Summary
Ce protocole isole les vésicules extracellulaires (VE) loin des virions à haut rendement et à haut rendement en incorporant les précipitations EV, l'ultracentrifugation du gradient de densité et la capture des particules pour permettre un flux de travail rationalisé et une réduction du démarrage volumes, ce qui entraîne des préparations reproductibles pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques.
Abstract
L'un des principaux obstacles dans le domaine de la recherche sur la vésicule extracellulaire (VE) aujourd'hui est la capacité d'atteindre des préparations év.s.rpure dans un environnement d'infection virale. La méthode présentée vise à isoler les véhicules électriques loin des virions (c.-à-d. le VIH-1), ce qui permet une efficacité et un rendement plus élevés par rapport aux méthodes conventionnelles d'ultracentrifugation. Notre protocole contient trois étapes : précipitation sev, séparation du gradient de densité et capture des particules. Les essais en aval (c.-à-d. western blot et PCR) peuvent être exécutés directement après la capture des particules. Cette méthode est avantageuse par rapport à d'autres méthodes d'isolement (c.-à-d. ultracentrifugation) car elle permet l'utilisation de volumes de départ minimes. En outre, il est plus convivial que les méthodes alternatives d'isolation EV nécessitant plusieurs étapes d'ultracentrifugation. Cependant, la méthode présentée est limitée dans sa portée d'essais fonctionnels EV car il est difficile d'éluter les véhicules électriques intacts de nos particules. En outre, cette méthode est adaptée à un cadre strictement fondé sur la recherche et ne serait pas commercialement viable.
Introduction
La recherche centrée sur les vésicules extracellulaires (VE), en particulier les exosomes, un type de VE allant de 30 à 120 nm et caractérisée par la présence de trois marqueurs de tétraspaninCD81, CD9 et CD63, a été en grande partie façonnée par le développement de méthodes d'isolement et de purifier les vésicules d'intérêt. La capacité de disséquer les mécanismes multiformes a été entravée en raison de techniques complexes et chronophages qui génèrent des échantillons composés d'une population hétérogène de vésicules générées par différentes voies avec un large éventail de contenus, tailles, et Densités. Bien qu'il s'agisse d'un problème pour presque toutes les recherches sur les véhicules électriques, il est particulièrement important lorsqu'il s'agit d'étudier les véhicules électriques dans le contexte de l'infection virale, car les virions et les particules virales (VLP) peuvent avoir un diamètre similaire aux vésicules d'intérêt. Par exemple, le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) mesure environ 100 nm de diamètre, ce qui est à peu près la même taille que de nombreux types de véhicules électriques. Pour cette raison, nous avons conçu un nouveau flux de travail d'isolement EV pour résoudre ces problèmes.
L'étalon-or actuel de l'isolement EV est l'ultracentrifugation. Cette technique utilise les différentes densités vésicules, ce qui permet aux vésicules d'être séparées par centrifugation avec sédimentation différentielle de particules de densité plus élevée par rapport aux particules de densité inférieure à chaque étape 1,2. Plusieurs étapes de centrifugation à basse vitesse sont nécessaires pour enlever les cellules intactes (300-400 x g pendant 10 min), les débris cellulaires (2 000 x g pour 10 min) et les corps apoptotiques/grandes vésicules (10 000 x g pendant 10 min). Ces purifications initiales sont suivies d'une ultracentrifugation à grande vitesse (100 000 à 200 000 x g pour 1,5 à 2 h) vers les véhicules électriques sédimentaires. Des étapes de lavage sont effectuées pour assurer davantage la pureté de EV, cependant, ceci a comme conséquence la réduction du nombre d'EV isolés, abaissant de ce fait le rendement total 3,4. L'utilité de cette méthode est encore limitée par l'exigence d'un grand nombre de cellules (environ 1 x 108) et d'un grand volume d'échantillon (-gt; 100 ml) pour obtenir des résultats adéquats.
Pour répondre aux préoccupations croissantes, la précipitation de vésicules avec des polymères hydrophiles est devenue une technique utile ces dernières années. Le polyéthylène glycol (PEG), ou d'autres réactifs de précipitation séquencés connexes, permet à l'utilisateur de démonter les vésicules, les virus et les agrégats de protéines ou d'ARN protéiques dans un échantillon en couvainant simplement l'échantillon avec le réactif de choix, suivi d'une seule vitesse basse centrifugation1,2,5. Nous avons précédemment signalé que l'utilisation de PEG ou de méthodes connexes pour précipiter les véhicules électriques par rapport à l'ultracentrifugation traditionnelle entraîne un rendement significativement plus élevé6. Cette stratégie est rapide, facile, ne nécessite pas d'équipement supplémentaire coûteux, est facilement évolutive, et conserve la structure EV. Cependant, en raison de la nature promiscuité de cette méthode, les échantillons résultants contiennent une variété de produits comprenant des protéines libres, des complexes de protéine, une gamme de véhicules électriques, et des virions nécessitant ainsi une purification supplémentaire pour obtenir la population désirée1 ,2,7,8.
Pour surmonter l'hétérogénéité des véhicules électriques obtenus à partir de diverses méthodes de précipitation, l'ultracentrifugation du gradient de densité (DG) est utilisée pour mieux séparer les particules en fonction de leur densité. Cette méthode est réalisée à l'aide d'un gradient stepwise à l'aide d'un milieu de gradient de densité, comme l'iodixanol ou le saccharose, qui permet la séparation des véhicules électriques des protéines, des complexes protéiques et des particules virales ou virales (VLP). Il est important de noter que, bien qu'on ait pensé autrefois que la DG permettait une séparation plus précise des sous-populations de veaux, on sait maintenant que les tailles et les densités de diverses vésicules peuvent se chevaucher. Par exemple, on sait que les exosomes ont des densités de flottaison de 1,08-1,22 g/mL9, tandis que les vésicules isolées du Golgi (COPIou clathrine) ont des densités de 1,05-1,12 g/mL et celles du reticu(COPII) ) sédiments à 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. En outre, si l'on désire comparer les fractions exosomal avec les fractions contenant des particules virales, cela peut devenir plus difficile en fonction de la densité du virus d'intérêt , il existe des virus autres que le VIH-1 qui sont probablement en équilibre densités comme fractions positives exosomales2.
Enfin, l'enrichissement des préparations EV pour la visualisation en aval et les essais fonctionnels est essentiel à la recherche sur les véhicules électriques. L'utilisation de nanoparticules enrichies de véhicules électriques, en particulier de particules hydrogel multifonctionnelles de 700 à 800 nm de diamètre, constituent une étape cruciale dans la réalisation de préparations concentrées pour les véhicules électriques. Ils possèdent un appât aromatique à haute affinité qui est encapsulé par une coquille de tamisage externe poreuse pour favoriser la sélectivité. Les nanoparticules utilisées dans cette étude comprennent deux préparations distinctes avec des appâts de base différents (Réactive Red 120 NT80; et Cibacron Blue F3GA NT82) qui ont montré qu'elles augmentaient la capture des véhicules électriques à partir de divers réactifs et biofluides (voir le Tableau des matériaux )6,10,11,12,13,14,15. Les particules offrent l'enrichissement facile des véhicules électriques à partir de nombreux matériaux de départ, y compris les fractions d'iodixanol, supernatant de culture cellulaire, ainsi que les biofluides patients tels que le plasma, le sérum, les fluides rachidiens (CSF), et l'urine6,13 .
La méthode présentée ici améliore l'efficacité des techniques actuelles de purification des véhicules électriques en combinant plusieurs technologies; Précipitation synveux, ultracentrifugation du gradient de densité et captage des particules, afin de rationaliser le flux de travail, de réduire les besoins en échantillons et d'augmenter le rendement afin d'obtenir un échantillon de VE plus homogène pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques. Cette méthode est particulièrement utile dans l'étude des véhicules électriques et de leur contenu pendant l'infection virale, car elle comprend une étape de filtration de 0,22 m pour exclure les vésicules et les VLP de grande taille et indésirables et la séparation de la population totale de véhicules électriques en fonction de la densité afin d'en faire efficacement isoler les véhicules électriques des virions.
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Protocol
1. Filtration et précipitation des vésicules extracellulaires (VEV)
- Pour préparer le supernatant de culture à partir de cellules infectées ou transfectées (c.-à-d. lignées cellulaires et/ou cellules primaires), la culture d'environ 10 ml de cellules de bois tardif pendant 5 jours à 37 oC et de 5 % de CO2 dans un milieu de culture approprié (c.-à-d. RPMI ou DMEM avec 10 % de bovins foetaux sérum [FBS]).
REMARQUE: Tous les réactifs moyens de culture doivent être exempts de véhicules électriques, et peuvent être achetés (voir Tableau des matériaux) ou préparés en interne par pré-ultracentrifugation du sérum à 100 000 x g pendant 90 min. Ce protocole a été un succès pour plusieurs lignées cellulaires couramment utilisées, notamment : CEM, Jurkat, 293T, U937 (lignes non infectées), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (lignées infectées par le VIH-1 et le HTLV-1), plusieurs cellules transfectées et des cellules myéloïdes et T primaires (les deux infectés et non infectés); cependant, ce protocole peut être utilisé pour n'importe quel type de cellule, y compris ceux qui nécessitent des conditions de médias ou de culture spécialisées. La densité des cellules peut devoir être optimisée pour différents types de cellules. Il est recommandé que la densité la plus élevée soit utilisée avec la mort cellulaire minimale après 5 jours. - Centrifuger la culture à 3 000 x g pendant 5 min pour les cellules à granulés et jeter la pastille.
- Filtrer le supernatant de culture à l'aide d'un filtre stérile de 0,22 m et collecter le filtrate dans un tube propre.
- Ajouter un volume égal de réactif de précipitation PEG (1:1 ratio) au supernatant filtré. Inverser le tube plusieurs fois pour assurer un mélange homogène.
REMARQUE: Ne PAS vortex. - Incuber le mélange à 4 oC pendant la nuit (O/N).
- Mélange centrifugeàeur à 1 500 x g pendant 30 min à température ambiante (RT) pour produire une pastille EV hétérogène.
REMARQUE: Les granulés EV doivent apparaître de couleur blanche ou blanc cassé. - Jetez le supernatant de culture appauvri par les véhicules électriques.
- Resuspendre la pastille EV en 150 à 300 oL de 1x saline tamponnée de phosphate sans calcium et magnésium (PBS) et garder sur la glace.
2. Construction d'un gradient de densité
- Mélanger le milieu de gradient de densité d'iodixanol avec 1x PBS pour créer 11 fractions de densité différentes de 1 ml de 6 à 18% d'iodixanol dans des incréments de 1,2% dans des tubes de microcentrifuge distincts comme le montre la figure 1A.
- Vortex chaque tube à mélanger.
- Fractions de densité de couche dans un tube ultracentrifuge pré-nettoyé et sec oscillant commençant par la fraction #18 et se terminant par la fraction #6 comme indiqué dans la figure 1B.
REMARQUE: Tous les tubes doivent être désinfectés à l'aide d'un spray à l'eau de Javel de 10 %, suivi d'un rinçage 3x à l'eau déionisée et d'un lavage final de l'eau déionisée stérile avant le chargement des fractions de gradient. - Ajouter le granule EV suspendu (300 l) au sommet du gradient en couches dans le tube d'ultracentrifuge.
- Ultracentrifuge à 100,00 x g à 4 oC pendant 90 min.
- Retirez soigneusement les fractions de 1 ml du tube d'ultracentrifuge et transférez chaque fraction dans de nouveaux tubes de microcentrifuge.
3. Enrichissement des fractions EV utilisant des nanoparticules
- Créez une boue de 30 % de nanoparticules en utilisant des volumes égaux de NT80, NT82 et 1x PBS.
REMARQUE: Le mélange doit être vortexé avant d'être utilisé pour assurer l'homogénéité. - Ajouter 30 let l'une de la boue à chaque tube de microcentrifuge contenant les fractions de densité et les pipette/inverser plusieurs fois pour les mélanger.
- Rotation des tubes de microcentrifugeur de densité contenant des nanoparticules enrichie par les véhicules électriques O/N à 4 oC à environ 20 tr/min.
- Tubes de microcentrifugeà fraction de densité de centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à RT.
- Jeter le liquide et laver le granule EV deux fois avec 1x PBS.
REMARQUE: Les granulés de nanoparticules peuvent être congelés à -20 oC ou immédiatement utilisés pour diverses analyses en aval (c.-à-d. PCR, tache occidentale, spectrométrie de masse et autres essais).
4. Préparation recommandée de pellet de nanoparticules pour les essais en aval
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Pour l'isolement de l'ARN
- Resuspendre la pastille dans 50 lddad d'eau déionisée autoclaved traitée avec 0,001% de pyrocarbonate de diethyle (DEPC) filtré à travers un filtre de 0,2 m et isoler l'ARN selon le protocole du fabricant du kit.
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Pour l'électrophoresis de gel
- Resuspendre la pastille directement dans 15 'L de tampon Laemmli.
- Échantillon de chaleur 3x à 95 oC pendant 3 min. Vortex doucement et spin vers le bas entre chaque cycle de chaleur.
- Échantillon de centrifugeuse pour 15 s à 20 000 x g et chargez tout le matériel élucidé directement sur le gel.
REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, limitez la quantité de particules chargées sur le gel et faites fonctionner le gel à 100 V pour vous assurer que les particules restantes sont contenues dans les puits.
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Pour la digestion de trypsine
- Resuspendre la pastille dans 20 l'urée avant l'alkylation et la trypsinisation de l'échantillon. Les nanoparticules peuvent être granulées par une centrifugation de 14 000 x g à RT pendant 10 min. L'échantillon contenant le peptide trypsinisé peut être transféré dans un tube de collecte propre.
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Representative Results
Les précipitations PEG augmentent le rendement des véhicules électriques
Notre approche combinée à l'isolement EV est significativement plus efficace en termes de récupération EV par rapport à l'ultracentrifugation traditionnelle, comme en témoigne la réduction de 90% du volume de matériel de départ requis. L'ultracentrifugation, l'étalon-or actuel dans l'isolement des véhicules électriques, nécessite environ 100 ml de supernatant de culture pour produire une préparation EV adéquate pour les essais en aval, alors que notre nouveau protocole ne nécessite que 10 ml. Cette réduction est rendue possible grâce à l'utilisation du réactif de précipitation PEG EV qui offre une augmentation significative du rendement des véhicules électriques mesurée par l'analyse nanotracking (NTA). Les résultats de la figure 2A, qui ont déjà été publiées6, indiquent que lors de l'utilisation de 10 ml de précipitations PEG supernatant de culture a entraîné la récupération de 7,27 x 1010 véhicules électriques, ce qui était environ 500 fois plus que le nombre des véhicules électriques récupérés à partir du même matériau de départ à l'aide de l'ultracentrifugation (1,45 x 108). L'efficacité accrue de l'isolement des exosomes, un sous-type spécifique de EV, a été également observée comme évidente par des niveaux accrus des protéines bien caractérisées de marqueur d'exosome, CD81, CD63, et CD9. L'analyse des taches occidentales comparant les préparations EV produites à partir de précipitations d'ultracentrifugation ou de EV à l'aide d'un réactif de précipitation PEG est montrée dans la figure 2B. Ces résultats montrent une augmentation de 3 000 fois du CD81, une augmentation de 4 fois du CD63 et une augmentation de 40 fois du CD9 mesurée par l'analyse de la densitométrie. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le protocole décrit augmente non seulement le rendement total de EV mais améliore également la récupération des exosomes par rapport à l'ultracentrifugation.
Caractérisation des véhicules électriques et séparation des véhicules électriques loin du virus VIH-1
Afin de caractériser les vésicules présentes dans chaque fraction suivant l'enrichissement des nanoparticules, les véhicules électriques ont été isolés du CEM non infecté ou du supernatant de culture cellulaire U1 infecté par le VIH-1 à l'aide du protocole décrit et caractérisé à l'aide d'une tache occidentale de chaque fraction d'iodixanol enrichie en nanoparticules. Les données de la figure 3A montrent nos résultats publiés précédemment qui démontrent la présence ou l'absence de trois tétraspanins exosomal (CD81, CD63 et CD9) dans chaque fraction (cellules CEM; panneau supérieur). Les résultats indiquent que les exosomes, tels que définis par la présence des trois tétraspanines dans la fraction, se trouvent dans trois populations distinctes: Exo #1 qui comprend les fractions 10.8-12.0, Exo #2 qui comprend les fractions 15.6-16.8, et Exo -3 qui comprend seulement la fraction 18,0. Malgré la présence de trois populations distinctes, le protocole ne peut exclure la possibilité d'une présence de types supplémentaires de véhicules électriques dans chaque fraction. En outre, ces résultats n'excluent pas définitivement la possibilité qu'il y ait des vésicules dans ces populations qui sont positives pour une combinaison des marqueurs testés de tétraspanine. Ces véhicules électriques pourraient alors être séparés davantage par des stratégies de purification supplémentaires.
Le domaine en développement rapide de la recherche EV/exosome a explosé depuis leur découverte et a donné lieu à de nombreuses fonctions et applications retrouvées pour ces vésicules. En particulier, leur rôle en tant que messagers intracellulaires non seulement dans la physiologie normale, mais aussi dans la maladie a conduit à l'utilisation de ressources importantes pour disséquer les effets et l'utilité des vésicules extracellulaires, en particulier les exosomes, sur les cellules receveuses16 , 17 Annonces , 18. De nombreuses études ont impliqué les véhicules électriques dans la pathogénie d'une variété d'infections, y compris le VIH-16,10,12,19,20,21 , 22. Cependant, la similitude de taille entre les véhicules électriques et les virions présente un obstacle potentiel dans la définition de ces mécanismes médiés par les véhicules électriques. Pour répondre à cette préoccupation, nous avons conçu notre protocole pour mettre en œuvre un gradient de densité afin de séparer efficacement les populations de véhicules électriques des virions. À cette fin, le supernatant de culture cellulaire des cellules infectées par le VIH-1 a été soumis au protocole présenté et analysé par western blot pour déterminer la présence du VIH-1 Gag p24 pour déterminer quelles fractions ou fractions contenaient des virions du VIH-1. Les résultats présentés à la figure 3A (panneau du milieu) montrent la localisation de la p24 dans trois conditions indépendantes : en l'absence d'un inducteur, en présence d'un inducteur (Phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA), et en présence de la PMA et de la thérapie antirétrovirale combinée (cART), le traitement standard pour le VIH-1. Ces données indiquent que le virus VIH-1 est localisé à la fraction 16,8 mesurée par la présence de p24 et de sa polyprotéine sans clivé Pr55. En outre, lorsque les cellules sont soumises à la cART, qui comprend Indinavir, un inhibiteur de la protéase qui empêche le clivage de Pr55 à p24, aucun p24 n'a été détecté en aucune fraction. Au lieu de cela, seulement Pr55 a été détecté et était présent dans les fractions 16.8-18.0, indiquant un déplacement du virus en fractions plus denses. Des résultats similaires ont été obtenus à l'aide de macrophages primaires (panneau inférieur). Bien que le protocole décrit entraîne la co-sédimentation des populations Exo #2 et Exo #3 avec virus, la population Exo #1 (fractions 10,8-12,0) est demeurée exempte de virus, ce qui a permis des essais en aval exempts de contamination par le virus.
Ce type de séparation du virus loin des véhicules électriques nous permet d'aborder la possibilité que des morceaux de virus entrent dans les véhicules électriques ou soient sécrétés à partir de cellules infectées comme protéines libres. Les résultats de la figure 3B indiquent que la protéine Nef VIH-1 peut être trouvée dans la population Exo #1 en plus des populations Exo #2 et Exo #3. Nef apparaît également dans la fraction 6.0, indiquant que Nef peut être potentiellement sécrété à partir de cellules infectées comme une protéine libre et dans un EV. En outre, la protéine Vpr VIH-1 se trouve dans la fraction 6.0 tandis que la protéine Tat VIH-1 se trouve principalement dans la fraction 6.0, mais apparaît également dans les fractions 7.2-9.6. Nous testons actuellement toutes les fractions pour la présence de protéines Tat par ELISA. Ces résultats indiquent que Tat et Vpr peuvent être sécrétés à partir de cellules infectées, probablement sous forme de protéines libres, tandis que Tat pourrait également être incorporé dans les véhicules électriques. Collectivement, ces données indiquent que notre méthode d'isolement des véhicules électriques peut réussir à isoler les exosomes (Exo #1) loin des virions du VIH-1 (Exo #2 et #3) et que les véhicules électriques provenant de cellules infectées par le VIH-1 contiennent certaines protéines du VIH-1, qui peuvent affecter la pathogénie du VIH-1.
Caractérisation des véhicules électriques et séparation des véhicules électriques à l'écart des autres virus
Pour appliquer ce protocole à d'autres modèles d'infection virale, nous avons caractérisé les vésicules à partir de cellules infectées par plusieurs virus différents. La figure 3C montre une illustration des distributions de vésicules et de virus obtenues antérieurement après précipitations, séparation et enrichissement selon le protocole décrit. Comme indiqué précédemment à la figure 3A, les exosomes (CD9etCD63etCD81) sont présents dans trois populations différentes (Exo #1, fractions 10,8-12,0; Exo #2, fractions 15.6-16.8, et Exo-3, 18.0 fraction) et hiv-1 virus localise à la densité plus élevée 16.8 et 18.0 fractions (voies 10-11). Comme on pouvait s'y attendre, lors de l'application de ce protocole pour caractériser les véhicules électriques libérés par le virus T-lymphotrope humain de type 1 (HTLV-1), un rétrovirus connu pour causer le cancer chez les adultes, nous avons observé des résultats semblables à ceux des véhicules électriques liés au VIH-1. Le troisième panneau de la fig. 3C montre que le virus HTLV-1 a été localisé principalement à la fraction de densité la plus élevée (18,0) et, dans une moindre mesure, aux fractions 13,2-16,8, comme en témoigne la présence de protéines matricielles HTLV-1 (p19). En outre, nous avons déjà constaté que la protéine transactivante HTLV-1, Tax, qui est absent de la virion HTLV-1, est présente dans les exosomes libérés par les cellules infectées HTLV-115,23. Les données de la figure 3C montrent que l'impôt était présent dans les fractions de densité inférieure (6,0-12,0), dont deux que nous avons montré pour contenir des exosomes (10,8 et 12,0).
Ensuite, nous avons testé le protocole d'isolement dans le contexte de virus de plus en plus petits tels que le virus Ebola (EBOV) et le virus Zika (ZIKV), respectivement, car les virions VIH-1 et HTLV-1 sont à la fois des rétrovirus et des diamètres très similaires. En utilisant le VLP comme modèle de biosécurité de substitution 2 (BSL-2) d'assemblage et de sortie EBOV, nous avons constaté que le VLP, d'une longueur approximative de 1 m, se localise à la fraction de densité la plus élevée (18,0) en l'absence d'une filtration de 0,22 m (panneau moyen, figure 3C). En outre, lorsque VP40, la protéine de matrice EBOV, est exprimée à des niveaux élevés, elle est sécrétée à partir de la cellule à travers plusieurs mécanismes différents résultant de la présence de VP40 dans chaque fraction de densité, y compris ceux auxquels les exosomes sont localisés13 , 14. En revanche, les virions ZIKV sont significativement plus petites que les virions du VIH-1, mesurant environ 40 nm de diamètre. Le diagramme représentatif du panneau inférieur de la figure 3C montre la présence de virions ZIKV dans les fractions de faible densité (6,0-8,4) et de haute densité (15,6-18,0), ce qui suggère la présence de virus libre et de virus encapsulé par les ev, respectivement.
Figure 1 : Construction d'un gradient de densité iodixanol. (A) Quantités relatives d'iodixanol et de PBS utilisées pour créer chaque fraction de densité (Fraction). La Fraction indique le pourcentage d'iodixanol inclus dans chaque fraction. Leurs densités relatives et leur placement dans le gradient sont représentés de plus lourds à plus légers. (B) Le placement des fractions de densité (6,0-18) dans le tube d'ultracentrifuge est montré (côté gauche) ainsi que l'emplacement des trois populations de EV (Exo #1, Exo #2, Exo #3), des vésicules exo-like, et des complexes protéiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Le réactif de précipitation de PEG augmente le rendement de EV. (A) Pour comparer le rétablissement des véhicules électriques, les véhicules électriques ont été isolés à partir d'un supernatant de culture de 5 d infecté par le VIH-1 (U1) (10 ml) à l'aide d'ultracentrifugation traditionnelle (100 000 x g)ou de réagent des précipitations PEG (incubation à un ratio de 1:1). Les véhicules électriques des deux procédures d'enrichissement ont été analysés à l'aided'une analyse nanotracking afin d'évaluer la concentration de véhicules électriques qui en a résulté, tel que décrit dans DeMarino et al.6 . NTA a été mesurée à 11 positions indépendantes dans le triplicate technique. Les barres bleues représentent une moyenne des 33 mesures - S.D. L'importance statistique a été déterminée à l'aide du test t-testd'un étudiant à deux queues; p lt; 0,001. B. Ve s'inspire nt de l'ultracentrifugation (UC) ou du PEG, suivi d'une séparation de densité d'iodixanol. L'ultracentrifugation a été effectuée à l'aide de 100 ml de supernatant de culture (la voie 1) tandis que les précipitations peg et la fractionnement subséquent d'iodixanol ont été exécutés en utilisant 10 ml de supernatant de culture (voie 2). Le granule TOTAL de EV obtenu de l'ultracentrifugation et de la fraction de 10.8 de la séparation de PEG/iodixanol ont été analysés par tache occidentale pour la présence des protéines de marqueur exosomal (CD81, CD63, et CD9) avec Actin comme commande. Pour plus de clarté, des voies sélectionnées à partir de la même tache avec des expositions identiques sont indiquées dans le panneau B. Ce chiffre a été modifié à partir de DeMarino, et al.6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Isolement des véhicules électriques loin des virus. (A) Supernatants de culture de cinq jours provenant de cellules CEM non infectées (panneau supérieur), VIH-1 (Ba-L; MOI : 0,01) les cellules U1 infectées (traitement de la PMA et de la co-technologie; panneau moyen) ou les macrophages primaires infectés par le VIH-1 (panneau inférieur) ont été incubées avec un réactif de précipitation PEG à 4 oC pendant la nuit. Les véhicules électriques ont été séparés en fractions à l'aide d'un gradient de densité iodixanol. Les véhicules électriques de toutes les fractions ont été enrichis à l'aide de particules NT80/82 pendant la nuit à 4 oC. Les nanopellets CEM ont été analysés à l'aide de taches occidentales pour la présence de protéines marqueurexomales CD81, CD63 et CD9. Les macrophages primaires infectés par le VIH-1 ont été analysés pour déterminer la présence de protéines Gag VIH-1 (p24 et Pr55; polyprotéines sérocles et non clivées, respectivement), ainsi que cD63. Des taches ont été sondées pour agir comme un contrôle. Les populations d'exosomes véritables (CD81etCD63etCD9) sont décrites en rouge. Ce chiffre a été modifié à partir de DeMarino, et al.6 (B) Les supernatants de culture de cinq jours provenant de cellules U1 infectées ont été incubés avec un réactif de précipitation PEG à 4 oC pendant la nuit. Les véhicules électriques ont été séparés en fractions à l'aide d'un gradient de densité iodixanol. Les véhicules électriques de toutes les fractions ont été enrichis à l'aide de particules NT80/82 pendant la nuit à 4 oC. Fractions ont été exécutés sur une tache occidentale pour la présence de HIV-1 Nef, Vpr, et Tat. Actin a été utilisé comme un contrôle. Les populations d'exosomes véritables (CD81etCD63,CD9) sont décrites en rouge tel que défini précédemment dans DeMarino, et al.6 (C) Illustration représentative des profils de séparation des EV précédemment caractérisés de quatre différents virus : HIV-1, HTLV-1, EBOV et ZIKV. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Flux de travail du protocole. Le nouveau flux de travail combine plusieurs techniques, y compris la filtration, les précipitations EV à l'aide du réactif de précipitation PEG, la séparation du gradient de densité d'iodixanol et l'enrichissement des nanoparticules des véhicules électriques. L'utilisation de ce protocole sépare les véhicules électriques de divers virus et fournit un échantillon de petit volume pour les essais en aval, y compris qPCR, western blot, spectrométrie de masse, séquençage de l'ARN, analyse cytokine, ELISA, et les essais cellulaires. Ce chiffre a été modifié à partir de DeMarino, et al.6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La méthode décrite permet d'améliorer le rendement des véhicules électriques et la séparation du virus des véhicules électriques en utilisant une approche combinée de l'isolement. Des quantités relativement importantes de matériau de départ (c.-à-d. supernatant cellulaire) peuvent être filtrées avant l'isolement des véhicules électriques par les précipitations, la séparation de la DG et l'enrichissement par nanoparticules, ce qui donne un volume final de 30 l, ce qui permet une utilisation immédiate dans une variété de essais en aval. L'utilisation de l'enrichissement des nanoparticules est essentielle car, par rapport à l'ultracentrifugation traditionnelle, ces nanoparticules enrichies de VE ont été montrées pour capturer les vésicules plus efficacement, donnant une quantité supérieure ou égale à la quantité de vésicules de 1 ml de culture supernatant par rapport à 10 ml de supernatant de culture ultracentrifuged15. Dans l'ensemble, le protocole décrit comprend la combinaison de plusieurs techniques bien connues et devrait donc présenter des difficultés limitées. Cependant, l'incorporation de nanoparticules enrichies de véhicules électriques introduit une nouvelle technique qui peut nécessiter un dépannage et/ou des modifications pour obtenir des résultats souhaitables en fonction de l'analyse en aval ou de la cible biologique d'intérêt. Nous recommandons que les nanoparticules soient incubées avec des supernatants de culture cellulaire filtrée pendant la nuit. Si la protéine ou l'ARN d'intérêt cible est de faible abondance dans le système modèle, le protocole peut être adapté pour augmenter la période d'incubation afin d'assurer la capture de la cible. L'utilisation de nanoparticules dans les essais en aval peut généralement être accomplie en rependant le granule dans le tampon d'échantillon désiré pour chaque analyse. Par exemple, les nanoparticules peuvent être rechargées directement dans le tampon Laemmli pour l'analyse de la tache occidentale. Le matériau capturé devrait alors être plus efficacement évacué des nanoparticules dans le SDS par le biais de cycles de chauffage et de vortexing. Pour parvenir à une séparation adéquate des protéines, il faut prendre soin de limiter la quantité de nanoparticules chargées dans le gel, et le gel doit être exécuté à environ 100 V pour s'assurer que toutes les particules restantes sont contenues dans les puits. En outre, pour la visualisation des protéines de faible poids moléculaire, un transfert humide de nuit obtient des résultats optimaux. Bien que l'utilisation de nanoparticules entraîne un enrichissement significatif des populations de vésicules, des mesures supplémentaires doivent être prises pour éliper les matières capturées des particules. En outre, l'élution du matériau peut potentiellement limiter l'utilité des véhicules électriques dans les essais fonctionnels en aval, car de nombreux tampons d'élution peuvent endommager l'intégrité de la membrane EV. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour concevoir une stratégie permettant l'élimination des vésicules intactes des nanoparticules après l'incubation. Un autre inconvénient de ces particules est le manque actuel de caractérisation. La coquille externe de la particule a été conçue pour exclure les molécules de poids moléculaire élevé. Cependant, le ciblage spécifique des particules vers les véhicules électriques n'a pas lieu, et par conséquent de nombreux facteurs de confusion et des signaux de fond peuvent potentiellement être présents dans les essais en aval.
La méthode décrite doit principalement être utilisée à des fins de laboratoire. Nous avons récemment mis au point d'autres méthodes pour élargir les capacités de notre approche combinée à des techniques supplémentaires pour isoler les véhicules électriques à partir de biofluides patients à petite échelle tels que le plasma et le FSC et la production commerciale à grande échelle de véhicules électriques. Pour l'isolement des véhicules électriques loin du virus dans le matériel patient, nous avons incorporé l'utilisation de la chromatographie d'exclusion de taille (SEC) colonnes, qui sont utilisés à la place d'un gradient de densité. Ces colonnes sont bénéfiques en ce qu'elles sont jetables et sont donc idéales dans les laboratoires de confinement élevé. Cependant, les colonnes SEC séparent les particules en fonction de leur taille, il s'ensuit que ce type de séparation ne s'applique qu'à la séparation de virus gros ou très petits, tels que l'EBOV (1 m) ou le ZIKV (40 nm), respectivement, des véhicules électriques ou de la séparation protéines libres. En ce qui concerne la production de véhicules électriques à grande échelle, les progrès récents dans les méthodes de filtration, à savoir la filtration par écoulement tangentiel (TFF), ont permis l'isolement efficace des véhicules électriques à partir de grands volumes d'échantillons. TFF a toujours été utilisé pour la purification des biomolécules nanométriques, y compris les virus, et grâce à l'optimisation des protocoles ce système a été adapté avec succès pour l'isolement des véhicules électriques24,25. En bref, au cours du processus DeFF, le fluide d'échantillon s'écoule tangentiellement à travers la surface d'une membrane semi-perméable qui retient sélectivement les vésicules en fonction de la taille et du poids moléculaire, permettant ainsi la séparation des véhicules électriques loin des protéines libres et d'autres contaminant les biomolécules26. Par rapport à l'ultracentrifugation, il a été signalé que le TFF se traduit par des rendements plus élevés, moins d'agrégation, et réduit la variabilité du lot au lot des véhicules électriques27. En outre, l'utilisation de TFF pour la bonne pratique de fabrication (GMP)-grade isolement des véhicules électriques pour l'application thérapeutique a également été signalé28. En raison de son évolutivité et de sa reproductibilité, cette technologie offre un grand potentiel pour la recherche future sur les véhicules électriques.
Les virus viennent dans différentes tailles et densités, donc en fonction du virus en question, l'optimisation de ce protocole peut être nécessaire. Pour les virus très importants tels qu'Ebola (1 m ou plus de longueur), une filtration simple peut être utilisée pour éliminer la grande majorité des virions et des grands organismes contaminants tels que les VLP et les corps apoptotiques14. Cela permet à la majeure partie de la séparation du virus loin des véhicules électriques d'être exécutable sur l'extrémité avant de la purification. Cependant, dans le cas de virus plus petits tels que l'entérovirus (30 nm), le virus Zika (40 nm), le virus de l'hépatite B (42 nm), le virus de l'hépatite C (55 nm), et d'autres, la fraction dans laquelle les sédiments virions devront être déterminés avant d'être plus en aval fonctionnel Analyses. On ne peut pas toujours approximer la fraction probable de sédimentation basée sur le seul diamètre des particules. Par exemple, le poliovirus, qui est de 30 nm de diamètre, est également connu pour être encapsulé dans les autophagosomes sécréteurs29,30,31,32,33, et est donc susceptible d'être trouvé sur le côté droit du gradient (fractions plus denses) plutôt que la gauche (fractions moins denses). Bien que nous ayons optimisé ce protocole dans le cas du VIH-1, du HTLV-1 et de l'EBOV VLP, d'autres virus devront être caractérisés pour affiner le protocole de purification spécifique loin des véhicules électriques.
Le protocole décrit ici (Figure 4) permet, pour la première fois, à l'utilisateur de séparer les véhicules électriques du virus avec une efficacité accrue et de plus petits volumes de matériel de départ par rapport à l'étalon-or de l'isolement EV, l'ultracentrifugation. Cette méthode peut être facilement adaptée aux conditions à l'étude, y compris les différentes tailles d'échantillon, les rendements requis, le type de matériau de départ (c.-à-d. le supernatant de culture par rapport au matériel patient), et divers virus différents de différentes tailles.
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Disclosures
B.L. est affilié à Ceres Nanosciences inc. qui produit des réactifs et/ou des instruments utilisés dans cet article. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts potentiel.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Kashanchi, en particulier Gwen Cox. Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health (NIH) (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, et NS099029 à F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
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