Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

वायरस से दूर उच्च उपज extracellular Vesicle तैयारी की शुद्धि

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59876
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 3, 4, 5, 1
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल ev वर्षा, घनत्व ढाल ultracentrifugation को शामिल करके उच्च दक्षता और उपज के साथ virions से दूर extracellular vesicles (EVs) अलग, और कण पर कब्जा एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह और शुरू करने की कमी के लिए अनुमति देने के लिए मात्रा आवश्यकताओं, सभी EV अनुसंधान में उपयोग के लिए reproduible तैयारी में जिसके परिणामस्वरूप.

Abstract

extracellular vesicle (EV) अनुसंधान के क्षेत्र में प्रमुख बाधाओं में से एक आज एक वायरल संक्रमण सेटिंग में शुद्ध EV तैयारी को प्राप्त करने की क्षमता है. प्रस्तुत विधि virions से दूर EVs को अलग करने के लिए होती है (यानी, एचआईवी-1), पारंपरिक ultracentrifugation तरीकों की तुलना में एक उच्च दक्षता और उपज के लिए अनुमति देता है. हमारे प्रोटोकॉल तीन कदम शामिल हैं: EV वर्षा, घनत्व ढाल जुदाई, और कण पर कब्जा. डाउनस्ट्रीम परख (यानी, पश्चिमी धब्बा, और पीसीआर) सीधे कण पर कब्जा निम्नलिखित चलाया जा सकता है। यह विधि अन्य अलगाव तरीकों पर फायदेमंद है (यानी, ultracentrifugation) के रूप में यह कम से कम शुरू संस्करणों के उपयोग के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, यह कई ultracentrifugation कदम की आवश्यकता होती है वैकल्पिक EV अलगाव तरीकों की तुलना में अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल है. हालांकि, प्रस्तुत विधि कार्यात्मक EV assays के अपने दायरे में सीमित है के रूप में यह हमारे कणों से बरकरार EVs elute करने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, इस विधि एक कड़ाई से अनुसंधान आधारित सेटिंग की दिशा में सिलवाया है और व्यावसायिक रूप से व्यवहार्य नहीं होगा.

Introduction

अनुसंधान extracellular vesicles (EVs) के आसपास केंद्रित, विशेष रूप से exossomes, EV का एक प्रकार 30-120 एनएम लेकर और तीन tetraspanin मार्करों CD81, CD9, और CD63 की उपस्थिति की विशेषता, मोटे तौर पर अलग करने के लिए तरीकों के विकास के द्वारा आकार दिया गया है और ब्याज के vesicles को शुद्ध. बहुमुखी तंत्र विच्छेदन करने की क्षमता जटिल और समय लेने वाली तकनीक है जो सामग्री, आकार की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ विभिन्न रास्ते के माध्यम से उत्पन्न vesicles की एक विषम आबादी से बना नमूने उत्पन्न करने के कारण बाधित किया गया है, और घनत्व. हालांकि यह लगभग सभी EV अनुसंधान के लिए एक मुद्दा है, यह विशेष महत्व का है जब वायरल संक्रमण के संदर्भ में EVs का अध्ययन, virions और वायरस की तरह कणों के रूप में (VLPs) ब्याज की vesicles के लिए व्यास में समान हो सकता है. उदाहरण के लिए, मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) लगभग 100 एनएम व्यास है, जो लगभग कई प्रकार के ईवीएस के रूप में एक ही आकार का है। इस कारण से, हमने इन समस्याओं को हल करने के लिए एक उपन्यास EV आइसोलेशन कार्यप्रवाह डिज़ाइन किया है.

EV अलगाव के वर्तमान सोने के मानक ultracentrifugation है. इस तकनीक में विभिन्न आशय घनत्व का उपयोग किया जाता है, जो vesicles को प्रत्येक चरण 1,2में उच्च घनत्व कणों के अंतर अवसादन के साथ अपकेंद्रण द्वारा अलग करने की अनुमति देता है। बरकरार कोशिकाओं को हटाने के लिए कई कम गति centrifugation कदम आवश्यक हैं (300-400 x ग्राम 10 मिनट के लिए), सेल मलबे ($2,000 x ग्राम के लिए 10 मिनट), और apoptotic निकायों / इन प्रारंभिक शुद्धि उच्च गति ultracentrifugation द्वारा पीछा कर रहे हैं (100,000-200,000 x g के लिए 1.5-2 ज) तलछट EVs के लिए. धो कदम आगे EV शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है, तथापि, यह अलग EVs की संख्या में कमी में परिणाम है, जिससे कुल उपज 3,4कम . इस विधि की उपयोगिता आगे कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता द्वारा सीमित है (लगभग 1 x 108) और एक बड़े नमूना मात्रा (gt; 100 एमएल) पर्याप्त परिणाम प्राप्त करने के लिए.

बढ़ती चिंताओं को दूर करने के लिए, हाइड्रोफिलिक पॉलिमर के साथ vesicles की वर्षा हाल के वर्षों में एक उपयोगी तकनीक बन गया है। पॉलीथीन ग्लाइकोल (PEG), या अन्य संबंधित वर्षा अभिकर्मकों, उपयोगकर्ता बस पसंद के अभिकर्मक के साथ नमूना incubating द्वारा एक नमूना के भीतर vesicles, वायरस, और प्रोटीन या प्रोटीन-RNA समुच्चय नीचे खींचने के लिए अनुमति देता है, एक भी कम गति के बाद अपकेंद्रण1,2,5. हमने पहले सूचित किया है कि पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन की तुलना में ईवीएस को वेग देने के लिए खूंटी या संबंधित विधियों का उपयोग काफी अधिकउपज6 में होता है . इस रणनीति तेज है, आसान है, अतिरिक्त महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, आसानी से स्केलेबल है, और EV संरचना को बरकरार रखता है. हालांकि, इस विधि की promiscuous प्रकृति के कारण, जिसके परिणामस्वरूप नमूने मुक्त प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, EVs की एक श्रृंखला, और virions इस प्रकार वांछित जनसंख्या प्राप्त करने के लिए आगे शुद्धि की आवश्यकता सहित उत्पादों की एक किस्म होतेहैं 1 ,2,7,8.

