Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59876
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol isoleert extracellulaire blaasjes (Ev's) uit de buurt van virionen met hoge efficiëntie en opbrengst door het opnemen van EV-neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en deeltjes opname om een gestroomlijnde workflow en een reductie van start volume vereisten, resulterend in reproduceerbare preparaten voor gebruik in alle EV-onderzoek.

Abstract

Een van de belangrijkste obstakels op het gebied van extracellulair blaasje (EV) onderzoek vandaag is het vermogen om gezuiverde EV preparaten in een virale infectie setting te bereiken. De gepresenteerde methode is bedoeld om EVs uit de buurt van virionen (d.w.z. HIV-1) te isoleren, waardoor een hogere efficiëntie en opbrengst mogelijk is in vergelijking met conventionele ultracentrifugingsmethoden. Ons protocol bevat drie stappen: EV neerslag, dichtheidsgradiënt scheiding en deeltjes opname. Downstream assays (d.w.z. Western Blot en PCR) kunnen direct na het vastleggen van deeltjes worden uitgevoerd. Deze methode is voordelig ten opzichte van andere isolatie methoden (d.w.z. ultracentrifugatie) omdat het gebruik van minimale start volumes mogelijk maakt. Bovendien is het gebruiksvriendelijker dan alternatieve EV-isolatie methoden waarvoor meerdere ultracentrifugingsstappen nodig zijn. De gepresenteerde methode is echter beperkt in de reikwijdte van functionele EV-testen, omdat het moeilijk is om ongeschonden EVs uit onze deeltjes te eldelen. Bovendien is deze methode afgestemd op een strikt op onderzoek gebaseerde instelling en zou deze niet commercieel levensvatbaar zijn.

Introduction

Onderzoek gecentreerd rond extracellulaire blaasjes (Ev's), in het bijzonder exosomen, een type EV variërend van 30-120 nm en gekenmerkt door de aanwezigheid van drie tetraspanin markers CD81, CD9 en CD63, is grotendeels gevormd door de ontwikkeling van methoden om te isoleren en Reinig de blaasjes van belang. De mogelijkheid om veelzijdige mechanismen te ontleden is belemmerd vanwege complexe en tijdrovende technieken die monsters genereren die bestaan uit een heterogene populatie van blaasjes die via verschillende trajecten worden gegenereerd met een breed scala aan inhoud, maten en Dichtheden. Hoewel dit een probleem is voor bijna alle EV-onderzoek, is het van bijzonder belang bij het bestuderen van EVS in de context van virale infectie, omdat virionen en virusachtige deeltjes (vlp's) vergelijkbaar in diameter kunnen zijn voor de blaasjes van belang. Zo is het humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) ongeveer 100 nm in diameter, wat ongeveer even groot is als vele soorten Ev's. Om deze reden hebben we een nieuwe EV-isolatie workflow ontworpen om deze problemen aan te pakken.

De huidige gouden standaard van EV-isolatie is ultracentrifugatie. Deze techniek maakt gebruik van de verschillende blaasje dichtheden, waardoor de blaasjes kunnen worden gescheiden door centrifugeren met differentiële sedimentatie van hogere dichtheids deeltjes versus lagere dichtheids deeltjes in elke fase 1,2. Er zijn verschillende stappen voor het centrifugeren van lage snelheid vereist om intacte cellen te verwijderen (300-400 x g gedurende 10 min), celresten (~ 2.000 x g gedurende 10 min) en apoptotische lichamen/grote blaasjes (~ 10.000 x g gedurende 10 min). Deze initiële zuiveringen worden gevolgd door ultrasnelle ultracentrifugatie (100000-200000 x g voor 1.5-2 h) aan sediment EVS. Wasstappen worden uitgevoerd om de zuiverheid van de EV verder te waarborgen, maar dit resulteert in de vermindering van het aantal geïsoleerde ev's, waardoor de totale opbrengst 3,4wordt verlaagd. Het nut van deze methode wordt verder beperkt door de eis van een groot aantal cellen (ongeveer 1 x 108) en een groot monstervolume (≫ 100 ml) om adequate resultaten te bereiken.

Om de toenemende bezorgdheid aan te pakken, is het neerslaan van blaasjes met hydrofiele polymeren de laatste jaren een nuttige techniek geworden. Polyethyleenglycol (PEG), of andere verwante precipitatie reagentia, stelt de gebruiker in staat om de vesicles, virussen en eiwitten-of proteïne-RNA-aggregaten binnen een monster te trekken door simpelweg het monster met het reagens naar keuze te inbroed, gevolgd door een enkele lage-snelheid centrifugeren1,2,5. We hebben eerder gemeld dat het gebruik van PEG of gerelateerde methoden om EVs te precipderen in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie resulteert in een significant hogere opbrengst6. Deze strategie is snel, eenvoudig, vereist geen extra dure apparatuur, is gemakkelijk schaalbaar en behoudt de EV-structuur. Vanwege de promiscue aard van deze methode bevatten de resulterende monsters een verscheidenheid aan producten, waaronder vrije eiwitten, eiwitcomplexen, een reeks Ev's en virionen, waardoor verdere zuivering nodig is om de gewenste populatie te verkrijgen1 ,2,7,8.

Om de heterogeniteit van de uit verschillende neerslag methoden verkregen EVs te overwinnen, wordt dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DG) gebruikt om deeltjes beter te scheiden op basis van hun dichtheid. Deze methode wordt uitgevoerd met behulp van een stapsgewijze helling met behulp van een dichtheidsgradiënt medium, zoals iodixanol of sucrose, die de scheiding van EVs van eiwitten, eiwitcomplexen en virus-of virusachtige deeltjes (Vlp's) mogelijk maakt. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel er ooit werd gedacht dat DG een preciezere scheiding van EV-subpopulaties toeliet, het nu bekend is dat maten en dichtheden van verschillende blaasjes elkaar kunnen overlappen. Exosomen zijn bijvoorbeeld gekend om flotatie dichtheden van 1,08-1.22 g/ml9te hebben, terwijl blaasjes geïsoleerd van de Golgi (Copi+ of clathrin+) een dichtheden van 1.05-1.12 g/ml en die van het endoplasmische reticulum (copii+ ) sediment bij 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Bovendien, indien men exosomale fracties wil vergelijken tegen fracties die virale deeltjes bevatten, kan dit, afhankelijk van de dichtheid van het virus van belang, moeilijker worden — er zijn andere virussen dan HIV-1 die waarschijnlijk op hetzelfde dichtheden als exosomale positieve fracties2.

Tot slot is de verrijking van EV-Preps voor downstreamvisualisatie en functionele assays van vitaal belang voor EV-onderzoek. Het gebruik van EV-verrijkende nanodeeltjes, met name multi-functionele hydrogelpartikels met een diameter van 700-800 nm, is een cruciale stap in het bereiken van geconcentreerde EV-Preps. Ze bezitten een aromatische aas met een hoge affiniteit die is ingekapseld door een poreuze buitenste zeef schaal om selectiviteit te bevorderen. De nanodeeltjes die in deze studie worden gebruikt, omvatten twee verschillende preparaten met verschillende kern loten (reactieve rode 120 NT80; en Cibacron blauw F3GA NT82) die hebben aangetoond dat de inname van EVs uit verschillende reagentia en biovloeistoffen toeneemt (Zie de tabel met materialen )6,10,11,12,13,14,15. De deeltjes bieden een eenvoudige verrijking van EVS uit talrijke uitgangsmaterialen, waaronder iodixanol-fracties, supernatant van de celcultuur, evenals biovloeistoffen van patiënten zoals plasma, serum, cerebrale spinale vloeistoffen (CSF) en urine6,13 .

De hier gepresenteerde methode verbetert de efficiëntie van de huidige EV-zuiverings technieken door verschillende technologieën te combineren; EV neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, en deeltjes opname, om de workflow te stroomlijnen, monster vereisten te verminderen en de opbrengst te verhogen om een meer homogene EV-sample te verkrijgen voor gebruik in alle EV-onderzoek. Deze methode is met name nuttig bij het onderzoek naar EVs en de inhoud ervan tijdens virale infectie, omdat het een filtratie stap van 0,22 μm bevat om grote, ongewenste blaasjes en Vlp's uit te sluiten en de totale EV-populatie te scheiden op basis van dichtheid om effectief Isoleer EVs uit virionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. filtratie en precipitatie van extracellulaire blaasjes (Ev's)

  1. Ter voorbereiding van de kweek supernatant van besmette of getransformuteerde cellen (d.w.z. cellijnen en/of primaire cellen), kweek ongeveer 10 mL laat-log cellen gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2 in een geschikt kweekmedium (D.W.Z. RPMI of DMEM met 10% foetale runderen serum [FBS]).
    Opmerking: Alle reagentia voor kweekmedium moeten vrij zijn van EVs en kunnen ofwel worden aangekocht (Zie tabel met materialen) of in eigen huis worden bereid door pre-ultracentrifugatie van serum bij 100.000 x g gedurende 90 min. Dit protocol is succesvol geweest voor verschillende veelgebruikte cellijnen, waaronder: CEM, Jurkat, 293T, U937 (niet-geïnfecteerde lijnen), U1, J 1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 en HTLV-1 geïnfecteerde lijnen), meerdere getransfunteerde cellen en primaire myeloïde en T-cellen (beide geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde); Dit protocol kan echter worden gebruikt voor elk celtype, met inbegrip van die die gespecialiseerde media of cultuur voorwaarden vereisen. De dichtheid van cellen moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen. Het wordt aanbevolen dat de hoogste dichtheid na 5 dagen met minimale celdood wordt gebruikt.
  2. Centrifugeer de kweek op 3.000 x g gedurende 5 minuten tot pellet cellen en gooi de pellet weg.
  3. Filtreer de kweek supernatant met een steriel 0,22 μm filter en verzamel filtraat in een schone buis.
  4. Voeg gelijk volume PEG precipitatie reagens (1:1 ratio) toe aan gefilterde supernatant. Inverteer buis meerdere malen om een homogeen mengsel te garanderen.
    Opmerking: Niet Vortex.
  5. Incubate mengsel bij 4 °C 's nachts (O/N).
  6. Centrifuge mengsel bij 1.500 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) om een HETEROGENE EV pellet te leveren.
    Opmerking: EV pellet moet wit of gebroken wit in kleur verschijnen.
  7. Gooi de verarmd cultuur supernatant weg.
  8. Rebreng de EV pellet in 150 – 300 μL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS) en blijf op ijs.

2. constructie van een dichtheidsgradiënt

  1. Meng jodixanol-dichtheidsgradiënt medium met 1x PBS om 11 verschillende dichtheids fracties van 1 mL te maken van 6 tot 18% iodixanol in stappen van 1,2% in afzonderlijke micro centrifugebuizen, zoals weergegeven in Figuur 1a.
  2. Vortex elke buis te mengen.
  3. Laag dichtheids fracties in een voorgereinigde en droge swingende emmer ultracentrifuge buis beginnend met breuk #18 en eindigend met breuk #6 zoals aangegeven in Figuur 1b.
    Opmerking: Alle buizen moeten worden gezuiverd met behulp van een 10% bleekmiddel spray gevolgd doorspoelen 3x met gedeïoniseerd water en een laatste wassen van steriel gedeïoniseerd water vóór het laden van de gradiënt fracties.
  4. Voeg geresuspendeerde EV pellet (300 μL) toe aan de bovenkant van de gelaagde gradiënt in de ultracentrifuge buis.
  5. Ultracentrifuge bij 100, 00 x g bij 4 °c gedurende 90 min.
  6. Verwijder voorzichtig de 1 mL fracties uit de ultracentrifuge buis en breng elke fractie over in nieuwe micro centrifugebuizen.

3. verrijking van de EV-fracties uUsing nanodeeltjes

  1. Maak een 30% slurry van nanodeeltjes met gelijke volumes NT80, NT82 en 1x PBS.
    Opmerking: Het mengsel moet voorafgaand aan het gebruik worden getexed om de homogeniteit te waarborgen.
  2. Voeg 30 μL van de slurry toe aan elke micro centrifugebuis met de dichtheids fracties en pipet/Inverteer ze meerdere malen om te mengen.
  3. Draai EV-verrijkende nanodeeltjes-bevattende dichtheids fractie micro centrifugebuizen O/N bij 4 °C bij ongeveer 20 TPM.
  4. Centrifugeer dichtheids fractie micro centrifugebuizen bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  5. Gooi de vloeistof weg en was EV pellet twee keer met 1x PBS.
    Opmerking: Nanodeeltjes pellets kunnen worden bevroren bij-20 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor verschillende downstream testen (d.w.z. PCR, Western Blot, massaspectrometrie, en andere testen).

4. Aanbevolen bereiding van nanodeeltjes pellet voor downstream assays

  1. Voor RNA-isolatie
    1. Respendeer de pellet in 50 μL geautoclaveerd gedeïoniseerd water, behandeld met 0,001% diethylpyrocarbonaat (DEPC) gefilterd door een 0,2 μm filter en isolaat RNA volgens het Protocol van de fabrikant van de kit.
  2. Voor gel elektroforese
    1. Rebreng de pellet direct in 15 μL Laemmli buffer.
    2. Warmte monster 3x bij 95 °C gedurende 3 min. Vortex zachtjes en spin naar beneden tussen elke warmte cyclus.
    3. Centrifugeer het monster voor 15 sec. bij 20.000 x g en laad al het geeleerde materiaal direct op de gel.
      Opmerking: voor de beste resultaten, beperk de hoeveelheid deeltjes geladen op de gel en voer de gel op 100 V om ervoor te zorgen dat eventuele resterende deeltjes zijn opgenomen in de putten.
  3. Voor trypsine spijsvertering
    1. Respendeer de pellet in 20 μL ureum vóór alkylatie en trypsinoisatie van het monster. Nanodeeltjes kunnen worden gepelleteerd door een 14.000 x g centrifugeren bij RT gedurende 10 min. monster met de trypsinized peptide kan worden overgebracht in een schone opvang buis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PEG-neerslag verhoogt de EV-opbrengst
Onze combinatie benadering van EV-isolatie is aanzienlijk efficiënter in termen van EV-terugwinning in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie, zoals blijkt uit de reductie van 90% in het volume van het benodigde startmateriaal. Ultracentrifugatie, de huidige gouden standaard in EV-isolatie, vereist ongeveer 100 mL cultuur supernatant om een adequate EV-prep voor downstream-assays te produceren, terwijl ons nieuwe protocol slechts 10 mL vereist. Deze reductie wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van de PEG EV precipitatie reagens die een significante stijging van de EV-opbrengst oplevert, gemeten door nano Tracking Analysis (NTA). De resultaten in Figuur 2a, die eerder zijn gepubliceerd6, geven aan dat bij het gebruik van 10 ml van de cultuur supernatant Peg precipitatie resulteerde in het herstel van 7,27 x 1010 evs, die was ongeveer 500-fold meer dan het aantal van EVs van hetzelfde uitgangsmateriaal met behulp van ultracentrifugatie (1,45 x 108). Verhoogde efficiëntie van de isolatie van exosomen, een specifieke EV subtype, werd ook waargenomen door verhoogde niveaus van goed gekarakteriseerde exosome marker eiwitten, CD81, CD63, en CD9. Analyse van Western Blot vergelijking van EV-Preps geproduceerd door ultracentrifugatie of EV-neerslag met behulp van een PEG-precipitatie reagens wordt weergegeven in Figuur 2b. Deze resultaten tonen een 3.000-voudige toename van CD81, een 4-voudige toename van CD63, en een 40-voudige toename van CD9 zoals gemeten door densitometrie analyse. Samen worden deze resultaten gesuggereerd dat het uitgestippelde protocol niet alleen het totale rendement van de EV verhoogt, maar ook het herstel van exosomen verbetert in vergelijking met ultracentrifugatie.

Karakterisering van EVs en scheiding van EVs uit de buurt van HIV-1-virus
Om de in elke fractie aanwezige blaasjes te karakteriseren na verrijking met nanodeeltjes, werden EVS geïsoleerd van niet-geïnfecteerde Cem of met HIV-1 geïnfecteerde U1-celkweek supernatant met behulp van het beschreven protocol en gekarakteriseerd met behulp van Western Blot van elke uit nanodeeltjes verrijkte iodixanolfractie. De gegevens in Figuur 3a tonen onze eerder gepubliceerde resultaten die de aanwezigheid of afwezigheid van drie exosomale tetraspaninen (CD81, CD63 en CD9) in elke fractie aantonen (Cem-cellen; bovenste paneel). De resultaten duiden erop dat exosomen, zoals gedefinieerd door de aanwezigheid van alle drie de tetraspanen binnen de Fractie, in drie verschillende populaties worden aangetroffen: Exo #1 met breuken 10,8-12.0, Exo #2 met breuken 15,6-16,8 en exo # 3, inclusief alleen de 18,0 Fractie. Ondanks de aanwezigheid van drie verschillende bevolkingsgroepen kan het protocol de mogelijkheid van de aanwezigheid van extra soorten Ev's binnen elke fractie niet uitsluit. Bovendien sluiten deze resultaten niet definitief uit dat er blaasjes zijn in deze populaties die positief zijn voor een combinatie van de geteste tetraspanin markers. Deze Ev's kunnen dan verder worden gescheiden door aanvullende zuiverings strategieën.

Het snel ontwikkelende gebied van EV/exosome onderzoek is geëxplodeerd sinds hun ontdekking en heeft geresulteerd in vele nieuwgevonden functies en toepassingen voor deze blaasjes. In het bijzonder, hun rol als intracellulaire boodschappers in niet alleen normale fysiologie, maar ook in ziekte heeft geleid tot het gebruik van belangrijke middelen om de effecten en het nut van extracellulaire blaasjes te ontleden, specifiek exosomes, op de ontvangende cellen16 , 17 , 18. in talrijke studies zijn EVS betrokken bij de pathogenese van verschillende infecties, waaronder HIV-16,10,12,19,20,21 , 22. de gelijkenis tussen EVS en virionen vormt echter een potentiële belemmering bij de bepaling van deze door EV gemedieerde mechanismen. Om deze bezorgdheid aan te pakken, hebben we ons protocol ontworpen om een dichtheidsgradiënt te implementeren om de EV-populaties effectief van virions te scheiden. Daartoe werden de celkweek supernatant van HIV-1 geïnfecteerde cellen onderworpen aan het gepresenteerde protocol en geanalyseerd door Western Blot voor de aanwezigheid van HIV-1 gag p24 om te bepalen welke fractie of fracties HIV-1-virionen bevatte. De resultaten getoond in Fig. 3a (middelste paneel) toont de lokalisatie van p24 in drie onafhankelijke omstandigheden: bij afwezigheid van een inductor, in aanwezigheid van een inductor (Phorbol 12-Myristate 13-acetaat; PMA), en in aanwezigheid van PMA en antiretrovirale combinatietherapie (cART), de standaardbehandeling voor HIV-1. Deze gegevens duiden erop dat het HIV-1-virus is gelokaliseerd in breuk 16,8, gemeten door de aanwezigheid van p24 en de niet-gespleten poly proteïne Pr55. Bovendien, wanneer cellen worden onderworpen aan kar, waaronder indinavir, een proteaseremmer die het decolleté van Pr55 voor p24 voorkomt, werd geen p24 gedetecteerd in een fractie. In plaats daarvan werd alleen Pr55 gedetecteerd en was aanwezig in de 16,8-18.0 fracties, wat duidt op een verschuiving van het virus in meer dichte fracties. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met behulp van primaire macrofagen (onderste paneel). Hoewel het beschreven protocol resulteert in de co-sedimentatie van Exo #2 en exo #3 populaties met virus, bleef de Exo-#1 populatie (breuken 10,8-12,0) virusvrij, waardoor downstream-testen vrij van virus verontreiniging mogelijk waren.

Dit type van scheiding van virus weg van EVs stelt ons in staat om de mogelijkheid van stukjes virus invoeren EVs of wordt uitgescheiden uit geïnfecteerde cellen als vrije eiwitten. De resultaten in Figuur 3b geven aan dat het HIV-1 NEF-eiwit in de Exo #1 populatie kan worden aangetroffen, naast de populaties Exo #2 en exo #3. NEF verschijnt ook in de 6,0-Fractie, wat aangeeft dat NEF mogelijk kan worden afgescheiden van geïnfecteerde cellen als een vrij eiwit en binnen een EV. Bovendien wordt HIV-1 VPR-eiwit aangetroffen in de 6,0 Fractie, terwijl HIV-1 tat eiwit overwegend in de 6,0 fractie wordt aangetroffen, maar ook in fracties 7.2-9,6. We testen momenteel alle fracties voor de aanwezigheid van TAT Protein door ELISA. Deze resultaten geven aan dat zowel tat en VPR kunnen worden uitgescheiden uit geïnfecteerde cellen, waarschijnlijk als vrije eiwitten, terwijl tat kan ook worden opgenomen in EVs. Collectief wijzen deze gegevens erop dat onze methode van EV-isolatie exosomen (Exo #1) met succes kan isoleren van HIV-1-virionen (exo #2 en #3) en dat EVS uit HIV-1-geïnfecteerde cellen sommige HIV-1-eiwitten bevatten, die de HIV-1-pathogenese kunnen beïnvloeden.

Karakterisering van EVs en scheiding van EVs weg van andere virussen
Om dit protocol toepassen op andere virale infectie modellen, we hebben gekarakteriseerd blaasjes uit cellen geïnfecteerd met verschillende virussen. Figuur 3c toont een illustratie van eerder verkregen vesikel-en virus verdelingen na precipitatie, scheiding en verrijking volgens het beschreven protocol. Zoals eerder weergegeven in Figuur 3a, zijn exosomen (CD9+CD63+CD81+) aanwezig in drie verschillende populaties (Exo #1, breuken 10,8-12.0; Exo #2, breuken 15,6-16,8, en exo # 3, 18,0 Fractie) en HIV-1 virus lokaliseert naar de hogere dichtheid 16,8 en 18,0 breuken (Lanes 10-11). Het is niet verrassend dat bij de toepassing van dit protocol voor EVs die vrijkomen uit humaan T-lymphotropic-virus type 1 (HTLV-1), een retrovirus waarvan bekend is dat het kanker bij volwassenen veroorzaakt, we resultaten hebben waargenomen die vergelijkbaar zijn met die van HIV-1-gerelateerde Ev's. Het derde paneel in Fig. 3c toont aan dat het HTLV-1-virus voornamelijk werd gelokaliseerd in de hoogste dichtheids fractie (18,0) en, in mindere mate, de fracties 13,2-16,8, zoals blijkt uit de aanwezigheid van HTLV-1 matrix eiwit (P19). Bovendien hebben we eerder geconstateerd dat de HTLV-1 trans activerende eiwitten, belasting, die afwezig is van de HTLV-1 virion, aanwezig is in exosomen die vrijkomen uit HTLV-1 geïnfecteerde cellen15,23. Uit de gegevens in figuur 3c blijkt dat de belasting in de lagere dichtheids fracties (6,0-12.0) aanwezig was, waarvan we er twee hebben laten zien dat ze exosomen bevatten (10,8 en 12,0).

Vervolgens testten we het isolatie protocol in de context van grotere en kleinere virussen zoals Ebola virus (EBOV) en Zika virus (ZIKV), respectievelijk, als HIV-1 en HTLV-1 virionen zijn beide retrovirussen en zeer vergelijkbaar in diameter. Met behulp van VLP als surrogaat bioveiligheid niveau 2 (BSL-2) model van ebov assemblage en uitgang, vonden we dat VLP, die ongeveer 1 μm lang is, lokaliseert naar de hoogste dichtheids fractie (18,0) bij afwezigheid van 0,22 μm filtratie (middelste paneel, figuur 3c). Bovendien, wanneer VP40, de ebov matrix eiwit, wordt uitgedrukt op hoge niveaus, het wordt uitgescheiden uit de cel door middel van verschillende mechanismen resulterend in de aanwezigheid van VP40 in elke dichtheids Fractie, met inbegrip van die welke exosomen zijn gelokaliseerd13 , 14. zikv-virionen zijn daarentegen significant kleiner dan HIV-1-virionen, met een diameter van ongeveer 40 nm. Het representatieve diagram in het onderste deel van figuur 3c toont de aanwezigheid van zikv-virionen in fracties met een lage dichtheid (6,0-8,4) en hoge dichtheid (15,6-18,0), wat suggereert dat de aanwezigheid van zowel gratis virus als EV-ingekapselde virus respectievelijk.

Figure 1
Figuur 1: Bouw van een gradiënt van de iodixanol-dichtheid. A) relatieve hoeveelheden iodixanol en PBS die worden gebruikt om elke dichtheids fractie (breuk #) te creëren. De breuk # duidt het percentage iodixanol aan dat in elke fractie is opgenomen. Hun relatieve dichtheden en plaatsing in het verloop worden afgebeeld van de zwaarste tot de lichtste. B) plaatsing van de dichtheids fracties (6,0-18) in ultracentrifuge buis wordt getoond (linkerzijde) en de locatie van de drie EV-populaties (Exo #1, Exo #2, Exo #3), Exo-achtige blaasjes en eiwitcomplexen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Peg-neerslag reagens verhoogt de EV-opbrengst. A) om EV-terugwinning te vergelijken, werden EVS geïsoleerd van 5 d met HIV-1 geïnfecteerde monocyt (U1) kweek supernatant (10 ml) met behulp van traditionele ultracentrifugatie (100.000 x g) of Peg precipitatie reagens (incubatie bij een 1:1 ratio). EVs uit beide verrijkings procedures werden geanalyseerd met behulp van nanotracking analyse om de resulterende EV-concentratie te beoordelen zoals beschreven in DeMarino, et al.6. NTA werd gemeten op 11 onafhankelijke posities in technisch triplicaat. De blauwe balken vertegenwoordigen een gemiddelde van de 33 metingen ± S.D. statistische significantie werd bepaald met behulp van een tweezijdige Student t-toets; p < 0,001. B. EVS uit 5-daagse Cem Culture supernatant met behulp van ultracentrifugatie (UC) of Peg-neerslag gevolgd door iodixanol-dichtheids scheiding. Ultracentrifugatie werd uitgevoerd met 100 mL cultuur supernatant (Lane 1) terwijl PEG-neerslag en daaropvolgende iodixanolfractionering werden uitgevoerd met 10 mL cultuur supernatant (Lane 2). De totale EV pellet verkregen uit ultracentrifugatie en de 10,8 Fractie van PEG/iodixanol scheiding werden geanalyseerd door Western Blot voor de aanwezigheid van exosomale marker eiwitten (CD81, CD63, en CD9) met actin als een controle. Voor de duidelijkheid worden geselecteerde rijstroken van dezelfde vlek met identieke belichtingen weergegeven in paneel B. Dit cijfer is gewijzigd van DeMarino, et al.6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: isolatie van EVs uit de buurt van virussen. A) vijfdaagse kweek supernatanten uit niet-geïnfecteerde Cem-cellen (bovenste paneel), HIV-1 (BA-L; MOI: 0,01) geïnfecteerde U1-cellen (± PMA-en ±-kar-behandeling; middenpaneel) of HIV-1-geïnfecteerde primaire macrofagen (onderste paneel) werden geïncubeerd met PEG-precipitatie reagens bij 4 °C 's nachts. EVs werden gescheiden in fracties met een gradiënt van iodixanol. EVs uit alle fracties werden verrijkt met NT80/82 deeltjes 's nachts bij 4 °C. CEM-nanodeeltjes werden geanalyseerd met behulp van Western Blot voor de aanwezigheid van exosomale marker eiwitten CD81, CD63 en CD9. U1 (± PMA-en ±-cART-behandeling) en HIV-1-geïnfecteerde primaire macrofagen werden geanalyseerd op de aanwezigheid van HIV-1-gag eiwit (p24 en Pr55; respectievelijk gecleaved en uncleaved HIV-1 gag polyprotein), evenals CD63. Blots werden voor actine als een controle geproteand. Echte exosome populaties (CD81+CD63+CD9+) worden in het rood geschetst. Dit cijfer is gewijzigd van demarino, et al.6 (B) vijfdaagse cultuur supernatanten van geïnfecteerde U1-cellen werden gedurende een nacht met een Peg-precipitatie reagens bij 4 °c geïnfiltreerd. EVs werden gescheiden in fracties met een gradiënt van iodixanol. EVs uit alle fracties werden verrijkt met NT80/82 deeltjes 's nachts bij 4 °C. Breuken werden uitgevoerd op een Western-Blot voor de aanwezigheid van HIV-1 NEF, VPR en tat. Actin werd gebruikt als een controle. Echte exosome populaties (CD81+CD63+CD9+) worden in het rood geschetst zoals eerder gedefinieerd in demarino, et al.6 (C) representatieve illustratie van eerder gekarakteriseerde EV-scheidings profielen van vier verschillende virussen: HIV-1, HTLV-1, EBOV, en ZIKV. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: protocol workflow. De nieuwe workflow combineert verschillende technieken, waaronder filtratie, EV precipitatie met behulp van PEG precipitatie reagens, iodixanol dichtheid gradiënt scheiding, en nano article verrijking van EVs. Gebruik van dit protocol scheidt Ev's van verschillende virussen en biedt een klein volume monster voor downstream testen, waaronder qPCR, Western Blot, massaspectrometrie, RNA-sequencing, cytokine-analyse, ELISA en op cellen gebaseerde assays. Dit cijfer is gewijzigd van DeMarino, et al.6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beschreven methode zorgt voor een verbeterde EV-opbrengst en de scheiding van het virus van EVs met behulp van een gecombineerde benadering van isolatie. Relatief grote hoeveelheden uitgangsmateriaal (d.w.z. celsupernatant) kunnen vóór de EV-isolatie worden gefilterd door precipitatie, DG scheiding en verrijking van nanodeeltjes, resulterend in een eindvolume van ~ 30 μL, waardoor direct gebruik in een verscheidenheid van downstream assays. Het gebruik van nanodeeltjes verrijking is essentieel omdat, in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie, deze EV-verrijkende nanodeeltjes hebben aangetoond dat ze de blaasjes efficiënter opvangen, wat een groter dan of gelijk aan de hoeveelheid blaasjes oplevert van 1 ml cultuur supernatant vergeleken met 10 mL ultracentrifuged Culture supernatant15. Over het algemeen omvat het beschreven protocol de combinatie van verschillende bekende technieken en moet daarom beperkte moeilijkheden opleveren. De opname van EV-verrijkende nanodeeltjes introduceert echter een nieuwe techniek die het oplossen van problemen en/of aanpassingen kan vereisen om gewenste resultaten te behalen, afhankelijk van de downstreamtest of het biologische doel van belang. Wij raden aan dat nanodeeltjes 's nachts worden geïnfiltreerd met gefilterde celkweek supernatanten. Als het beoogde eiwit of RNA van belang een geringe overvloed in het modelsysteem is, kan het protocol worden aangepast om de incubatieperiode te verhogen om ervoor te zorgen dat het doelwit wordt vastgelegd. Het gebruik van nanodeeltjes in stroomafwaartse assays kan doorgaans worden bereikt door de pellet in de gewenste monster buffer voor elke test te onderbreken. Nanodeeltjes kunnen bijvoorbeeld direct in de Laemmli-buffer voor de analyse van Western Blot worden opgeschort. Het vastgelegde materiaal moet dan efficiënter worden geellueerd uit de nanodeeltjes in SDS via verwarmings-en grondig-cycli. Om een adequate scheiding van eiwitten te bereiken, moet worden gezorgd voor het beperken van de hoeveelheid nanodeeltjes die in de gel worden geladen, en de gel moet worden uitgevoerd bij ongeveer 100 V om ervoor te zorgen dat eventuele resterende deeltjes in de putjes zitten. Bovendien behaalt een nachtelijke natte overdracht voor de visualisatie van eiwitten met een laag molecuulgewicht optimale resultaten. Hoewel het gebruik van nanodeeltjes leidt tot aanzienlijke verrijking van vesikelpopulaties, moeten extra stappen worden ondernomen om gevangen materiaal van de deeltjes te elzen. Bovendien kan elutie van het materiaal het nut van Ev's in downstream Functionele assays mogelijk beperken, omdat veel elutie buffers de integriteit van het EV-membraan kunnen beschadigen. Aanvullend onderzoek is nodig om een strategie te ontwikkelen om de verwijdering van intacte blaasjes uit nanodeeltjes na incubatie mogelijk te maken. Een ander nadeel van deze deeltjes is het huidige gebrek aan karakterisering. De buitenste schil van het deeltje is ontworpen om moleculen met een hoog molecuulgewicht uit te sluiten. Echter, specifieke targeting van de deeltjes aan EVs vindt niet plaats, en als gevolg daarvan kunnen veel verstorende factoren en achtergrond signalen mogelijk aanwezig zijn in downstream assays.

De beschreven methode wordt voornamelijk gebruikt voor laboratorium doeleinden. We hebben onlangs alternatieve methoden ontwikkeld om de mogelijkheden van onze combinatie aanpak uit te breiden naar aanvullende technieken voor het isoleren van Ev's van kleinschalige, patiënt biovloeistoffen zoals plasma en CSF en grootschalige, commerciële EV-productie. Voor de isolatie van EVs weg van het virus in het materiaal van de patiënt hebben we het gebruik van grootte uitsluitings chromatografie (SEC) kolommen, die worden gebruikt in plaats van een dichtheidsgradiënt opgenomen. Deze kolommen zijn voordelig omdat ze wegwerp zijn en daarom ideaal zijn in laboratoria met hoge containment. Echter, SEC kolommen scheiden deeltjes op basis van grootte, daarom, hieruit volgt dat dit type scheiding is alleen van toepassing voor de scheiding van grote of zeer kleine virussen, zoals EBOV (~ 1 μm) of ZIKV (~ 40 nm), respectievelijk, van EVs of scheiding weg van Vrije eiwitten. Wat de grootschalige productie van EV betreft, hebben recente ontwikkelingen op het gebied van filtratiemethoden, namelijk tangentiële stroom filtratie (TFF), tot doel een efficiënte isolatie van EVs uit grote monstervolumes mogelijk te laten zijn. TFF is historisch gebruikt voor de zuivering van nano-sized biomoleules, met inbegrip van virussen, en door de optimalisatie van de protocollen is dit systeem met succes aangepast voor de isolatie van EVS24,25. Kort, tijdens het TFF-proces, monstervloeistof stroomt tangentieel over het oppervlak van een semi-permeabel membraan die selectief blaasjes op basis van grootte en moleculair gewicht behoudt, waardoor de scheiding van EVS weg van vrije eiwitten en andere contaminerende biomoleules26. In vergelijking met ultracentrifugatie, is gemeld dat TFF resulteert in hogere opbrengsten, minder aggregatie, en vermindert de lot-to-lot variabiliteit van EVs27. Bovendien is het gebruik van TFF voor de goede fabricagepraktijken (GMP)-grade isolatie van Ev's voor therapeutische toepassing ook gemeld28. Door zijn schaalbaarheid en reproduceerbaarheid biedt deze technologie een groot potentieel voor toekomstig EV-onderzoek.

Virussen zijn er in verschillende maten en dichtheden, dus afhankelijk van het virus in kwestie, kan optimalisatie van dit protocol nodig zijn. Voor zeer grote virussen zoals Ebola (~ 1 μm of groter in lengte), kan eenvoudige filtratie worden gebruikt om de overgrote meerderheid van virionen en grote verontreinigende lichamen zoals Vlp's en apoptotische lichamen14te verwijderen. Dit maakt het grootste deel van de scheiding van virus weg van EVs om uitvoerbaar te zijn op de voorkant van de zuivering. Echter, in het geval van kleinere virussen zoals enterovirus (~ 30 nm), Zikavirus (~ 40 nm), hepatitis B-virus (~ 42 nm), hepatitis C-virus (~ 55 nm), en anderen, de Fractie waarin virionen sediment zal moeten worden bepaald voordat verdere downstream functionele Analyses. Men kan niet altijd de waarschijnlijke Fractie van sedimentatie benaderen op basis van de deeltjesdiameter alleen. Bijvoorbeeld, poliovirus, dat 30 nm in diameter is, is ook bekend om te worden ingekapseld in secretoire autophagosomes29,30,31,32,33, en is daarom waarschijnlijk te vinden op de rechterkant van het verloop (dichtere fracties) in plaats van de linker (minder dichte fracties). Hoewel we dit protocol in het geval van HIV-1, HTLV-1 en EBOV Vlp's hebben geoptimaliseerd, hebben extra virussen karakterisatie nodig om het protocol voor hun specifieke zuivering weg van EVs te verfijnen.

Het protocol dat hier wordt beschreven (Figuur 4) maakt het voor de eerste keer mogelijk om ev's van het virus te scheiden met verbeterde efficiëntie en kleinere volumes startmateriaal in vergelijking met de gouden standaard van EV-isolatie, ultracentrifugatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan de omstandigheden die bij de hand liggen, waaronder verschillende steekproefgroottes, vereiste opbrengsten, uitgangsmateriaal type (d.w.z. cultuur supernatant versus patiënt materiaal) en verschillende verschillende virussen van verschillende groottes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.L. is aangesloten bij Ceres Nanosciences Inc. die reagentia en/of instrumenten produceert die in dit artikel worden gebruikt. Alle andere auteurs verklaren geen potentiële belangenconflicten.

Acknowledgments

We willen alle leden van het Kashanchi Lab bedanken, vooral Gwen Cox. Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, en NS099029 aan F.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CEM CD4+ Cells NIH AIDS Reagent Program 117 CEM
DPBS without Ca and Mg (1x) Quality Biological 114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer Systems Biosciences EXOMAX24A-1 PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS Thermo Fisher Scientific A2720801
Fetal Bovine Serum Peak Serum PS-FB3 Serum
HIV-1 infected U937 Cells NIH AIDS Reagent Program 165 U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA Thermo Scientific 723-2520
Nanotrap (NT80) Ceres Nanosciences CN1030 Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82) Ceres Nanosciences CN2010 Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556-250mL Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Tags

Immunologie en infectie probleem 151 extracellulaire vesicles exosome virus zuivering dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie neerslag EV-verrijkende nanodeeltjes
Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DeMarino, C., Barclay, R. A., Pleet, More

DeMarino, C., Barclay, R. A., Pleet, M. L., Pinto, D. O., Branscome, H., Paul, S., Lepene, B., El-Hage, N., Kashanchi, F. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (151), e59876, doi:10.3791/59876 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter