Summary
이 프로토콜은 EV 강수량, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 포획을 통합하여 고효율 및 수율을 가진 비리온으로부터 세포외 소포(EV)를 분리하여 간소화된 워크플로우와 시동 감소를 허용합니다. 모든 EV 연구에서 사용할 수 있는 재현 가능한 준비를 할 수 있습니다.
Abstract
세포외 소포 (EV) 연구 오늘의 필드에 있는 중요한 장애물의 한은 바이러스성 감염 조정에 있는 정제한 EV 준비를 달성하는 기능입니다. 제시된 방법은 기존의 초원심분리 방법에 비해 더 높은 효율과 수율을 허용하는 비리온(즉, HIV-1)으로부터 EV를 분리하기 위한 것입니다. 당사의 프로토콜에는 EV 강수량, 밀도 구배 분리 및 입자 캡처의 세 단계가 포함되어 있습니다. 다운스트림 어세이(즉, 웨스턴 블롯 및 PCR)는 입자 캡처 직후에 실행할 수 있습니다. 이 방법은 최소한의 시작 볼륨을 사용할 수 있으므로 다른 절연 방법(즉, 초원심분리)보다 유리합니다. 또한, 여러 초원심분리 단계를 요구하는 대체 EV 절연 방법보다 사용자 친화적이다. 그러나, 제시된 방법은 우리의 입자로부터 손상되지 않은 EV를 용출하기 어렵기 때문에 기능적 EV 어종의 범위에 제한된다. 또한,이 방법은 엄격하게 연구 기반 설정으로 조정되며 상업적으로 실행 가능하지 않을 것입니다.
Introduction
세포외 소포(EV)를 중심으로 한 연구는, 특히 엑소좀, 30-120 nm에 이르는 EV의 일종이며, 3개의 테트라스파닌 마커 CD81, CD9 및 CD63의 존재를 특징으로 하며, 크게 분리하고 관심의 소포를 정화. 다각적 메커니즘을 해부하는 능력은 다양한 내용, 크기 및 다양한 경로를 통해 생성 된 소포의 이기종 집단으로 구성된 샘플을 생성하는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 기술로 인해 방해되었습니다. 밀도. 이것은 거의 모든 EV 연구를 위한 문제점이있는 동안, 바이러스 감염의 맥락에서 EV를 공부할 때 특히 중요합니다, virions와 바이러스 같이 입자 (VLPs)는 관심있는 소포에 직경에서 유사할 수 있기 때문에. 예를 들면, 인간 면역 결핍 바이러스 타입-1 (HIV-1)는 대략 100 nm 직경이고, 이는 많은 유형의 EV와 거의 같은 크기입니다. 이러한 이유로 이러한 문제를 해결하기 위해 새로운 EV 격리 워크플로우를 설계했습니다.
EV 절연의 현재 골드 표준은 초원심분리입니다. 이 기술은 다양한 소포 밀도를 사용하여 소포를 각 단계 1,2에서저밀도 입자대 고밀도 입자의 차동 침전으로 원심 분리하여 분리 할 수 있게합니다. 몇 가지 저속 원심 분리 단계는 손상되지 않은 세포 (10 분 동안 300-400 x g), 세포 파편 (~ 2,000 x g 10 분), 및 세포 사멸 체 / 대형 소포 (~ 10 분 동안 10 분 동안 10 분)를 제거해야합니다. 이러한 초기 정화는 퇴적 전기 전기에 고속 초원심분리 (100,000-200,000 x g 1.5-2 시간)가 뒤따릅니다. 세척 단계는 EV 순도를 더욱 보장하기 위해 수행되지만, 이로 인해 절연 된 전기 EV의 수가 감소하여 총 수율 3,4가감소합니다. 이 방법의 유틸리티는 적절한 결과를 얻기 위해 많은 수의 셀(약 1 x 108)및 큰 샘플 부피(> 100 mL)의 요구 사항에 의해 더욱 제한됩니다.
증가하는 우려를 해결하기 위해 친수성 고분자를 사용한 소포의 침전은 최근 몇 년 동안 유용한 기술이 되었습니다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 기타 관련 침전 시약은 사용자가 단순히 선택의 시약으로 샘플을 배양하여 샘플 내에서 소포, 바이러스 및 단백질 또는 단백질 RNA 응집체를 당기고 단일 저속으로 당길 수 있게 합니다. 원심 분리1,2,5. 우리는 이전에 기존의 초원심분리에 비해 전기 를 침전시키는 PEG 또는 관련 방법의 사용이 상당히 높은 수율6을초래한다는 것을 보고했다. 이 전략은 빠르고 쉽고, 추가 고가의 장비가 필요하지 않으며, 쉽게 확장 가능하며, EV 구조를 유지합니다. 그러나, 이 방법의 난잡한 특성으로 인해, 생성된 샘플은 자유 단백질, 단백질 복합체, 다양한 EV 및 바이리온을 포함한 다양한 제품을 함유하고 있으므로 원하는집단을 얻기 위해 추가적인 정제가 요구된다 1 ,2,7,8.
다양한 강수 방법에서 얻은 전기 EV의 이질성을 극복하기 위해 밀도 그라데이션 초원심분리(DG)는 밀도에 따라 입자를 더 잘 분리하는 데 활용됩니다. 이 방법은 단백질, 단백질 복합체 및 바이러스 또는 바이러스 유사 입자(VLP)로부터 EV를 분리할 수 있는 이오디산놀 또는 수크로오스와 같은 밀도 구배 배지를 사용하여 단계별 구배를 사용하여 수행됩니다. 한때 DG가 EV 하위 모집단을 보다 정밀하게 분리할 수 있다고 생각되었지만 이제는 다양한 소포의 크기와 밀도가 겹칠 수 있다는 사실이 알려져 있습니다. 예를 들어, 엑소좀은 1.08-1.22 g/mL9의 부양 밀도를가지는 것으로 알려져 있으며, 골지(COPI+ 또는 클라트린+)에서분리된 소포는 1.05-1.12 g/mL의 밀도를 가지며 소포성 망막(COPII+ ) 1.18-1.25 g /mL1,2,3,4,9에서퇴적물 . 또한, 외형 분획을 바이러스 입자를 포함하는 분획과 비교하려는 경우 관심 바이러스의 밀도에 따라 HIV-1 이외의 바이러스가 동일하게 평형화될 수 있습니다. 외인성 양성 분획과 같은 밀도2.
마지막으로, 다운스트림 시각화 및 기능적 검정을 위한 EV 준비의 강화는 EV 연구에 매우 중요합니다. EV 농축 나노 입자, 특히 직경 700-800 nm범위의 다기능 하이드로겔 입자의 사용은 농축 된 EV 준비를 달성하는 데 중요한 단계입니다. 그들은 선택성을 촉진하기 위해 다공성 외부 체질 쉘에 의해 캡슐화 높은 친화력 방향족 미끼를 보유하고 있습니다. 이 연구에서 활용된 나노 입자에는 다양한 시약 및 바이오 유체에서 전기 자동차 포획을 증가시키는 것으로 나타난 다른 코어 미끼(반응성 Red 120 NT80 및 Cibacron Blue F3GA NT82)가 있는 두 가지 뚜렷한 제제가 포함됩니다(재료 표 참조) )6,10,11,12,13,14,15. 입자는 iodixanol 분획, 세포 배양 상급자 뿐만 아니라 플라즈마, 혈청, 뇌 척수액 (CSF) 및 소변6,13과 같은 환자 생체 유체를 포함한 수많은 시작 물질에서 전기 의 쉽게 농축을 제공합니다 .
여기에 제시된 방법은 여러 기술을 결합하여 현재 EV 정제 기술의 효율성을 향상시킵니다. EV 침전, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 캡처를 통해 워크플로우를 간소화하고, 시료 요구 사항을 줄이고, 수율을 증가하여 모든 EV 연구에 사용하기 위해 보다 균일한 EV 샘플을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 0.22 μm 여과 단계를 포함하기 때문에 바이러스 감염 시 EV 및 그 내용물을 조사하는 데 특히 유용하며 밀도에 따라 크고 원치 않는 소포 및 VLP를 배제하고 총 EV 집단을 효과적으로 분리하는 단계를 포함합니다. 비리온으로부터 전기를 분리합니다.
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Protocol
1. 세포외 소포의 여과 및 강수량 (EV)
- 감염또는 형질감염된 세포(즉, 세포주 및/또는 1차 세포)로부터 배양을 상판화하기 위해, 37°C에서 5일간 후기 로그 세포의 약 10 mL을 배양하고 5%CO2를 적절한 배양 배지(즉, 10% 태아 소와 함께 RPMI 또는 DMEM)에서 배양한다. 혈청 [FBS]).
참고: 모든 배양 배지 시약은 전기 TV가 없어야 하며, 90분 동안 100,000 x g의 혈청 을 사전 초원심분리하여 구입하거나(재료 표참조) 사내에서 제조할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CEM, Jurkat, 293T, U937 (감염되지 않은 선), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 및 HTLV-1 감염된 라인), 다발성 형질 감염 세포 및 원발성 골수성 및 T 세포 (둘 다)를 포함하여 일반적으로 사용되는 여러 세포 주에 성공했습니다. 감염 및 감염되지 않은); 그러나, 이 프로토콜은 전문화된 배지 또는 배양 조건을 필요로 하는 것을 포함하여 임의의 세포 유형에 사용될 수 있다. 세포의 밀도는 다른 세포 모형을 위해 최적화될 필요가 있을 수 있습니다. 가장 높은 밀도는 5 일 후에 최소한의 세포 사멸과 함께 사용하는 것이 좋습니다. - 3,000 x g에서 배양한 것을 5분 동안 펠릿 세포에 대고 펠릿을 버린다.
- 멸균 0.22 μm 필터를 사용하여 배양 상급체를 걸러내고 깨끗한 튜브에서 여과액을 수집합니다.
- 여과 된 상구에 PEG 침전 시약 (1 :1 비율)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 균일 한 혼합물을 보장하기 위해 튜브를 여러 번 반전.
참고: 소용돌이를 하지 마십시오. - 혼합물을 4 °C에서 밤새 배양하십시오 (O / N).
- 1,500 x g에서 실온(RT)에서 30분 동안 원심분리기 혼합물을 이질적인 EV 펠릿을 생성한다.
참고: EV 펠릿은 흰색 또는 흰색으로 나타납니다. - EV고갈된 문화를 폐기하십시오.
- 칼슘과 마그네슘(PBS)을 빼고 1x 인산완충식염수150-300 μL로 EV 펠릿을 다시 일시 중단하고 얼음위에 보관하십시오.
2. 밀도 그라데이션 의 건설
- 도 1A에도시된 바와 같이 별도의 미세원심지 튜브에서 1.2% 단위로 6~18% 이오디산올에서 11개의 상이한 1 mL 밀도 분획을 생성하기 위해 1x PBS와 이오디산놀 밀도 구배 배지를 혼합한다.
- 각 튜브를 혼합하는 소용돌이.
- 층 밀도 분획은 도 1B에도시된 바와 같이 #18 분획으로 시작하여 분획#6으로 끝나는 미리 세척되고 건식 스윙 버킷 초원심분리튜브로 한다.
참고: 모든 튜브는 10% 표백제 스프레이를 사용하여 살균한 다음, 그라드 분획을 적재하기 전에 탈이온수로 3배 헹구고 멸균 탈이온수를 최종 세척해야 합니다. - 초원심지 튜브의 층화된 그라데이션 상단에 재중단된 EV 펠릿(300 μL)을 추가합니다.
- 100,000 x g에서 4 °C에서 90 분 동안 초원심 분리기.
- 조심스럽게 초원심지 튜브에서 1 mL 분획을 제거하고 새로운 미세 원심 분리 튜브로 각 분획을 전송합니다.
3. EV 분획의 농축 은 나노 입자를 사용
- NT80, NT82 및 1x PBS의 동일한 볼륨을 사용하여 나노 입자의 30% 슬러리를 만듭니다.
참고: 혼합물은 균질성을 보장하기 위해 사용하기 전에 소용돌이가 있어야합니다. - 밀도 분획을 포함하는 각 마이크로 원심 분리기 튜브에 슬러리 30 μL을 추가하고 파이펫 / 그들을 여러 번 혼합합니다.
- 약 20 rpm에서 4 °C에서 EV 농축 나노 입자 함유 밀도 분획 미세 원심 분리튜브 O / N을 회전시킵니다.
- 원심 분리기 밀도 분획 마이크로 원심 분리튜브 20,000 x g에서 RT에서 5 분.
- 액체를 버리고 1x PBS로 EV 펠릿을 두 번 씻으십시오.
참고: 나노입자 펠릿은 -20°C에서 동결되거나 다양한 다운스트림 분석법(즉, PCR, 웨스턴 블롯, 질량 분석법 및 기타 분석법)에 즉시 사용될 수 있다.
4. 다운스트림 어세이에 대한 나노 입자 펠릿의 권장 준비
-
RNA 격리용
- 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 0.2 μm 필터를 통해 여과된 0.001% 디에틸 파이로카보네이트(DEPC)로 처리된 오토클레이브 디이온화 수의 50 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
-
젤 전기 동용
- 15 μL의 Laemmli 완충제에서 펠릿을 직접 다시 놓습니다.
- 95°C에서 3x 가열 시료를 3분간 소용돌이를 부드럽게 가열하고 각 열 주기 사이를 돌이킨다.
- 20,000 x g에서 15 s의 원심 분리기 샘플을 사용하여 모든 용출 된 재료를 젤에 직접 로드하십시오.
참고: 최상의 결과를 얻으려면 젤에 로드된 입자의 양을 제한하고 젤을 100V로 실행하여 나머지 입자가 웰에 포함되어 있는지 확인합니다.
-
트립신 소화용
- 시료의 알킬화 및 트립시니화 전에 20 μL의 우레아에서 펠릿을 다시 중단시킴. 나노입자는 RT에서 10분 동안 14,000 x g 원심분리에 의해 펠렛될 수 있다.
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Representative Results
PEG 강수량은 EV 수율을 증가
EV 절연에 대한 당사의 조합 접근 방식은 기존의 초원심분리에 비해 EV 회수 측면에서 훨씬 더 효율적이며, 필요한 출발 물질의 부피를 90% 감소시킴으로써 명백히 드러납니다. EV 절연의 현재 금 본위제인 초원심분리는 하류 분석에 적합한 EV 준비를 생성하기 위해 약 100 mL의 배양 상판이 필요하지만, 우리의 새로운 프로토콜은 10 mL만 필요합니다. 이러한 감소는 나노트래킹 분석(NTA)에 의해 측정된 바와 같이 EV 수율의 현저한 증가를 제공하는 PEG EV 침전 시약의 사용을 통해 가능하게 된다. 그림 2A의결과, 이전에 발표 된6,배양 상급 PEG 강수량의 10 mL를 사용할 때 7.27 x 1010 전기 의 회복을 초래한 것을 나타냅니다, 이는 약 500 배 이상이었다 초원심분리(1.45 x 108)를사용하여 동일한 출발재료로부터 회수한 전기 자동차. 특정 EV 아류형인 엑소좀의 분리의 증가된 효율은 또한 잘 특징지어진 엑소좀 마커 단백질, CD81, CD63 및 CD9의 증가된 수준에 의해 명백하게 관찰되었다. PEG 침전 시약을 사용하여 초원심분리 또는 EV 침전으로부터 생성된 EV 프렙을 비교한 웨스턴 블롯 분석은 도 2B에나타내었다. 이러한 결과는 CD81의 3,000배 증가, CD63의 4배 증가, 고밀도 분석으로 측정된 CD9의 40배 증가를 보여줍니다. 종합하면, 이러한 결과는 설명된 프로토콜이 총 EV 수율을 높일 뿐만 아니라 초원심분리에 비해 엑소좀의 회복을 향상시킨다는 것을 시사한다.
HIV-1 바이러스로부터 의외로 전기자동차의 특성화 및 분리
나노입자 농축 을 따르는 각 분획에 존재하는 소포를 특성화하기 위해, EV는 개략된 프로토콜을 사용하여 감염되지 않은 CEM 또는 HIV-1 감염 U1 세포 배양 상판으로부터 분리되었고, 각각의 서쪽 얼룩을 사용하는 것을 특징으로 한다. 나노 입자 농축 이오디산놀 분획. 도 3A의 데이터는 각 분획(CEM 셀; 상단 패널)에서 3개의 외신테파닌(CD81, CD63 및 CD9)의 유무를 입증하는 이전에 발표된 결과를 보여줍니다. 결과는 분획 내의 모든 3개의 테트라스파닌의 존재에 의해 정의된 엑소좀이, 3개의 명백한 인구에서 찾아낸다는 것을 표시합니다: 분획 10.8-12.0을 포함하는 엑소#1, 분획15.6-16.8을 포함하는 엑소 #2, 및 엑소#3을 포함하는 엑소세스 18.0 분수만 가능합니다. 세 개의 뚜렷한 인구가 있음에도 불구하고, 프로토콜은 각 분획 내에 추가 유형의 EV가 존재할 가능성을 배제할 수 없습니다. 게다가, 이 결과는 시험된 테트라스파닌 마커의 조합을 위해 양성인 이 인구에 있는 소포가 있다는 가능성을 결정적으로 배제하지 않습니다. 이러한 전기 자동차는 추가 정제 전략에 의해 추가로 분리 될 수 있습니다.
EV/exosome 연구의 급속하게 발전하는 필드는 그들의 발견부터 폭발하고 이 소포를 위한 많은 새로운 기능 그리고 응용 결과로 초래했습니다. 특히, 정상적인 생리학뿐만 아니라 질병에서 세포내 메신저로서의 그들의 역할은 수용자 세포에 대한 세포외 소포, 특히 엑소좀의 효과와 유용성을 해부하는 데 중요한 자원을 사용하게 되었다16 , 17세 , 18. 수많은 연구는 HIV-16,10,12,19,20,21을 포함하여 다양한 감염의 병인에 전기 를 연루시켰습니다. , 22. 그러나, EV와 비리온 사이의 크기 유사성은 이러한 EV 매개 메커니즘을 정의하는 데 잠재적 인 장애물을 제시한다. 이러한 문제를 해결하기 위해 당사는 EV 모집단을 비리온과 효과적으로 분리하기 위해 밀도 그라데이션을 구현하기 위한 프로토콜을 설계했습니다. 이를 위해, HIV-1 감염된 세포로부터의 세포 배양 상판은 제시된 프로토콜을 실시하고 HIV-1 개그 p24의 존재에 대한 서쪽 얼룩에 의해 분석되어 어떤 분획 또는 분획이 HIV-1 비리온을 함유하는지 를 결정하였다. 도 3A(중간 패널)에 도시된 결과는 3개의 독립적인 조건에서 p24의 국소화를 나타낸다: 유도체가 없는 경우, 유도자의 존재하에서(Phorbol 12-myristate 13-아세테이트; PMA), 및 조합 항레트로바이러스 요법(cART)의 존재, HIV-1에 대한 표준 치료. 이러한 데이터는 HIV-1 바이러스가 p24 및 그 삼촌다단백질 Pr55의 존재에 의해 측정된 바와 같이 분획 16.8로 국한되어 있음을 나타낸다. 더욱이, 세포가 CART를 받게 되면, 이는 프로테아제 억제제인 인디나비르를 포함하고, P55에서 p24로의 절단을 방지하고, 어떠한 분획에서도 p24가 검출되지 않았다. 대신, 단지 Pr55 검출되고 더 조밀한 분획으로 바이러스의 이동을 나타내는 16.8-18.0 분획에 존재했습니다. 1차 대식세포(하부 패널)를 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 기재된 프로토콜은 엑소#2 및 엑소#3 바이러스 집단의 공동 침전을 초래하지만, 엑소#1 집단(분수 10.8-12.0)은 바이러스가 없는 상태로 남아 있어 바이러스 오염이 없는 다운스트림 분석문을 허용했다.
이 유형의 바이러스 분리는 EV를 입력하거나 감염된 세포에서 자유 단백질로 분비되는 바이러스 조각의 가능성을 해결할 수 있습니다. 도 3B의 결과는 엑소#2 및 엑소#3 집단 이외에 엑소#1 집단에서 HIV-1 Nef 단백질이 발견될 수 있음을 나타낸다. Nef는 또한 6.0 분획에 나타나며, 이는 Nef가 감염된 세포에서 잠재적으로 감염된 세포로부터 자유 단백질및 EV 내에서 분비될 수 있음을 나타냅니다. 추가적으로, HIV-1 Vpr 단백질은 6.0 분획에서 발견되는 동안 HIV-1 Tat 단백질은 6.0 분획에서 주로 발견되지만 분획 7.2-9.6에서도 나타납니다. 우리는 현재 ELISA에 의해 Tat 단백질의 존재에 대한 모든 분획을 테스트하고 있습니다. 이 결과는 Tat와 Vpr가 감염한 세포에서, 자유 단백질로 확률이 높다는 것을, Tat는 또한 EV로 통합될 수 있었다 는 것을 표시합니다. 종합적으로, 이 데이터는 EV 격리의 우리의 방법이 HIV-1 virions (엑소#2 및 #3)에서 엑소좀 (엑소 #1좀)을 성공적으로 격리 할 수 있으며 HIV-1 감염된 세포의 EV에는 HIV-1 발병 기전에 영향을 미칠 수있는 HIV-1 단백질이 포함되어 있음을 나타냅니다.
전기 EV의 특성화 및 다른 바이러스로부터 의 외도 전기 자동차 분리
이 프로토콜을 다른 바이러스 감염 모델에 적용하기 위해, 우리는 여러 가지 다른 바이러스에 감염된 세포에서 소포를 특징으로합니다. 도 3C는 기재된 프로토콜에 따른 침전, 분리 및 농축 에 따른 이전에 수득된 소포 및 바이러스 분포의 그림을 나타낸다. 도 3A에앞서 도시된 바와 같이, 엑소좀(CD9+CD63+CD81+)은 3개의 상이한 집단(Exo #1, 분획 10.8-12.0; 엑소#2, 분획 15.6-16.8, 및 엑소#3, 18.0 분획) 및 HIV-1 바이러스는 고밀도 16.8 및 18.0 분획(차선 10-11)으로 국소화된다. 당연히, 인간 T 림프성 바이러스 타입-1 (HTLV-1)에서 풀어 놓인 EV를 특성화하기 위하여 이 프로토콜을 적용할 때, 성인에 있는 암을 일으키는 원인이 되기 위하여 알려지는 레트로바이러스, 우리는 HIV-1 관련 EV의 그것과 유사한 결과를 관찰했습니다. 도 3C의 세 번째 패널은 HTLV-1 바이러스가 주로 가장 높은 밀도 분획(18.0)으로 국한되었고, 보다 적게, HTLV-1 매트릭스 단백질(p19)의 존재에 의해 입증된 바와 같이 분획 13.2-16.8을 나타낸다. 더욱이, 우리는 이전에 HTLV-1 거래 단백질, HTLV-1 virion에서 결석한 세금, HTLV-1감염세포15,23에서풀어 놓인 엑소좀 내에 존재한다는 것을 것을을 발견했다. 그림 3C의 데이터는 세금이 더 낮은 밀도 분획(6.0-12.0)에 존재했으며, 그 중 두 가지는 엑소좀(10.8 및 12.0)을 포함하는 것으로 나타났습니다.
다음으로, 우리는 HIV-1과 HTLV-1 비리온이 레트로바이러스이고 직경이 매우 유사하기 때문에 각각 에볼라 바이러스(EBOV) 및 지카 바이러스(ZIKV)와 같은 크고 작은 바이러스의 맥락에서 격리 프로토콜을 테스트했습니다. VLP를 EBOV 어셈블리 및 출구의 대리 생체 안전 수준 2(BSL-2) 모델로 사용하여, 우리는 길이가 약 1 μm인 VLP가 0.22 μm 여과가 없는 경우 가장 높은 밀도 분획(18.0)으로 국소화된다는 것을 발견했습니다(중간 패널, 도 3C). 더욱이, VP40, EBOV 매트릭스 단백질이 높은 수준으로 발현될 때, 그것은 엑소좀이 국소화되는 것을 포함하여 모든 조밀도 분획에 있는 VP40의 존재귀착되는 몇몇 다른 기계장치를 통해 세포에서 분비됩니다13 , 14. 대조적으로 ZIKV 비리온은 HIV-1 비리온보다 훨씬 작으며 직경이 약 40 nm입니다. 도 3C의 하단 패널의 대표적인 다이어그램은 저밀도(6.0-8.4) 및 고밀도(15.6-18.0) 분획 모두에서 ZIKV 비리온의 존재를 보여 주며, 각각 자유 바이러스 및 EV 캡슐화 바이러스의 존재를 시사한다.
그림 1: 이오디산올 밀도 그라데이션의 구성. (a)상대적인 양인 이오디산올 및 PBS는 각 밀도 분율(분수 #)을 생성하는데 이용된다. 분수 # 각 분수에 포함 된 iodixanol의 백분율을 나타냅니다. 그들의 상대밀도와 그라데이션의 배치는 가장 무거운 것부터 가장 가벼운 것으로 묘사됩니다. (B)초원심분리관내 밀도분획(6.0-18)의 배치는 3개의 EV 집단(엑소#1, 엑소#2, 엑소#3), 엑소-유사 소포 및 단백질 복합체의 위치뿐만 아니라 3개의 EV 집단의 위치(좌측)를 나타내고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: PEG 침전 시약은 EV 수율을 증가시킨다. (A)EV 회수를 비교하기 위해, EV는 기존의 초원심분리(100,000 x g)또는 PEG 침전 시약(1:1 비율로 배양)을 사용하여 5 d HIV-1 감염된 단핵구(U1) 배양 상피(10 mL)로부터 분리하였다. 두 농축 절차모두에서 EV는 나노트래킹 분석을 사용하여 DeMarino, etal.6에설명된 바와 같이 결과 EV 농도를 평가하기 위해 분석되었다. NTA는 기술적 삼중항에서 11개의 독립적인 위치에서 측정되었다. 상기 청색 막대는 33개의 측정값±S.D. 통계적 유의성의 평균을 나타내며, 두 꼬리 학생의 t-test를 사용하여 결정하였다; p < 0.001. B. 5일 CEM 배양으로부터의 EV는 초원심분리(UC) 또는 PEG 침전을 이용한 상급체이며, 이어서 이오디악산올 밀도 분리를 실시한다. 초원심분리는 100 mL의 배양 상수(Lane 1)를 사용하여 수행하였고, PEG 침전 및 후속 이오디산올 분획은 배양 상대물(lane 2)의 10 mL를 사용하여 수행하였다. 극원분리로부터 얻어진 총 EV 펠릿과 PEG/이오디산놀 분리로부터의 10.8분분획을 액틴을 대조군으로 하여 외인분열 마커 단백질(CD81, CD63 및 CD9)의 존재에 대한 서쪽 얼룩에 의해 분석하였다. 명확성을 위해 동일한 노출을 가진 동일한 블롯에서 선택한 차선이 패널 B에 표시됩니다. 이 그림은 데마리노에서 수정되었습니다,외. 6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 바이러스로부터 전기 를 분리. (a)감염되지 않은 CEM 세포(상부 패널), HIV-1(Ba-L)으로부터의 5일 배양 초월제; MOI: 0.01) 감염된 U1 세포(±PMA 및 ±cART 치료; 중간 패널) 또는 HIV-1 감염된 1차 대식세포(하단 패널)를 밤새 4°C에서 PEG 침전 시약으로 배양하였다. 전기자동차는 이오디산올 밀도 구배를 사용하여 분획으로 분리되었다. 모든 분획에서 의 EV는 4°C에서 하룻밤 NT80/82 입자를 사용하여 농축되었다. CEM 나노펠렛은 외형 마커 단백질 CD81, CD63 및 CD9의 존재에 대해 웨스턴 블롯을 사용하여 분석하였다. U1(±PMA 및 ±cART 치료) 및 HIV-1 감염된 1차 대식세포는 CD63뿐만 아니라 HIV-1 개그 단백질(p24 및 Pr55; 갈라진 및 삼촌성 HIV-1 개그 폴리프로테인)의 존재를 각각 분석하였다. 블롯은 대조군으로서 액틴을 조사했다. 진정한 엑소좀 집단(CD81+CD63+CD9+)은빨간색으로 윤곽이 그있다. 이 수치는 데마리노, 외6(B)감염된 U1 세포로부터 5일간 배양 된 초나토네이트로부터 하룻밤 동안 4°C에서 PEG 침전 시약을 배양하여 변형되었다. 전기자동차는 이오디산올 밀도 구배를 사용하여 분획으로 분리되었다. 모든 분획에서 의 EV는 4°C에서 하룻밤 NT80/82 입자를 사용하여 농축되었다. 분수는 HIV-1 Nef, Vpr 및 Tat의 존재를 위해 서쪽 얼룩에서 실행되었습니다. 액틴은 대조군으로 사용되었다. 진정한 엑소좀 집단(CD81+CD63+CD9+)은이전에 DeMarino에 정의된 대로 빨간색으로 윤곽이 있으며, 6(C)이전에 특징지어진 EV 분리 프로파일의 대표적인 예는 4개에서 다른 바이러스: HIV-1, HTLV-1, EBOV 및 ZIKV. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 프로토콜 워크플로우. 새로운 워크플로우에는 여과, PEG 침전 시약을 사용한 EV 침전, 이오디산올 밀도 구배 분리 및 전기 자동차 나노입자 농축을 포함한 여러 기술이 결합되어 있습니다. 이 프로토콜의 활용은 다양한 바이러스로부터 EV를 분리하고 qPCR, 웨스턴 블롯, 질량 분석법, RNA 시퀀싱, 사이토카인 분석, ELISA 및 세포 기반 분석을 포함한 다운스트림 분석법을 위한 소량 샘플을 제공합니다. 이 그림은 데마리노에서 수정되었습니다,외. 6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명된 방법을 통해 EV 수율을 높이고 격리에 대한 조합 접근 방식을 사용하여 EV에서 바이러스를 분리할 수 있습니다. 비교적 많은 양의 출발 물질(즉, 셀 상판)은 침전, DG 분리 및 나노입자 농축에 의해 EV 격리 이전에 여과될 수 있으며, 최종 부피인 ~30 μL로 다양한 종류의 즉각적인 사용을 가능하게 합니다. 다운스트림 아세이. 나노 입자 농축의 사용은 필수적이다, 기존의 초원심분리에 비해, 이러한 EV 농축 나노 입자는 더 효율적으로 소포를 캡처하는 것으로 나타났다, 배양 1 mL에서 소포의 양보다 크거나 동등한 산출 초원심분리배15의 10 mL에 비해상수체. 전반적으로, 기재된 프로토콜은 몇 가지 잘 알려진 기술의 조합을 포함하므로 제한된 어려움을 제시해야 한다. 그러나, EV 농축 나노 입자의 통합은 관심의 다운스트림 분석 또는 생물학적 목표에 따라 바람직한 결과를 달성하기 위해 문제 해결 및 / 또는 수정을 필요로 할 수있는 새로운 기술을 소개합니다. 우리는 나노 입자가 밤새 여과 된 세포 배양 과식제로 배양하는 것이 좋습니다. 관심 있는 표적 단백질 또는 RNA가 모델 시스템에서 낮은 풍부인 경우, 프로토콜은 표적의 포획을 보장하기 위해 잠복기를 증가시키기 위해 적응될 수 있다. 다운스트림 분석에서 나노입자의 활용은 전형적으로 각 분석에 대한 원하는 샘플 버퍼에서 펠릿을 재중단시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 나노 입자는 서쪽 얼룩 분석을 위해 Laemmli 버퍼에서 직접 재중단될 수 있습니다. 캡처된 물질은 가열 및 소용돌이 주기를 통해 SDS의 나노 입자에서 보다 효율적으로 용출되어야 합니다. 단백질의 적절한 분리를 달성하기 위해, 젤에 로드 된 나노 입자의 양을 제한하기 위해주의를 기울여야하며, 젤은 나머지 입자가 우물에 포함되어 있는지 확인하기 위해 약 100V에서 실행해야합니다. 또한, 저분자 단백질의 시각화를 위해, 하룻밤 습식 전달은 최적의 결과를 달성한다. 나노 입자의 사용은 소포 인구의 상당한 농축을 초래하지만, 입자에서 캡처 된 물질을 용해하기 위해 추가 단계를 수행해야합니다. 또한, 많은 용출 버퍼가 EV 멤브레인의 무결성을 손상시킬 수 있기 때문에 물질용출은 잠재적으로 다운스트림 기능 성 어설션에서 EV의 유용성을 제한할 수 있습니다. 추가 연구는 나노 입자 포스트 배양에서 그대로 소포의 제거를 허용 하는 전략을 설계 하는 데 필요한. 이러한 입자의 또 다른 단점은 특성화의 현재 부족이다. 입자의 외피는 높은 분자량을 배제하도록 설계되었습니다. 그러나, EV에 입자의 특정 표적화는 일어나지 않으며, 그 결과로 많은 혼란스러운 요인 및 배경 신호는 잠재적으로 다운스트림 해석에 존재할 수 있습니다.
기재된 방법은 주로 실험실 목적으로 사용된다. 우리는 최근에 플라즈마 및 CSF와 같은 소규모 환자 생체 유체및 대규모 상업용 EV 생산에서 전기 를 분리하기위한 추가 기술에 대한 조합 접근 방식의 기능을 확장하는 대체 방법을 개발했습니다. 환자 물자에서 바이러스로부터 멀리 전기 EV의 격리를 위해 우리는 밀도 구배 대신에 이용되는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 열의 사용을 통합했습니다. 이 컬럼은 일회용이므로 높은 봉쇄 실험실에서 이상적입니다. 그러나 SEC 컬럼은 크기에 따라 입자를 분리하므로 이러한 유형의 분리는 EVV에서 또는 분리로부터 각각 EBOV (~1 μm) 또는 ZIKV (~40 nm)와 같은 크거나 매우 작은 바이러스의 분리에만 적용 가능하다는 것을 따릅니다. 무료 단백질. 대규모 EV 생산측면에서, 최근 여과 기반 방법, 즉 접선 유동 여과(TFF)의 발전으로 대형 시료 량으로부터 EV를 효율적으로 분리할 수 있게 되었습니다. TFF는 역사적으로 바이러스를 포함한 나노 크기의 생체 분자의 정제에 사용되어 왔으며, 프로토콜의 최적화를 통해이 시스템은 성공적으로 전기 자동차24,25의격리에 적응되었습니다. 간략하게, TFF 공정 도중, 견본 액체는 크기 및 분자량에 근거를 둔 소포를 선택적으로 유지하는 반 투과성 막의 표면을 가로질러 접선으로 흐르므로, 따라서 자유 단백질 및 그밖에서 EV의 분리를 허용합니다 생체 분자 오염26. 초원심분리에 비해 TFF는 더 높은 수율, 적은 응집, 및 전기자동차27의로트 간 변동성을 감소시킨다고 보고되었다. 또한, 치료적 적용을 위한 전기자동차의 우수 제조관행(GMP) 등급 격리를 위한 TFF의 사용도28로보고되고 있다. 확장성과 재현성으로 인해 이 기술은 미래의 EV 연구에 큰 잠재력을 제공합니다.
바이러스는 다양한 크기와 밀도로 제공되므로 해당 바이러스에 따라 이 프로토콜의 최적화가 필요할 수 있습니다. 에볼라와 같은 매우 큰 바이러스의 경우(~1 μm 이상 길이), 간단한 여과는 VLP 및사멸체(14)와같은 대부분의 비리온 및 대형 오염 기관을 제거하는 데 이용될 수 있다. 이를 통해 대부분의 바이러스 분리가 전기 자동차에서 분리되어 정화의 프런트 엔드에서 실행될 수 있습니다. 그러나 엔테로바이러스(~30nm), 지카바이러스(~40nm), B형 간염 바이러스(~42nm), C형 간염 바이러스(~55nm) 등과 같은 더 작은 바이러스의 경우, 비리 침전이 더 이상 다운스트림 기능적으로 작용하기 전에 결정되어야 하는 분획 분석. 입자 직경만으로 침전물의 가능성이 있는 분율을 항상 근사화할 수는 없습니다. 예를 들어,직경 30 nm인 소아마비 바이러스는 분비자가29,30,31, 32,33에캡슐화되어 있는 것으로 알려져 있으며, 따라서 에서 발견될 가능성이 높습니다. 왼쪽이 아닌 그라데이션(밀도가 높은 분수)의 오른쪽(덜 조밀한 분수). HIV-1, HTLV-1 및 EBOV VLP의 경우 이 프로토콜을 최적화했지만, 추가 바이러스는 EV에서 멀리 떨어진 특정 정화를 위해 프로토콜을 미세 조정하기 위해 특성화가 필요합니다.
여기에 설명된프로토콜(그림 4)을통해 사용자는 EV 절연, 초원심분리의 금본위제에 비해 향상된 효율성과 더 적은 양의 시작 물질로 전기자동차를 바이러스로부터 분리할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 샘플 크기, 필요한 수율, 시작 재료 유형 (즉, 배양 상급 대 환자 재료) 및 다양한 크기의 다양한 바이러스를 포함하여 손에있는 조건에 쉽게 적응 할 수 있습니다.
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Disclosures
B.L.은 이 문서에 사용된 시약 및/또는 기기를 생산하는 Ceres Nanosciences Inc.와 제휴하고 있습니다. 다른 모든 저자는 잠재적 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 카산치 연구소, 특히 그웬 콕스의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) 보조금 (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 및 NS099029 F.K.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