विभिन्न वर्षण विधियों से प्राप्त ईवीएस की विषमता को दूर करने के लिए घनत्व प्रवणता अतिकेंद्रीकरण (डीजी) का उपयोग उनके घनत्व के आधार पर बेहतर पृथक कणों के लिए किया जाता है। इस विधि को एक घनत्व ढाल माध्यम का उपयोग कर के रूप में एक stepwise ढाल का उपयोग किया जाता है, जैसे iodixanol या sucrose, जो प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, और वायरस या वायरस की तरह कणों (VLPs) से EVs के जुदाई के लिए अनुमति देता है. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, जबकि यह एक बार सोचा था कि डीजी EV subpopulations के अधिक सटीक जुदाई के लिए अनुमति दी, अब यह ज्ञात है कि आकार और विभिन्न vesicles के घनत्व ओवरलैप कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, एक्सोसोम के पास 1.08-1.22 g/mL9का फ्लोटेशन घनत्व होता है, जबकि गोलगी (COPI+ या क्लथ्रिन+) से अलग किए गए vesicles में 1.05-1.12 g/mL और अंत:द्रव्यीय जालिका (COPI+ से अलग किया जाता है । ) तलछट 1.18-1.25ग्राम / इसके अतिरिक्त, यदि कोई वायरल कणों वाले अंशों के विरुद्ध एक्सोसोमल भिन्नों की तुलना करना चाहता है, तो यह ब्याज के वायरस के घनत्व के आधार पर अधिक कठिन हो सकता है-एचआईवी-1 के अलावा अन्य वायरस हैं जो संभवतः एक ही पर साम्य हैं घनत्व के रूप में exosomal सकारात्मक भिन्न2.

अंत में, बहाव दृश्य और कार्यात्मक परख के लिए EV preps के संवर्धन EV अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है. EV समृद्ध नैनोकणों का उपयोग, विशेष रूप से, बहु कार्यात्मक hydrogel कणों कि व्यास में 700-800 एनएम रेंज, केंद्रित EV preps को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम हैं. वे एक उच्च आत्मीयता खुशबूदार चारा जो चयन को बढ़ावा देने के लिए एक झरझरा बाहरी sieving खोल द्वारा encapsulated के अधिकारी. इस अध्ययन में उपयोग किए गए नैनोकणों में विभिन्न कोर चारा (रिएक्टिव रेड 120 NT80; और सिबाक्रोन ब्लू F3GA NT82) के साथ दो अलग-अलग तैयारी शामिल हैं, जो विभिन्न अभिकर्मकों और बायोफ्लूइड्स से ईवीएस पर कब्जा बढ़ाने के लिए दिखाए गए हैं (सामग्री की तालिका देखें) )6,10,11,12,13,14,15. कणों iodixanol भिन्न, सेल संस्कृति supernatant, साथ ही इस तरह के प्लाज्मा, सीरम, मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ (सीएसएफ), और मूत्र6,13 के रूप में रोगी biofluids सहित कई प्रारंभिक सामग्री से EVs के आसान संवर्धन प्रदान करते हैं .

यहाँ प्रस्तुत विधि कई प्रौद्योगिकियों के संयोजन के द्वारा वर्तमान EV शुद्धि तकनीक की दक्षता में सुधार; EV वर्षा, घनत्व ढाल ultracentrifugation, और कण पर कब्जा, कार्यप्रवाह को कारगर बनाने के लिए, नमूना आवश्यकताओं को कम करने, और सभी EV अनुसंधान में उपयोग के लिए एक अधिक समरूप EV नमूना प्राप्त करने के लिए उपज में वृद्धि. इस विधि EVs और वायरल संक्रमण के दौरान उनकी सामग्री की जांच में विशेष रूप से उपयोगी है के रूप में यह एक 0.22 डिग्री निस्पंदन कदम बड़े, अवांछित vesicles और VLPs और कुल EV जनसंख्या के जुदाई को प्रभावी ढंग से प्रभावी ढंग से घनत्व के आधार पर बाहर करने के लिए भी शामिल है virions से EVs को अलग.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. निस्पंदन और अतिरिक्त वेसिकल्स की वर्षा (ईवीएस)

  1. संक्रमित या ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं (यानी, सेल लाइनों और/या प्राथमिक कोशिकाओं) से संस्कृति supernatant तैयार करने के लिए, संस्कृति लगभग 10 एमएल देर से लॉग कोशिकाओं के लिए 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 उपयुक्त संस्कृति माध्यम में (यानी, आरपीएमआई या 10% भ्रूण के साथ DMEM सीरम [FBS]).
    नोट: सभी संस्कृति मध्यम अभिकर्मकों EVs से मुक्त होना चाहिए, और या तो खरीदा जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें) या 90 मिनट के लिए 100,000 x ग्राम पर सीरम के पूर्व ultracentrifugation द्वारा घर में तैयार. इस प्रोटोकॉल सहित कई सामान्य रूप से इस्तेमाल किया सेल लाइनों के लिए सफल रहा है: सीईएम, Jurkat, 293T, U937 (असंक्रमित लाइनों), U1, J1.1, ACH2, HUT102, मीट्रिक टन-2 (एचआईवी-1 और HTLV-1 संक्रमित लाइनों), कई transfected कोशिकाओं, और प्राथमिक माइलॉयड और टी-कोशिकाओं (दोनों संक्रमित और असंक्रमित); हालाँकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी कक्ष प्रकार के लिए किया जा सकता है, जिसमें वे भी शामिल हैं जिन्हें विशेष मीडिया या संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता होती है. कोशिकाओं का घनत्व विभिन्न प्रकार के सेल के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। यह अनुशंसा की जाती है कि उच्चतम घनत्व 5 दिनों के बाद न्यूनतम सेल मौत के साथ इस्तेमाल किया जाए।
  2. 5 मिनट के लिए गोली कोशिकाओं के लिए 3,000 x ग्राम पर संस्कृति centrifuge और गोली त्याग.
  3. एक बाँझ 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर का उपयोग कर संस्कृति supernatant फ़िल्टर और एक साफ ट्यूब में छानना इकट्ठा।
  4. फ़िल्टर किए गए supernatant करने के लिए खूंटी वर्षण अभिकर्मक (1:1 अनुपात) के बराबर मात्रा जोड़ें। एक समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कई बार उलटा ट्यूब।
    नोट: भंवर मत करो.
  5. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट मिश्रण (O/
  6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज मिश्रण (आरटी) एक विषम EV गोली उपज के लिए।
    नोट: EV गोली सफेद या बंद सफेद रंग में दिखाई देना चाहिए.
  7. EV-depleted संस्कृति supernatant छोड़ दें.
  8. कैल्शियम और मैग्नीशियम (पीबीएस) के बिना 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन के 150-300 डिग्री एल में ईवी गोली को पुन: निलंबित करें और बर्फ पर रखें।

2. एक घनत्व ग्रेडिएंट का निर्माण

  1. 1x पीबीएस के साथ iodixanol घनत्व ढाल मध्यम मिश्रण करने के लिए 6 से 18% iodixanol से 1.2% वेतन वृद्धि में 1.2% अलग microcentrifuge ट्यूबों में 11 अलग 1 एमएल घनत्व भिन्न बनाने के लिए के रूप में चित्र 1Aमें दिखाया गया है.
  2. मिश्रण करने के लिए प्रत्येक ट्यूब भंवर.
  3. परत घनत्व एक पूर्व साफ और सूखी झूल बाल्टी ultracentrifuge ट्यूब में भिन्न #18 अंश के साथ शुरू करने और #6 अंश के साथ समाप्त के रूप में चित्र 1Bमें संकेत दिया.
    नोट: सभी ट्यूबों एक 10% ब्लीच स्प्रे deionized पानी के साथ 3x rinsing और क्रमिक अंशों की लोड करने से पहले बाँझ deionized पानी के एक अंतिम धोने के बाद का उपयोग कर sanitized किया जाना चाहिए.
  4. ultracentrifuge ट्यूब में स्तरित ढाल के शीर्ष करने के लिए resuspended EV गोली (300 $L) जोड़ें.
  5. 90 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,00 x g पर Ultracentrifuge।
  6. ध्यान से ultracentrifuge ट्यूब से 1 एमएल अंशों को हटाने और नए microcentrifuge ट्यूबों में प्रत्येक अंश हस्तांतरण.

3. EV भिन्नों का संवर्धन uUsing Nanoparticles

  1. NT80, NT82, और 1x PBS के बराबर संस्करणों का उपयोग कर नैनोकणों का एक 30% घोल बनाएँ।
    नोट: मिश्रण एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने से पहले भंवर किया जाना चाहिए.
  2. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में घोल का 30 डिग्री सेल्सियस जोड़ें जिसमें घनत्व भिन्न होते हैं और पिपेट/
  3. लगभग 20 आरपीएम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ईवी-समृद्ध नैनोकण युक्त घनत्व अंश माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबओ ओ/एन को घुमाएं।
  4. सेंट्रीफ्यूज घनत्व अंश माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब्स पर 20,000 x ग्राम के लिए 5 मिनट आर टी पर।
  5. तरल छोड़ें और 1x पीबीएस के साथ दो बार EV गोली धोने.
    नोट: नैनोकण छर्रों -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है या तुरंत विभिन्न बहाव परख के लिए इस्तेमाल किया (यानी, पीसीआर, पश्चिमी धब्बा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और अन्य परख)।

4. डाउनस्ट्रीम परख के लिए नैनोकण गोली की सिफारिश की तैयारी

  1. आरएनए अलगाव के लिए
    1. किट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 0.001% डाइएथिल पाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) के माध्यम से फ़िल्टर किए गए ऑटोक्लेव डीओनिएइज्ड पानी के 50 डिग्री एल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस के लिए
    1. गोली को सीधे 15 डिग्री सेल्सियस लामली बफर में पुन: निलंबित करें।
    2. गर्मी नमूना 3x पर 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 3 मिनट भंवर धीरे और प्रत्येक गर्मी चक्र के बीच नीचे स्पिन.
    3. 20,000 x ग्राम पर 15 s के लिए सेंट्रीफ्यूज नमूना और जेल पर सीधे सभी eluted सामग्री लोड.
      नोट: सबसे अच्छा परिणाम के लिए, जेल पर लोड कणों की मात्रा को सीमित करने और किसी भी शेष कणों कुओं के लिए निहित हैं सुनिश्चित करने के लिए 100 वी पर जेल चलाते हैं।
  3. ट्रिप्सिन पाचन के लिए
    1. एल्किलेशन और नमूने के ट्रिप्सिनाइजेशन से पहले यूरिया के 20 डिग्री एल में गोली को पुन: निलंबित करें। नैनोकणों को 10 मिनट के लिए आरटी में 14,000 x ग्राम सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा गोली मार दी जा सकती है। ट्रिप्सिनीकृत पेप्टाइड युक्त नमूना एक साफ संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

खूंटी वर्षण ईवी उपज बढ़ जाती है
EV अलगाव के लिए हमारे संयोजन दृष्टिकोण काफी अधिक EV वसूली के मामले में कुशल के रूप में पारंपरिक ultracentrifugation की तुलना में है, के रूप में शुरू सामग्री की मात्रा में 90% की कमी से स्पष्ट आवश्यक. Ultracentrifugation, ईवी अलगाव में वर्तमान सोने के मानक, संस्कृति supernatant के लगभग 100 एमएल की आवश्यकता के लिए डाउनस्ट्रीम परख के लिए एक पर्याप्त EV तैयारी का उत्पादन है, जबकि हमारे उपन्यास प्रोटोकॉल केवल 10 एमएल की आवश्यकता है. इस कमी खूंटी EV वर्षा अभिकर्मक जो EV उपज में एक महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदान करता है के उपयोग के माध्यम से संभव बनाया है के रूप में नैनोट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) द्वारा मापा. चित्र 2कमें परिणाम , जो पहलेप्रकाशित 6किए गए हैं , यह दर्शाते हैं कि संस्कृति के 10 एमएल का उपयोग करते समय अति-संक्षिपद पीईजी वर्षण के परिणामस्वरूप 7.27 x 10EVs की वसूली हुई, जो संख्या से लगभग 500 गुना अधिक थी EVs की एक ही प्रारंभिक सामग्री से बरामद ultracentrifugation का उपयोग कर (1.45 x 108). एक्सोसोम के अलगाव की बढ़ी हुई दक्षता, एक विशिष्ट EV उपप्रकार, भी अच्छी तरह से विशेषता एक्सोसोम मार्कर प्रोटीन, CD81, CD63, और CD9 के स्तर में वृद्धि के द्वारा स्पष्ट रूप में मनाया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण या तो ultracentrifugation या EV वर्षा से उत्पादित EV preps की तुलना एक खूंटी वर्षण अभिकर्मक का उपयोग कर चित्र 2Bमें दिखाया गया है. इन परिणामों CD81 में एक 3,000 गुना वृद्धि, CD63 में 4 गुना वृद्धि, और एक 40 गुना वृद्धि CD9 में वृद्धि के रूप में densitometry विश्लेषण द्वारा मापा दिखा. एक साथ लिया, इन परिणामों का सुझाव है कि उल्लिखित प्रोटोकॉल न केवल कुल EV उपज बढ़ जाती है, लेकिन यह भी extosorsomes की वसूली को बढ़ाता है जब ultracentrifugation की तुलना में.

ईवीएस की विशेषता और एचआईवी-1 वायरस से दूर ईवीएस की जुदाई
नैनोकण संवर्धन के बाद प्रत्येक अंश में मौजूद vesicles की विशेषता के लिए, EVs uninfected CEM या एचआईवी-1 संक्रमित U1 सेल संस्कृति supernatant से अलग थे उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर और प्रत्येक के पश्चिमी धब्बा का उपयोग कर विशेषता नैनोकण समृद्ध आयोडिक्सेनॉल अंश। चित्रा 3क में डेटा हमारे पहले प्रकाशित परिणाम दिखाते हैं जो प्रत्येक अंश (सीईएम कोशिकाओं; शीर्ष पैनल) में तीन एक्सोसोमल टेट्रास्पैनिन (CD81, CD63, और CD9) की उपस्थिति या अनुपस्थिति प्रदर्शित करते हैं। परिणाम ों से संकेत मिलता है कि एक्सोसोम, के रूप में अंश के भीतर सभी तीन tetraspanins की उपस्थिति द्वारा परिभाषित, तीन अलग आबादी में पाए जाते हैं: Exo #1 जो भिन्न शामिल हैं 10.8-12.0, Exo #2 जो भिन्न भी शामिल है 15.6-16.8, और Exo $3 जो भी शामिल है केवल 18.0 अंश. तीन अलग आबादी की उपस्थिति के बावजूद, प्रोटोकॉल प्रत्येक अंश के भीतर EVs के अतिरिक्त प्रकार की उपस्थिति की संभावना से इनकार नहीं कर सकता. इसके अलावा, इन परिणामों निश्चित संभावना है कि इन आबादी है कि परीक्षण tetraspanin मार्करों के संयोजन के लिए सकारात्मक रहे हैं में vesicles हैं बाहर नहीं है. इन EVs तो अतिरिक्त शुद्धिकरण रणनीतियों द्वारा आगे अलग किया जा सकता है.

EV/exosome अनुसंधान के तेजी से विकासशील क्षेत्र उनकी खोज के बाद से विस्फोट हो गया है और इन vesicles के लिए कई newfound कार्यों और अनुप्रयोगों में हुई है. विशेष रूप से, न केवल सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान में intracellular दूत के रूप में उनकी भूमिका, लेकिन यह भी रोग में महत्वपूर्ण संसाधनों का उपयोग करने के लिए प्रभाव और extracellular vesicles की उपयोगिता विच्छेदन के लिए नेतृत्व किया गया है, विशेष रूप से exosomes, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं पर16 , 17 , 18. कई अध्ययनों ने एचआईवी-16,10,12,19,20,21 सहित विभिन्न प्रकार के संक्रमणकेशियों में ईवीएस को फंसाया है . , 22.तथापि, ईवी और virions के बीच आकार समानता इन EV-मध्यस्थ तंत्र को परिभाषित करने में एक संभावित बाधा प्रस्तुत करता है. इस चिंता को दूर करने के लिए, हमने ईवी आबादी को virions से प्रभावी रूप से अलग करने के लिए घनत्व प्रवणता को लागू करने के लिए अपने प्रोटोकॉल को तैयार किया है। इस उद्देश्य के लिए, एचआईवी-1 संक्रमित कोशिकाओं से सेल संस्कृति supernatant प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अधीन थे और एचआईवी-1 Gag p24 की उपस्थिति के लिए पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण करने के लिए निर्धारित करने के लिए जो अंश या भिन्न एचआईवी-1 virions निहित. चित्र 3क (मध्य फलक) में दिखाए गए परिणाम तीन स्वतंत्र परिस्थितियों में p24 के स्थानीयकरण से पता चलता है: एक inducer की अनुपस्थिति में, एक inducer की उपस्थिति में (Phorbol 12-myristate 13-ऐसीटेट; पीएमए), और पीएमए और संयोजन एंटीरेट्रोवायरल थेरेपी (सीएआरटी), एचआईवी-1 के लिए मानक उपचार की उपस्थिति में। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि एचआईवी-1 वायरस अंश करने के लिए स्थानीयकृत है 16.8 p24 और उसके uncleaved polyprotein Pr55 की उपस्थिति से मापा के रूप में. इसके अलावा, जब कोशिकाओं cART के अधीन हैं, जो Indinavir, एक प्रोटीज़ अवरोध करनेवाला जो Pr55 से p24 के दरार को रोकता है शामिल हैं, कोई p24 किसी भी अंश में पाया गया था. इसके बजाय, केवल Pr55 का पता लगाया गया था और 16.8-18.0 अंशों में मौजूद था, और अधिक घने भागों में वायरस की एक बदलाव का संकेत. इसी तरह के परिणाम प्राथमिक मैक्रोफेज (कम पैनल) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। हालांकि एक्सो #2 और Exo #3 वायरस के साथ आबादी के सह-अवसाद में वर्णित प्रोटोकॉल परिणाम, Exo #1 जनसंख्या (fractions 10.8-12.0) वायरस मुक्त बने रहे, बहाव के लिए अनुमति देता है वायरस संदूषण से मुक्त assays.

EVs से दूर वायरस के जुदाई के इस प्रकार हमें EVs में प्रवेश करने या मुक्त प्रोटीन के रूप में संक्रमित कोशिकाओं से स्रावित किया जा रहा वायरस के टुकड़े की संभावना को संबोधित करने के लिए अनुमति देता है. चित्र ाालों में परिणाम ों यों कि एच आई वी-१ नेफ प्रोटीन एक्सो #2 और एक्सो #3 आबादी के अलावा एक्सो #1 जनसंख्या में पाया जा सकता है। नेफ भी 6.0 अंश में प्रकट होता है, यह दर्शाता है कि नेफ संभावित रूप से एक मुक्त प्रोटीन के रूप में और एक EV के भीतर संक्रमित कोशिकाओं से स्रावित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, एचआईवी-1 Vpr प्रोटीन 6.0 अंश में पाया जाता है, जबकि एचआईवी-1 टाट प्रोटीन मुख्य रूप से 6.0 अंश में पाया जाता है, लेकिन यह भी भिन्न में प्रकट होता है 7.2-9.6. वर्तमान में हम ELISA द्वारा टाट प्रोटीन की उपस्थिति के लिए सभी भागों का परीक्षण कर रहे हैं. इन परिणामों से संकेत मिलता है कि दोनों Tat और Vpr संक्रमित कोशिकाओं से स्रावित किया जा सकता है, मुक्त प्रोटीन के रूप में होने की संभावना है, जबकि Tat भी EVs में शामिल किया जा सकता है. सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि ईवी अलगाव की हमारी विधि एचआईवी-1 virions (एक्सो #2 और #3) से दूर exosomes (एक्सो #1) को सफलतापूर्वक अलग कर सकती है और एचआईवी-1 संक्रमित कोशिकाओं से ईवीएस में कुछ एचआईवी-1 प्रोटीन होते हैं, जो एचआईवी-1 रोगजनन को प्रभावित कर सकते हैं।

EVs की विशेषता और अन्य वायरस से दूर EVs की जुदाई
अन्य वायरल संक्रमण मॉडल के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए, हम कई अलग अलग वायरस से संक्रमित कोशिकाओं से vesicles विशेषता है. चित्र 3C वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार वर्षा, पृथक्करण और संवर्धन के बाद पहले से प्राप्त आशय और वायरस वितरण का एक उदाहरण दिखाता है। जैसा कि पहले चित्र 3कमें दिखाया गया है , एक्सोसोम (CD9+CD63+ CD81+) तीन अलग-अलग आबादी में मौजूद हैं (एक्सो #1, भिन्न 10.8-12.0; Exo #2, भिन्न 15.6-16.8, और Exo $3, 18.0 अंश) और एचआईवी-1 वायरस उच्च घनत्व 16.8 और 18.0 अंश (लेन 10-11) के लिए localizes. आश्चर्य नहीं, जब मानव टी-lymphotropic वायरस प्रकार 1 (HTLV-1) से जारी EVs की विशेषता के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने, एक retrovirus कि वयस्कों में कैंसर का कारण जाना जाता है, हम एचआईवी-1 से संबंधित EVs के समान परिणाम देखा. चित्र 3 सी में तीसरे पैनल से पता चलता है कि एचटीएलवी-1 वायरस को मुख्य रूप से उच्चतम घनत्व अंश (18.0) में स्थानीयकृत किया गया था और कुछ हद तक, HTLV-1 मैट्रिक्स प्रोटीन (p19) की उपस्थिति के अनुसार 13-2-16.8 अंश ों। इसके अलावा, हमने पहले पाया है कि एचटीएलवी-1 ट्रांसएक्टिविंग प्रोटीन, टैक्स, जो एचटीएलवी-1 विरिऑन से अनुपस्थित है, एचटीएलवी-1 संक्रमित कोशिकाओं से जारी एक्सोसोम के भीतर मौजूद है15,23. चित्र 3C के आंकड़ों से पता चलता है कि कर निम्न घनत्व भिन्नों (6.0-12.0) में मौजूद था, जिनमें से दो हमने एक्सोसोम (10.8 और 12.0) को शामिल करने के लिए दिखाया है।

इसके बाद, हमने इबोला वायरस (ईबीओवी) और जिका वायरस (ज़िकेवी) जैसे बड़े और छोटे वायरसों के संदर्भ में अलगाव प्रोटोकॉल का परीक्षण किया, क्योंकि एचआईवी-1 और एचटीएलवी-1 virions दोनों रेट्रोवायरस और व्यास में बहुत समान हैं। एक किराए के जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL-2) EBOV विधानसभा और बाहर निकलने के मॉडल के रूप में वीएलपी का उपयोग करना, हमने पाया कि वीएलपी, जो लंबाई में लगभग 1 $m है, 0.22 मीटर निस्पंदन (मध्य पैनल, चित्रा 3C)के अभाव में उच्चतम घनत्व अंश (18.0) को स्थानीयकृत करता है। इसके अलावा, जब VP40, EBOV मैट्रिक्स प्रोटीन, उच्च स्तर पर व्यक्त की है, यह कई अलग अलग तंत्र के माध्यम से सेल से स्रावित होता है जिसके परिणामस्वरूप हर घनत्व अंश में VP40 की उपस्थिति होती है, जिसमें वे भी शामिल हैं जो एक्सोसोम को13 स्थानीयकृत किया जाता है , 14. इसके विपरीत, एचआईवी-1 virions की तुलना में काफी छोटे हैं, व्यास में लगभग 40 एनएम को मापने. चित्रा 3सी के निचले फलक में प्रतिनिधि आरेख, क्रमशः मुक्त वायरस और ईवी-संप्रगित वायरस दोनों की उपस्थिति का सुझाव देते हुए, कम घनत्व (6.0-8.4) और उच्च घनत्व (15-6-18.0) भिन्नों में $iKV virions की उपस्थिति को दर्शाता है।

Figure 1
चित्र 1: एक iodixanol घनत्व ढाल का निर्माण. (ए) प्रत्येक घनत्व अंश (अंश ) बनाने के लिए उपयोग किए गए आयोडिक्सानॉल और पीबीएस की सापेक्ष मात्रा। भिन्न - प्रत्येक अंश में शामिल iodixanol के प्रतिशत को दर्शाता है. उनके सापेक्ष घनत्व और ढाल में नियुक्ति सबसे भारी से हल्का करने के लिए चित्रित कर रहे हैं. (ख) अतिकेंद्री ट्यूब में घनत्व भिन्नों की नियुक्ति (6.0-18) के साथ-साथ तीन ईवी आबादी (एक्सो #1, एक्सो #2, एक्सो #3), एक्सो-जैसे वेस्क्यूल्स और प्रोटीन परिसरों के स्थान को दर्शाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: खूंटी वर्षण अभिकर्मक EV उपज बढ़ जाती है। (ए) ईवी वसूली की तुलना करने के लिए, ईवीएस को 5 डी एचआईवी-1 संक्रमित मोनोसाइट (यू1) संस्कृति सुपरनेंट (10 एमएल ) पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन (100,000 x ग्राम) या खूंटी वर्षण अभिकर्मक (एक 1:1 अनुपात पर इन्क्यूबेशन) से अलग कर दिया गया था। दोनों संवर्धन प्रक्रियाओं से EVs DeMarino, एट अल6में वर्णित के रूप में जिसके परिणामस्वरूप EV एकाग्रता का आकलन करने के लिए नैनोट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. एनटीए को तकनीकी त्रिफला में 11 स्वतंत्र पदों पर मापा गया था। नीले रंग की सलाखों के 33 माप के एक औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं - एस.डी. सांख्यिकीय महत्व एक दो पूंछ छात्र टी-परीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था; पी और 0.001. 5 दिन सीईएम संस्कृति supernatant से बी EVs या तो ultracentrifugation (यूसी) या खूंटी वर्षा iodixanol घनत्व जुदाई के बाद का उपयोग कर. Ultracentrifugation संस्कृति supernatant के 100 एमएल का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था (लेन 1) जबकि खूंटी वर्षा और बाद में iodixanol भिन्नण संस्कृति supernatant के 10 एमएल का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया (लेन 2). अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन से प्राप्त कुल ईवी गोली और खूंटी/आयोडिक्सेनॉल जुदाई से 10.8 अंश का विश्लेषण पश्चिमी दाग द्वारा एक्सोसोमल मार्कर प्रोटीन (सीडी81, सीडी63, और सीडी 9) की उपस्थिति के लिए पश्चिमी दाग द्वारा किया गया था जिसमें एक नियंत्रण के रूप में एक्टिन शामिल थे। स्पष्टता के लिए, समान जोखिम के साथ एक ही दाग से चयनित गलियों पैनल बी में दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा DeMarino, एट अल से संशोधित किया गयाहै. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: वायरस से दूर EVs के अलगाव. (क)असंक्रमित सीईएम कोशिकाओं (शीर्ष पैनल), एचआईवी-1 (बा-एल; MOI: 0.01) संक्रमित U1 कोशिकाओं (जेडपीएमए और जेडएआरटी उपचार; मध्य पैनल) या एचआईवी-1 संक्रमित प्राथमिक मैक्रोफेज (नीचे पैनल) को रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर खूंटी वर्षा अभिकर्मक के साथ इनक्यूबेट किया गया था। EVs एक iodixanol घनत्व ढाल का उपयोग कर भिन्न में अलग किया गया. सभी भागों से EVs 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर NT80/82 कणों का उपयोग कर समृद्ध किया गया। सीईएम नैनोपेलेट्स का विश्लेषण एक्सोसोमल मार्कर प्रोटीन CD81, CD63 और CD9 की उपस्थिति के लिए पश्चिमी दाग का उपयोग करके किया गया। यू1 (जेडपीएमए और जेडकार्ट उपचार) और एचआईवी-1 संक्रमित प्राथमिक मैक्रोफेज का एचआईवी-1 गैग प्रोटीन (p24 और Pr55; cleaved और अशुद्ध एचआईवी-1 गैग पॉलीप्रोटीन, क्रमशः) की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया था, साथ ही साथ सीडी63। एक नियंत्रण के रूप में एक्टिन के लिए Blots की जांच की गई. यह सच है कि एक्सोसोम आबादी (CD81+CD63+CD9+) लाल रंग में रेखांकित कर रहे हैं. यह आंकड़ा DeMarino से संशोधित किया गया है, एट अल6 (बी)संक्रमित U1 कोशिकाओं से पांच दिवसीय संस्कृति supernatants खूंटी वर्षा अभिकर्मक के साथ रात में 4 डिग्री सेल्सियस में incubated थे. EVs एक iodixanol घनत्व ढाल का उपयोग कर भिन्न में अलग किया गया. सभी भागों से EVs 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर NT80/82 कणों का उपयोग कर समृद्ध किया गया। भिन्न एचआईवी-1 नेफ, Vpr, और टाट की उपस्थिति के लिए एक पश्चिमी दाग पर चला रहे थे. Actin एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. यह सच है exsome आबादी (CD81+CD63+CD9+) लाल रंग में उल्लिखित के रूप में पहले DeMarino में परिभाषित कर रहे हैं, एट अल6 (सी) पहले चार से EV जुदाई प्रोफाइल की विशेषता के प्रतिनिधि चित्रण विभिन्न वायरस: एचआईवी-1, HTLV-1, EBOV, और ]iKV. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो. उपन्यास कार्यप्रवाह निस्पंदन सहित कई तकनीकों को जोड़ती है, ईवी वर्षा खूंटी वर्षा अभिकर्मक का उपयोग कर, iodixanol घनत्व ढाल जुदाई, और EVs के नैनोकण संवर्धन. इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न वायरस से EVs अलग और नीचे की ओर परख के लिए एक छोटी सी मात्रा नमूना प्रदान करता है सहित QPCR, पश्चिमी धब्बा, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री, आरएनए अनुक्रमण, साइटोकीन विश्लेषण, एलिसा, और सेल आधारित परख. यह आंकड़ा DeMarino, एट अल से संशोधित किया गयाहै. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

रेखांकित विधि बढ़ाया EV उपज और अलगाव के लिए एक संयोजन दृष्टिकोण का उपयोग EVs से वायरस की जुदाई के लिए अनुमति देता है. प्रारंभिक सामग्री की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (यानी, सेल supernatant) वर्षा, डीजी जुदाई, और नैनोकण संवर्धन द्वारा EV अलगाव से पहले फ़िल्टर किया जा सकता है, $ 30 $L के एक अंतिम मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप, की एक किस्म में तत्काल उपयोग के लिए अनुमति देता है डाउनस्ट्रीम परख. नैनोकण संवर्धन का उपयोग आवश्यक है के रूप में, पारंपरिक ultracentrifugation की तुलना में, इन EV समृद्ध नैनोकणों vesicles अधिक कुशलता से कब्जा करने के लिए दिखाया गया है, संस्कृति के 1 एमएल से vesicles की राशि से अधिक या बराबर उपज अतिकेंद्रकी संस्कृति के 10 एमएल की तुलना में सुपरनेंट15. कुल मिलाकर, वर्णित प्रोटोकॉल कई प्रसिद्ध तकनीकों का संयोजन भी शामिल है और इसलिए सीमित कठिनाइयों पेश करना चाहिए. हालांकि, EV-समृद्ध नैनोकणों का समावेश एक नई तकनीक है जो समस्या निवारण और/या संशोधनों की आवश्यकता के लिए डाउनस्ट्रीम परख या ब्याज की जैविक लक्ष्य के आधार पर वांछनीय परिणाम प्राप्त कर सकते हैं परिचय. हम अनुशंसा करते हैं कि नैनोकणों रात भर फ़िल्टर्ड सेल संस्कृति supernatants के साथ incubated किया जा। यदि लक्ष्य प्रोटीन या ब्याज की आरएनए मॉडल प्रणाली में कम बहुतायत की है, प्रोटोकॉल के लिए ऊष्मायन अवधि बढ़ाने के लिए लक्ष्य का कब्जा सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. बहाव परख में नैनोकणों का उपयोग आम तौर पर प्रत्येक परख के लिए वांछित नमूना बफर में गोली ressssssssदबा द्वारा पूरा किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, नैनोकणों पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए Laemli बफर में सीधे resuspended किया जा सकता है। कब्जा कर लिया सामग्री तो और अधिक कुशलता से हीटिंग और भंवर चक्र के माध्यम से एसडीएस में नैनोकणों से eluted किया जाना चाहिए। प्रोटीन की पर्याप्त जुदाई को प्राप्त करने के लिए, जेल में लोड नैनोकणों की मात्रा को सीमित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, और जेल को लगभग 100 वी पर चलाया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि किसी भी शेष कणों को कुओं में समाहित किया गया है। इसके अलावा, कम आणविक वजन प्रोटीन के दृश्य के लिए, एक रात गीला हस्तांतरण इष्टतम परिणाम प्राप्त करता है. हालांकि नैनोकणों के उपयोग के परिणामस्वरूप vesicle आबादी का महत्वपूर्ण संवर्धन होता है, कणों से कैप्चर की गई सामग्री को पूरा करने के लिए अतिरिक्त कदम उठाए जाने चाहिए। इसके अलावा, सामग्री के elution संभावित downstream कार्यात्मक परख में EVs की उपयोगिता को सीमित कर सकते हैं के रूप में कई elution बफ़र्स EV झिल्ली की अखंडता को नुकसान पहुंचा सकता है. अतिरिक्त अनुसंधान के लिए एक रणनीति इंजीनियर की जरूरत है नैनोकणों के बाद ऊष्मायन से बरकरार vesicles को हटाने के लिए अनुमति देने के लिए. इन कणों का एक और नुकसान विशेषता की वर्तमान कमी है. कण के बाहरी खोल उच्च आणविक वजन अणुओं को बाहर करने के लिए डिजाइन किया गया है. हालांकि, EVs के लिए कणों की विशिष्ट लक्ष्यीकरण जगह नहीं ले करता है, और एक परिणाम के रूप में कई confounding कारकों और पृष्ठभूमि संकेतों संभवतः बहाव परख में मौजूद हो सकता है.

वर्णित विधि मुख्य रूप से प्रयोगशाला प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. हम हाल ही में इस तरह के प्लाज्मा और सीएसएफ और बड़े पैमाने पर, वाणिज्यिक EV उत्पादन के रूप में छोटे पैमाने पर, रोगी biofluids से EVs अलग करने के लिए अतिरिक्त तकनीकों के लिए हमारे संयोजन दृष्टिकोण की क्षमताओं का विस्तार करने के लिए वैकल्पिक तरीके विकसित किया है। रोगी सामग्री में वायरस से दूर ईवीएस के अलगाव के लिए हमने आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) कॉलम के उपयोग को शामिल किया है, जो घनत्व प्रवणता के स्थान पर उपयोग किया जाता है। इन स्तंभों में फायदेमंद है कि वे डिस्पोजेबल हैं और इसलिए उच्च रोकथाम प्रयोगशालाओं में आदर्श हैं. हालांकि, एसईसी कॉलम आकार के अनुसार अलग कणों, इसलिए, यह इस प्रकार है कि जुदाई के इस प्रकार के केवल बड़े या बहुत छोटे वायरस, जैसे EBOV ($1 $m) या ]40 एनएम) के विभाजन के लिए लागू है, क्रमशः, EVs से या जुदाई से दूर मुक्त प्रोटीन. बड़े पैमाने पर EV उत्पादन के संदर्भ में, निस्पंदन आधारित तरीकों में हाल ही में प्रगति, अर्थात् स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन (TFF), बड़े नमूना मात्रा से EVs के कुशल अलगाव के लिए अनुमति दी है. टीएफएफ ऐतिहासिक रूप से वायरस सहित नैनोसाइज़्ड जैव अणुओं के शोधन के लिए इस्तेमाल किया गया है, और प्रोटोकॉल के अनुकूलन के माध्यम से इस प्रणाली को सफलतापूर्वक EVs24,25के अलगाव के लिए अनुकूलित किया गया है। संक्षेप में, TFF प्रक्रिया के दौरान, नमूना तरल पदार्थ एक अर्द्ध पारगम्य झिल्ली जो चुनिंदा आकार और आणविक वजन के आधार पर vesicles बरकरार रखती है की सतह के पार स्पर्शरेखीय बहती है, इस प्रकार मुक्त प्रोटीन और अन्य से दूर EVs के अलगाव के लिए अनुमति देता है जैव अणुओं को दूषितकरना 26| जब ultracentrifugation की तुलना में, यह सूचित किया गया है कि TFF अधिक पैदावार में परिणाम, कम एकत्रीकरण, और EVs27की बहुत-से-लॉट परिवर्तनशीलता कम कर देता है. इसके अतिरिक्त, चिकित्सीय अनुप्रयोग के लिए ईवीएस के अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) ग्रेड अलगाव के लिए टीएफएफ के उपयोग की भी सूचना दी गईहै। इसकी मापनीयता और पुन: उत्पादनीयता के कारण, यह प्रौद्योगिकी भविष्य के ईवी अनुसंधान के लिए महान क्षमता प्रदान करती है।

वायरस विभिन्न आकारों और घनत्व में आते हैं, इसलिए प्रश्न में वायरस पर निर्भर करता है, इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. इबोला ($1 मीटर या लंबाई में बड़ा) जैसे बहुत बड़े वायरस के लिए, सरल निस्पंदन का उपयोग वीरांगनाओं के विशाल बहुमत को हटाने के लिए किया जा सकता है और वीएलपी और एपोप्टोटिक निकायों14जैसे बड़े संदूषण निकायों को दूर किया जा सकता है। यह वायरस के अलगाव के अधिकांश के लिए अनुमति देता है दूर EVs से शुद्धि के सामने अंत पर निष्पादन योग्य हो. हालांकि, इस तरह के enterovirus के रूप में छोटे वायरस के मामले में ($30 एनएम), जिका वायरस ($40 एनएम), हेपेटाइटिस बी वायरस ($42 एनएम), हेपेटाइटिस सी वायरस ($55 एनएम), और अन्य, अंश जिसमें virions तलछट आगे बहाव कार्यात्मक से पहले निर्धारित करने की आवश्यकता होगी विश्लेषण. अकेले कण व्यास के आधार पर अवसादन के संभावित अंश का हमेशा अनुमान नहीं लगा सकता। उदाहरण के लिए, पोलियो वायरस, जो व्यास में 30 एनएम है, को स्रावी ऑटोफैगोसोम29,30,31,32,33में समझाया जा सकता है, और इसलिए इस पर पाए जाने की संभावना है बाएँ (कम सघन भिन्न) के बजाय ढाल के दाईं ओर (denser भिन्न). जबकि हम एचआईवी-1, HTLV-1, और EBOV VLPs के मामले में इस प्रोटोकॉल अनुकूलित है, अतिरिक्त वायरस उनके विशिष्ट शुद्धि ईवीएस से दूर के लिए प्रोटोकॉल ठीक धुन करने के लिए विशेषता की आवश्यकता होगी.

यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल (चित्र 4), पहली बार के लिए, उपयोगकर्ता बढ़ाया दक्षता और शुरू सामग्री के छोटे संस्करणों के साथ वायरस से EVs अलग करने के लिए ईवी अलगाव, ultracentrifugation के सोने के मानक की तुलना में अनुमति देता है. इस विधि को आसानी से अलग नमूना आकार, आवश्यक पैदावार, शुरू सामग्री प्रकार (यानी, संस्कृति supernatant बनाम रोगी सामग्री), और विभिन्न आकारों के विभिन्न विभिन्न वायरस सहित हाथ में शर्तों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

बी.एल. इस लेख में अभिकर्मकों और /या उपकरणों का उत्पादन करता है कि Ceres Nanosciences inc. के साथ संबद्ध है। अन्य सभी लेखकों के हित के कोई संभावित संघर्ष की घोषणा.

Acknowledgments

हम Kashanchi प्रयोगशाला, विशेष रूप से वेन कॉक्स के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह कार्य राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान (एआई078859, एआई074410, एआई127351-01, एआई043894 और एनएस099029 से एफ.के.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CEM CD4+ Cells NIH AIDS Reagent Program 117 CEM
DPBS without Ca and Mg (1x) Quality Biological 114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer Systems Biosciences EXOMAX24A-1 PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS Thermo Fisher Scientific A2720801
Fetal Bovine Serum Peak Serum PS-FB3 Serum
HIV-1 infected U937 Cells NIH AIDS Reagent Program 165 U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA Thermo Scientific 723-2520
Nanotrap (NT80) Ceres Nanosciences CN1030 Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82) Ceres Nanosciences CN2010 Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556-250mL Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 151 extracellular vesicles एक्सोसोम वायरस शुद्धि घनत्व ढाल ultracentrifugation वर्षा EV समृद्ध नैनोकणों
वायरस से दूर उच्च उपज extracellular Vesicle तैयारी की शुद्धि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DeMarino, C., Barclay, R. A., Pleet, … More

DeMarino, C., Barclay, R. A., Pleet, M. L., Pinto, D. O., Branscome, H., Paul, S., Lepene, B., El-Hage, N., Kashanchi, F. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (151), e59876, doi:10.3791/59876 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter