Jon signaler (figur S3). Alla tre läkemedels föreningarna detekteras med hjälp av ICMP/Single-Probe MS Setup (figur S4)46. Dessa resultat tyder på att denna metod kan användas för att studera intracellulära lipider, droger, och metaboliter på encellig nivå från celler i lösning i en nära-Native miljö.

Figure 1
I figur 1. Experimentell inställning för enstaka SUS pension cell MS experiment. (A) den integrerade cell manipulations PLATTFORMEN (ICMP) tillsammans med en masspektrometer. (B) Schematisk för analys av suspenderade celler. (C) experimentell vy av K562 celler som skall väljas med hjälp av cell urvals sonden. Omtryckt med tillstånd från Standke et al.46. Copyright 2019 amerikanska kemiska föreningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
I figur 2. Bilder av en modifierad singel-sond och en cell-urval sond används för enstaka SUS pension cell MS experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
I figur 3. Inzoomat Mass spektrum från en enda cell som visar den representativa arten (m/z 750-850). Kemiska strukturer bekräftas med MS/MS-analys (figur S1). Omtryckt med tillstånd från Standke et al46. Copyright 2019 amerikanska kemiska föreningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Läkemedels molekyl* m/z Mass fel (ppm)
[Gemcitabin + H] + 264,076 11,32
[Taxol + na] + 876,318 2,74
[OSW-1 + na] + 895,445 0,89
Cellulära lipider
[PC (34:4) + H] + 754,535 3,71
[PC (34:3) + H] + 756,551 3,44
[PC (34:2) + H] + 758,569 0,66
[PC (36:5) + H] + 780,551 3,07
[PC (36:4) + H] + 782,568 2,17
[PC (36:3) + H] + 784,585 0,64
[PC (38:7) + H] + 804,551 4,1
[PC (38:6) + H] + 806,567 2,48
[PC (38:5) + H] + 808,583 2,72
[PC (38:4) + H] + 810,601 0
[PC (40:7) + H] + 832,583 3,12

I tabell 1. Identifierade cellulära komponenter med hjälp av ICMP/Single-Probe setup. Upptäckten av alla läkemedels substanser bekräftades genom att jämföra MS/MS-resultaten med standard sammansättningen.

Discussion

Den integrerade cell manipulation och analys plattform är konstruerad för att utöka mångsidigheten hos Single-Probe MS-metoden, vilket möjliggör on-line, snabb analys av icke-anhängare celler i en nära-Native miljö. En stor fördel med tekniken är att minimal prov beredning krävs, så att cellerna analyseras under förhållanden som efterliknar deras standard tillstånd. Särskilt kan enskilda celler av intresse identifieras visuellt och väljas, vilket minimerar påverkan av mat ris effekten på MS joniseringseffektivitet samtidigt som cellerna bibehålls i sin naturliga miljö, så resultaten är mer representativa celler infödda status (figur S3). Denna teknik kan potentiellt användas för att studera patient celler suspenderade i biofluider i framtida studier. En annan fördel med denna teknik är det flexibla urvalet av provtagnings vätskan. Det är viktigt att inkludera acetonitril som huvud provtagning lösnings medel så att mikroskala Lys kan inträffa snabbt. Eventuellt kan interna standarder (t. ex. isotopiskt märkta läkemedels föreningar) tillsättas i provtagnings vätskan för kvantifiering av molekyler av intresse (t. ex. läkemedels molekyler) från enskilda celler, inklusive sådana som kan spela en nyckel roll för att revolutionera anpassa läkemedels behandlingar i framtiden54.

Även om detta integrerade system praktiskt kan användas för att analysera breda cell områden, är en begränsning av metoden att varken Single-Probe eller cell urvals sonden är kommersiellt tillgänglig. dikterar behovet av optimering av många parametrar (t. ex. flödes hastighet, spänning, längd mellan nano-ESI-sändare och Jon överförings slang, etc.) före varje experiment. Dessutom, på grund av den litenhet av single-Probe och cell-selektion sond, miljö störningar (t. ex. luft flöde) kan resultera i svårigheter att upprätta en korsning mellan de två sonderna. En kortsiktig lösning är böjning av cell-selektion sonden nära änden för att minimera längden på avsmalnande. I det framtida arbetet ingår att utveckla ett hölje för att omsluta de kritiska delarna av installationen för att minimera miljö påverkan. På grund av den begränsade mängden cellulära innehåll och kort förvärvs tid (~ 2-3 s) från en cell, MS/MS-analys kan endast utföras för relativt rikligt arter. Andra faktorer som påverkar detektions känsligheten är bland annat den undertryckta joniseringseffektiviteten på grund av införandet av matris tillsammans med cellen och potentiell Jon förlust genom den utökade Jon överförings slangen.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Naga Rama Kothapalli för hennes arbete med att utveckla prov preparering för både SUS pensions celler och celllysat experiment. Dessutom författarna tackar NIH (R01GM116116 och R21CA204706) för finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetontrile Millipore Co. AX0145-1 Sampling solvent
CellTram Vario Eppendorf 6221 ICMP
Copper wire stores.ebay.com/jewelerheaven Dead soft, round, 20 guage, 25 ft Conductive union setup
Digital stereomicroscope Shenzhen D&F Co. Supereyes T004 Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µL Rochester Scientific 5065 Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" Friedrich & Dimmock, Inc. MBT-005-020-2Q Single-probe fabrication
Epoxy resin Devcon Part No. 20945 Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation system Eppendorf Transferman NK517800397-U.R. ICMP
External nut VALCO*CHEMINERT EN1 Ion transfer tube fabrication
Formic acid Sigma-Aldrich 399388-500ML Sampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm Polymicro Technologies TSP040105 Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm Polymicro Technologies 1068150015 Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) Fischer Sci SH3006603 Cell culture
Inline MicroFilter IDEX Health & Science LLC M-520 Conductive union setup
Laser puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 Single-probe fabrication
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment LY-C240 Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL Analysis
Microforge Narishige, Co. MF-9 Cell-selection probe fabrication
Microunion IDEX Health & Science LLC M-539 Conductive union
PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ft IDEX Health & Science LLC 1576 Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ft IDEX Health & Science LLC 1577 Conductive union setup
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies 15140-122 Cell culture
Petri dish, 35x10 mm VWR 25382-334 Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 0780-50L Cell culture
Platinum wire Narishige, Co. Model PT-A Microforge
Power supply Nikon PSM-2120 ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagro Corning 10-104-CV Cell culture
Single-bore tubes Boralex 5065 Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD IDEX Health & Science LLC VHP-200-01x Ion transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm IDEX Health & Science LLC U-1128 Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µL Hamilton 1725LTN250UL Sampling syringe
T25 flask CellStar 690160 Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective PB5500 Analysis
ThermoPlate TokaiHit 55R30N ICMP
TrypLE Express Gibco 12605-010 Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steel SUPELCO 58692-U Ion transfer tube fabrication
USB digital photography microscope dx.com SO2 25~500X Analysis
UV curing resin Prime Dental Item No. 006.030 Single-probe fabrication
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Cell-selection probe fabrication
Voltage housing PicoChip PCH-A00120 ICMP/MS interface
Wire cutter Craftsman 4 1/2 in end nipper Conductive union setup

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111 (2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445 (2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101 (2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891 (2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201 (2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT - Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981 (2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173 (2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6545 LP-6550 (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911 (2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Tags

Kemi singel cell masspektrometri SUS pensions celler integrerad cell manipulation plattform Single-Probe omgivande jonisering Micro provtagning
Integrerad cell manipulation Platform tillsammans med Single-Probe för masspektrometri analys av droger och metaboliter i singel SUS pension celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Standke, S. J., Colby, D. H.,More

Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells. J. Vis. Exp. (148), e59875, doi:10.3791/59875 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter