Summary
Этот протокол изолирует внеклеточные пузырьки (EVs) от virions с высокой эффективностью и выходом путем включения EV осадков, градиента плотности ультрацентрифугирования, и захвата частиц, чтобы обеспечить рациональный рабочий процесс и сокращение начала требований к объему, что приводит к воспроизводимым препаратам для использования во всех исследованиях EV.
Abstract
Одним из основных препятствий в области внеклеточного исследования везикулы (EV) сегодня является способность достичь очищенных препаратов EV в условиях вирусной инфекции. Представленный метод предназначен для изоляции ЭВ от вирионов (т.е. ВИЧ-1), что позволяет повысить эффективность и урожайность по сравнению с обычными методами ультрацентрифирования. Наш протокол содержит три шага: осадки EV, разделение градиента плотности и улавливание частиц. Анализы вниз по течению (т.е. западная поместье и ПЦР) могут быть запущены непосредственно после захвата частиц. Этот метод выгоден по сравнению с другими методами изоляции (т.е. ультрацентрифугированием), поскольку он позволяет использовать минимальные начальные тома. Кроме того, он более удобен для пользователя, чем альтернативные методы изоляции EV, требующие нескольких ультрацентрифугации. Тем не менее, представленный метод ограничен в своей сфере функциональных анализов EV, так как трудно вычерковать нетронутые ЭВ из наших частиц. Кроме того, этот метод разработан в строго научно-исследовательских условиях и не будет коммерчески жизнеспособным.
Introduction
Исследования вокруг внеклеточных пузырьков (EVs), в частности экзосомы, тип EV в диапазоне 30-120 нм и характеризуется наличием трех тетраспанина маркеров CD81, CD9, и CD63, в значительной степени формируется в результате разработки методов изолировать и очистить пузырьки интереса. Способность вскрывать многогранные механизмы была затруднена из-за сложных и трудоемких методов, которые генерируют образцы, состоящие из разнородной популяции пузырьков, генерируемых различными путями с широким диапазоном содержимого, размеров и Плотности. Хотя это вопрос для почти всех исследований EV, это особенно важно при изучении EVs в контексте вирусной инфекции, как virions и вирусоподобных частиц (VLPs) может быть похож по диаметру на пузырьки интереса. Например, вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) составляет около 100 нм в диаметре, что примерно такого же размера, как и многие типы Экв. По этой причине мы разработали новый рабочий процесс изоляции EV для решения этих вопросов.
Текущий золотой стандарт изоляции EV является ультрацентрифугированием. Этот метод использует различные злодеи везикулы, что позволяет пузырьков быть разделены центрифугации с дифференциальной осаждения частиц более высокой плотности по сравнению с частицами более низкой плотности на каждом этапе 1,2. Для удаления нетронутых клеток (300-400 х г на 10 мин), клеточного мусора (2000 х г на 10 мин) требуется несколько низкоскоростных шагов/крупных пузырьков (10 000 х г на 10 мин). Эти первоначальные очищения следуют высокоскоростной ультрацентрифугирования (100000-20000 х г для 1,5-2 ч) для отложений ЭВ. Стирки выполняются для дальнейшего обеспечения чистоты EV, однако, это приводит к сокращению числа изолированных EVs, тем самым снижая общую доходность 3,4. Полезность этого метода еще больше ограничена потребностью в большом количестве ячеек (примерно 1 х 108)и большом объеме выборки (Зтт; 100 мл) для достижения адекватных результатов.
Для решения растущих проблем, осадки пузырьков с гидрофильных полимеров стало полезным методом в последние годы. Полиэтиленгликоль (PEG), или другие связанные с ними реагенты осадков, позволяет пользователю снести пузырьки, вирусы и белковые или белковые РНК агрегаты в образце, просто инкубируя образец с реагентом выбора, а затем один низкоскоростной центрифугация1,2,5. Мы ранее сообщали, что использование PEG или связанных с ними методов для осаждения EVs по сравнению с традиционными ультрацентрифугация приводит к значительно более высокой урожайности6. Эта стратегия быстрая, легкая, не требует дополнительного дорогостоящего оборудования, легко масштабируема и сохраняет структуру EV. Однако, из-за беспорядочной природы этого метода, полученные образцы содержат разнообразие продуктов включая свободные протеины, комплексы протеина, ряд EVs, и virions таким образом требуя более дальнеишее очищение для того чтобы получить пожеланное населенность1 ,2,7,8.
Для преодоления неоднородности ЭВ, полученных из различных методов осадков, градиент плотности ультрацентрифугирования (DG) используется для лучшего разделения частиц на основе их плотности. Этот метод осуществляется с использованием поэтапного градиента с использованием градиентной среды плотности, такой как йодиксанол или сахароза, что позволяет отделять ЭВ от белков, белковых комплексов и вирусоподобных частиц (VLPs). Важно отметить, что, хотя когда-то считалось, что ГД допускает более точное разделение субпопуляций Ev, в настоящее время известно, что размеры и плотность различных пузырьков могут перекрываться. Например, экзосомы, как известно, имеют плотность флотации 1,08-1,22 г/мл9, в то время как везикулы, изолированные от Голги (COPI или clathrin)имеют плотность 1,05-1,12 г/мл и те из эндоплазмического ретикулума (COPII) ) осадки на 1.18-1.25 г/мл1,2,3,4,9. Кроме того, если желать сравнить экзосомальные фракции с фракциями, содержащими вирусные частицы, это может стать более трудным в зависимости от плотности вируса, интересующего, есть вирусы, кроме ВИЧ-1, которые, вероятно, уравновешивают сятко плотности как экзосомальные положительные фракции2.
Наконец, обогащение EV preps для визуализации вниз по течению и функциональных анализов имеет жизненно важное значение для исследований EV. Использование наночастиц, обогащающих EV, в частности многофункциональных частиц гидрогеля диаметром 700-800 нм, является важным шагом в достижении концентрированных препон EV. Они обладают высоким сродством ароматические приманки, которые инкапсулированы пористой внешней оболочки сито для содействия избирательности. Наночастицы, используемые в этом исследовании включают в себя два различных препаратов с различными приманками ядра (Реактивный красный 120 NT80; и Cibacron Blue F3GA NT82), которые показали, что увеличение захвата EVs из различных реагентов и биожидкости (см. таблицу материалов )6,10,11,12,13,14,15. Частицы предлагают легкое обогащение EVs из многочисленных исходных материалов, включая фракции йодиксанола, супернатант клеточной культуры, а также биожидкости пациента, такие как плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость (CSF), и моча6,13 .
Представленный здесь метод повышает эффективность современных методов очистки EV, объединяя несколько технологий; EV осадков, градиент аттестации плотности ультрацентрифугирования, и улавливания частиц, чтобы упорядочить рабочий процесс, уменьшить требования к выборке, и увеличить урожайность для получения более однородной образец EV для использования во всех исследованиях EV. Этот метод особенно полезен в исследовании EVs и их содержание во время вирусной инфекции, как она включает в себя 0,22 мкм фильтрации шаг, чтобы исключить большие, нежелательные пузырьки и VLPs и разделение общей популяции EV на основе плотности эффективно изолировать EVs от virions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Фильтрация и осадки внеклеточных пузырьков (EVs)
- Для подготовки культуры супернатанта из инфицированных или трансинфицированных клеток (т.е. клеточных линий и/или первичных клеток), культура примерно 10 мл клеток позднего входа в течение 5 дней при 37 КС и 5% CO2 в соответствующей среде культуры (т.е. RPMI или DMEM с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все культуры средних реагентов должны быть свободны от ЭВ, и могут быть либо приобретены (см. Таблица материалов), или подготовлены в доме предварительно ультрацентрифугации сыворотки на 100000 х г в течение 90 мин. Этот протокол был успешным для нескольких широко используемых клеточных линий, включая: CEM, Jurkat, 293T, U937 (неинфицированные линии), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (ВИЧ-1 и HTLV-1 зараженных линий), несколько трансинфицированных клеток, а также первичные миелоидные и Т-клетки (оба инфицированных и неинфицированных); однако этот протокол может быть использован для любого типа клеток, включая те, которые требуют специализированных носителей или условий культуры. Плотность клеток может потребоваться оптимизировать для различных типов клеток. Рекомендуется использовать самую высокую плотность при минимальной гибели клеток через 5 дней. - Centrifuge культуры на 3000 х г в течение 5 минут, чтобы клетки гранул и отказаться от гранул.
- Фильтр культуры супернатант с помощью стерильного 0,22 мкм фильтр и собирать фильтрвать в чистой трубке.
- Добавьте равный объем реагента ОСАго (коэффициент 1:1) к отфильтрованным супернатантам. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы обеспечить однородную смесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ вихрь. - Инкубировать смесь при 4 градусах Цельсия на ночь (O/N).
- Смесь центрифугна при температуре 1500 х г в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) дает разнородные гранулы EV.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы EV должны выглядеть белого или небелого цвета. - Откажитесь от супернатанта культуры, истощенной EV.
- Приостановите действие гранул EV в 150-300 л 1x фосфат-буферизированного сольения без кальция и магния (PBS) и держите на льду.
2. Строительство градиента плотности
- Смешайте йодиксанол плотность градиента среды с 1x PBS для создания 11 различных 1 мл фракции плотности от 6 до 18% йодиксанол в 1,2% шагом в отдельных микроцентрифуговых труб, как показано на рисунке 1A.
- Vortex каждую трубку для смешивания.
- Слой плотности фракций в предварительно очищенных и сухих размахивая ведро ultracentrifuge трубки, начиная с фракции #18 и заканчивая фракции #6, как указано на рисунке 1B.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все трубки должны быть продезинфицированы с помощью 10% отбеливателя спрей следуют затем полоскания 3x с деионизированной водой и окончательной стирки стерильной деионизированной воды до загрузки градиентных фракций. - Добавьте вновь наложенные гранулы EV (300 л) к верхней части многослойного градиента в ультрацентрифуговой трубке.
- Ультрацентрифуге при 100,00 х г при 4 кв. м в течение 90 мин.
- Тщательно удалите 1 мл фракций из ультрацентрифуги трубки и передать каждую фракцию в новые микроцентрифугные трубки.
3. Обогащение EV Фракции uUsing наночастицы
- Создайте 30% наночастиц, используя равные объемы NT80, NT82 и 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь должна быть вихремпереданием перед использованием для обеспечения однородности. - Добавьте 30 юл суспензии к каждой микроцентрифуговой трубке, содержащей фракции плотности и пипетки/инвертировать их несколько раз, чтобы смешать.
- Поверните EV-обогащающие наночастицы-содержащие фракционные фракции микроцентрифуговых труб O/N при 4 градусах Цельсия при примерно 20 об/мин.
- Плотность центрифуги фракции микроцентрифуговых труб оков при 20 000 х г в течение 5 мин на РТ.
- Отбросьте жидкость и дважды промойте эв-гранулы с помощью 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы наночастицы могут быть заморожены при -20 градусах цельсия или немедленно использованы для различных анализов вниз по течению (т.е. ПЦР, Западная поместья, масс-спектрометрия и другие анализы).
4. Рекомендуемая подготовка наночастицпелы для анализов вниз по течению
-
Для изоляции РНК
- Приостановите пеллеты в 50 Л автоклавированной деионизированной воды, обработанной 0,001% диэтил-пирокарбоната (DEPC), фильтруемой через фильтр 0,2 мкм и изолировать РНК в соответствии с протоколом производителя комплекта.
-
Для геля электрофореза
- Отрежь гранулы непосредственно в 15 л буфера Laemmli.
- Тепло образец 3x при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин. Vortex мягко и спина вниз между каждым теплового цикла.
- Centrifuge образец для 15 s на 20000 x g и загружают весь eluted материал сразу на гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов ограничьте количество частиц, загруженных на гель, и запустите гель при 100 В, чтобы обеспечить, чтобы все оставшиеся частицы содержались в скважинах.
-
Для пищеварения трипсина
- Повторное увеличение гранул в 20 злител мочевины до алкилирования и трипсинизации образца. Наночастицы могут быть гранулированы 14000 х г центрифугации на RT в течение 10 мин. Образец, содержащий трипсионизированный пептид может быть перенесен в чистую трубку сбора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ОСАго PEG увеличивает выход EV
Наш комбинированный подход к изоляции EV значительно более эффективен с точки зрения восстановления EV по сравнению с традиционной ультрацентрифугией, о чем свидетельствует 90%-ное сокращение объема требуемого исходного материала. Ultracentrifugation, текущий золотой стандарт в изоляции EV, требует около 100 мл культуры супернатант производить адекватную подготовку EV для вниз по течению анализы, в то время как наш новый протокол требует только 10 мл. Это сокращение стало возможным благодаря использованию реагента ОСАГО PEG EV, который обеспечивает значительное увеличение урожайности EV, измеряемого анализом нанотрекинга (NTA). Результаты на рисунке 2A, которые были ранее опубликованы6, показывают, что при использовании 10 мл культуры супернатанта ОСАго йег ежевых привело к восстановлению 7,27 х 1010 EVs, что было примерно в 500 раз больше, чем число EVs восстановлены из того же исходного материала с помощью ультрацентрифугации (1,45 х 108). Повышенная эффективность изоляции экзосом, специфического подтипа EV, также наблюдалась как очевидное повышение уровня хорошо охарактеризованных белков экзосомных маркеров, CD81, CD63 и CD9. Западный анализ поблуждения сравнения EV preps, полученных либо из ультрацентрифугации или EV осадков с помощью реагента ОСАго ПЕГ показано на рисунке 2B. Эти результаты показывают 3000-кратное увеличение CD81, 4-кратное увеличение CD63 и 40-кратное увеличение CD9, измеряемое анализом денситометрии. Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что изложенный протокол не только увеличивает общую доходность EV, но и повышает восстановление экзосом по сравнению с ультрацентррифегированием.
Характеристика ЭВ и отделение ЭВ от вируса ВИЧ-1
Для того, чтобы охарактеризовать пузырьки, присутствующие в каждой фракции после обогащения наночастиц, EVs были выделены из неинфицированных CEM или ВИЧ-1 инфицированных U1 клеточной культуры супернатант с использованием изложенного протокола и характеризуется с использованием западной подясти каждого из каждого наночастицообогарная фракция йодиксанола. Данные на рисунке 3A показывают наши ранее опубликованные результаты, которые демонстрируют наличие или отсутствие трех экзосомальных тетраспапинов (CD81, CD63 и CD9) в каждой фракции (CEM-клетки; верхняя панель). Результаты показывают, что экзосомы, определяемые наличием всех трех тетраспанинов в пределах фракции, встречаются в трех различных популяциях: Exo #1 которая включает в себя фракции 10.8-12.0, Exo #2 которая включает в себя фракции 15,6-16,8, и Экзо-3, которая включает в себя только 18,0 фракции. Несмотря на наличие трех различных популяций, протокол не может исключить возможность присутствия дополнительных типов ЭВ в каждой фракции. Кроме того, эти результаты не исключают окончательно возможность того, что Есть пузырьки в этих популяциях, которые являются положительными для сочетания проверенных маркеров тетраспанина. Эти EVs могут быть разделены далее дополнительными стратегиями очистки.
Быстро развивающаяся область исследований EV/exosome взорвалась с момента их открытия и привела к помногим вновь обретевшим функциям и приложениям для этих пузырьков. В частности, их роль в качестве внутриклеточных посланников не только в нормальной физиологии, но и в болезни привела к использованию значительных ресурсов для вскрытия влияния и полезности внеклеточных пузырьков, в частности экзосом, на клетках-реципиентах16 , 17 Лет , 18. Многочисленные исследования включили ЭВ в патогенез различных инфекций, в том числе ВИЧ-16,10,12,19,20,21 , 22. Однако, сходство размера между EVs и virions представляет собой потенциальное препятствие в определении этих механизмов, опосредовано EV. Для решения этой проблемы мы разработали наш протокол для реализации градиента плотности, чтобы эффективно отделить популяции EV от virions. С этой целью супернатант клеточной культуры из ВИЧ-1 инфицированных клеток подвергся представленному протоколу и проанализировался западным пятном на наличие ВИЧ-1 Gag p24, чтобы определить, какие фракции или фракции содержали вирио ВИЧ-1. Результаты, показанные на рисунке 3A (средняя панель) показывает локализацию p24 в трех независимых условиях: при отсутствии индуктора, в присутствии индуктора (Phorbol 12-myristate 13-ацетат; ПМВ), а также при наличии ПМР и комбинированной антиретровирусной терапии (CART), стандартного лечения ВИЧ-1. Эти данные свидетельствуют о том, что вирус ВИЧ-1 локализован до 16,8, измеряемый наличием p24 и его недостаного полипротеина Pr55. Кроме того, когда клетки подвергаются cART, который включает в себя Индинавир, ингибитор протеазы, который предотвращает расщепление Pr55 до p24, не p24 был обнаружен в любой фракции. Вместо этого, только Pr55 был обнаружен и присутствовал в 16,8-18,0 фракций, что свидетельствует о смещении вируса в более плотных фракций. Аналогичные результаты были получены с помощью первичных макрофагов (нижняя панель). Хотя описанный протокол приводит к совместному осадок Экзо #2 и Экзо #3 популяций с вирусом, exo #1 населения (фракции 10.8-12.0) по-прежнему вирус-бесплатно, что позволяет вниз по течению анализы бесплатно вирусного загрязнения.
Этот тип отделения вируса от EVs позволяет нам решать возможность части вируса, попадающих в EVs или выделяется из инфицированных клеток в качестве свободного белка. Результаты на рисунке 3B показывают, что ВИЧ-1 Неф белка можно найти в популяции экзо #1 в дополнение к Exo #2 и Exo #3 популяций. Неф также появляется в фракции 6.0, указывая, что Неф может быть потенциально выделен из инфицированных клеток в качестве свободного белка и в ПРЕДЕЛАх EV. Кроме того, белок ВИЧ-1 Vpr содержится в фракции 6.0, в то время как белок ВИЧ-1 Tat преимущественно содержится в фракции 6.0, но также появляется в фракциях 7.2-9.6. В настоящее время мы тестируем все фракции на наличие белка Tat от ELISA. Эти результаты показывают, что как Tat и Vpr могут быть выделены из инфицированных клеток, вероятно, как свободные белки, в то время как Tat также могут быть включены в EVs. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что наш метод изоляции EV может успешно изолировать экзосомы (Exo #1) от вич-1 virions (Exo #2 и #3) и что ЭВ из ВИЧ-1-инфицированных клеток содержат некоторые белки ВИЧ-1, которые могут повлиять на ПАтогенез ВИЧ-1.
Характеристика ЭВ и отделение ЭВ от других вирусов
Чтобы применить этот протокол к другим моделям вирусных инфекций, мы охарактеризовали пузырьки из клеток, инфицированных несколькими различными вирусами. На рисунке 3C показана иллюстрация ранее полученных везикули и распределение вирусов после осадков, разделения и обогащения в соответствии с описанным протоколом. Как ранее показано на рисунке 3A, экзосомы (CD9иCD63иCD81)присутствуют в трех различных популяциях (Exo #1, фракции 10.8-12.0; Экзо #2, фракции 15,6-16,8, и Экзо-3, 18,0 фракции) и вирус ВИЧ-1 локализуется до более высокой плотности 16,8 и 18,0 фракций (полосы 10-11). Неудивительно, что при применении этого протокола для характеристики ЭВ, выпущенных из Т-лимфотропного вируса человека типа 1 (HTLV-1), ретровируса, который, как известно, вызывает рак у взрослых, мы наблюдали результаты, аналогичные результатам, связанным с ВИЧ-1. Третья панель в рис. 3C показывает, что вирус HTLV-1 был в основном локализован до самой высокой фракции плотности (18,0) и, в меньшей степени, фракций 13,2-16,8, о чем свидетельствует наличие матричного белка HTLV-1 (p19). Кроме того, мы ранее обнаружили, что HTLV-1 сточки крови белка, налог, который отсутствует в HTLV-1 virion, присутствует в экзосомах, выпущенных из HTLV-1 инфицированных клеток15,23. Данные на рисунке 3C показывают, что налог присутствовал в фракциях более низкой плотности (6,0-12,0), два из которых мы показали, содержат экзосомы (10,8 и 12,0).
Далее мы протестировали протокол изоляции в контексте более крупных и мелких вирусов, таких как вирус Эбола (EBOV) и вирус Зика (ЗИКВ), соответственно, так как ВИЧ-1 и HTLV-1 virions являются ретровирусами и очень похожи мистрацией. Используя VLP в качестве суррогатной биобезопасности уровня 2 (BSL-2) модель EBOV сборки и выхода, мы обнаружили, что VLP, который составляет примерно 1 мкм в длину, локализуется до самой высокой фракции плотности (18,0) в отсутствие 0,22 мкм фильтрации (средняя панель, Рисунок 3C). Кроме того, когда VP40, матричного белка EBOV, выражается на высоких уровнях, он выделяется из клетки через несколько различных механизмов, приводящих к присутствию VP40 в каждой фракции плотности, включая те, к которым экзосомы локализованы13 , 14. В отличие от этого, вириоЦИОны ЗИКВ значительно меньше, чем вирио ВИЧ-1, размером примерно 40 нм в диаметре. Репрезентативная диаграмма в нижней панели Рисунок 3C показывает наличие вириоЦИСОВ в как низкой плотности (6,0-8,4), так и в фракциях высокой плотности (15,6-18,0), что свидетельствует о наличии как свободного вируса, так и EV-инкапсулированного вируса, соответственно.
Рисунок 1: Строительство градиента плотности йодиксанола. (A) Относительное количество йодиксанола и PBS, используемых для создания каждой фракции плотности (Фракция No). Фракция - обозначает процент йодиксанола, включенного в каждую фракцию. Их относительная плотность и размещение в градиенте изображены от самого тяжелого к легкому. (B) Размещение фракций плотности (6.0-18) в ультрацентрифуге трубки показано (левая сторона), а также расположение трех популяций EV (Экзо #1, Экзо #2, Exo #3), Экзо-подобные пузырьки, и белковые комплексы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: РЕагент ОСАго PEG увеличивает выход EV. ()Для сравнения EV восстановления, EVs были изолированы от 5 d ВИЧ-1 инфицированных моноцитов (U1) культуры супернатант (10 мл) с использованием традиционных ультрацентрифугации (100000 х г) или ПЕГ осадков реагента (инкубация в соотношении 1:1). EVs из обеих процедур обогащения были проанализированы с помощью анализа нанотрекинга для оценки результирующей концентрации EV, как описано в DeMarino, et al.6. НТА измерялась на 11 независимых позициях в техническом тройном. Синие полоски представляют собой в среднем 33 измерения s.D. Статистическая значимость была определена с помощью двуххвостого студенчества t-test; р Злт; 0,001. B. EVs из 5-дневного супернатанта культуры CEM с использованием ультрацентрифугации (UC) или ОСАго, за которым исследуется разделение плотности йодиксанола. Ультрацентррифугация проводилась с использованием 100 мл культуры супернатанта (Lane 1), в то время как осадок ПЭГ и последующее фракционирование йодиксанола были выполнены с использованием 10 мл культуры супернатанта (переулок 2). Общий EV гранулы, полученные от ультрацентрифугации и 10,8 фракции от PEG / йодиксанол разделения были проанализированы западной помарка на наличие экзосомальных маркерных белков (CD81, CD63, и CD9) с Actin в качестве контроля. Для ясности в панели B отображаются отдельные полосы из одного и того же помотника с одинаковыми экспозициями. Эта цифра была изменена от DeMarino, и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Изоляция ЭВ от вирусов. (A) Пятидневные культурные супернацианты из неинфицированных клеток ЦЭм (верхняя панель), ВИЧ-1 (Ba-L; МВД: 0,01) инфицированные клетки U1 (лечение ПМА и ЗКАРТ; средняя панель) или ВИЧ-1 инфицированных первичных макрофагов (нижняя панель) были инкубированы реагентом ОСАго ПЭГ при температуре 4 градусов По Цельсию в течение ночи. EVs были разделены на фракции с использованием градиента плотности йодиксанола. EVs из всех фракций были обогащены с помощью частиц NT80/82 ночь на 4 градуса Цельсия. НАнопеллеты CEM были проанализированы с использованием западного помарка на наличие экзосомальных маркерных белков CD81, CD63 и CD9. U1 (лечение ПМА и ЗКАРТ) и ВИЧ-1 инфицированных первичных макрофагов были проанализированы на наличие белка ВИЧ-1 Gag (p24 и Pr55; расщепленный и дядейский полипротеин ВИЧ-1 Gag, соответственно), а также CD63. Помарки были проверены на актин в качестве контроля. Истинные экзосомные популяции (CD81иCD63иCD9)изложены красным цветом. Эта цифра была изменена из DeMarino, и др.6 (B) Пятидневные супернацианты культуры из инфицированных клеток U1 были инкубированы с реагентом ОСАго PEG на 4 градуса Цельсия в одночасье. EVs были разделены на фракции с использованием градиента плотности йодиксанола. EVs из всех фракций были обогащены с помощью частиц NT80/82 ночь на 4 градуса Цельсия. Фракции запускались по западному подуку за наличие ВИЧ-1 Неф, Vpr и Tat. Актин использовался в качестве элемента управления. Истинные экзосомы популяций (CD81иCD63иCD9)изложены красным цветом, как ранее определено в DeMarino, et al.6 (C) Представитель иллюстрация ранее охарактеризованных EV разделения профилей от четырех различные вирусы: ВИЧ-1, HTLV-1, EBOV, и ЗИКВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Рабочий процесс протокола. Новый рабочий процесс сочетает в себе несколько методов, включая фильтрацию, EV осадков с использованием ПЕГ осадков реагента, йодиксанол плотности градиента разделения, и наночастиц ы обогащения ЭВ. Использование этого протокола отделяет EVs от различных вирусов и обеспечивает небольшой образец объема для анализов вниз по течению, включая qPCR, западную подувку, масс-спектрометрию, секвенирование РНК, анализ цитокинов, ELISA и анализы на основе клеток. Эта цифра была изменена от DeMarino, и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изложенный метод позволяет повысить урожайность EV и отделить вирус от ЭВ с помощью комбинированного подхода к изоляции. Относительно большое количество исходного материала (т.е. супернатант клеток) может быть отфильтровано до изоляции EV путем выпадения осадков, разделения DG и обогащения наночастиц, что приводит к окончательному объему в 30 евро, что позволяет немедленно использовать в различных вниз по течению анализы. Использование обогащения наночастиц имеет важное значение, поскольку, по сравнению с традиционной ультрацентрифучения, эти EV-обогащения наночастиц, как было показано, захватить пузырьки более эффективно, что дает больше или равна количеству пузырьков от 1 мл культуры supernatant по сравнению с 10 мл ультрацентрифуги культуры супернатант15. В целом описанный протокол включает в себя сочетание нескольких хорошо известных методов и поэтому должен представлять ограниченные трудности. Тем не менее, включение EV-обогащающих наночастиц вводит новый метод, который может потребовать устранения неполадок и / или модификаций для достижения желаемых результатов в зависимости от вниз по течению ассс или биологической цели интереса. Мы рекомендуем инкубировать наночастицы с помощью фильтрованных клеточных супернационтов на ночь. Если целевой белок или РНК, представляющий интерес, имеет низкий объем в модельной системе, протокол может быть адаптирован для увеличения инкубационного периода для обеспечения захвата цели. Использование наночастиц в анализах вниз по течению, как правило, может быть достигнуто путем повторного приостановки гранулы в желаемом буфере образца для каждого анализа. Например, наночастицы могут быть перевешены непосредственно в буфере Laemmli для анализа западной помок. Захваченный материал должен быть более эффективно выемкой из наночастиц в SDS через нагревательные и вихревые циклы. Для достижения адекватного разделения белка следует позаботиться об ограничении количества наночастиц, загруженных в гель, и гель должен работать примерно при 100 В, чтобы обеспечить, чтобы все оставшиеся частицы содержались в скважинах. Кроме того, для визуализации белков с низким молекулярным весом, ночная влажная передача достигает оптимальных результатов. Хотя использование наночастиц приводит к значительному обогащению популяций везикул, необходимо предпринять дополнительные шаги, чтобы высветить захваченный материал из частиц. Кроме того, elution материала потенциально может ограничить полезность EVs в вниз по течению функциональных анализов, как многие elution буферов может повредить целостность мембраны EV. Необходимы дополнительные исследования для разработки стратегии, позволяющей удалять нетронутые пузырьки из наночастиц после инкубации. Другим недостатком этих частиц является отсутствие характеристик в настоящее время. Внешняя оболочка частицы была разработана, чтобы исключить молекулы высокого молекулярного веса. Тем не менее, конкретное таргетирование частиц на ЭВ не происходит, и в результате многие смешанные факторы и фоновые сигналы потенциально могут присутствовать в анализах вниз по течению.
Описанный метод в первую очередь будет использоваться в лабораторных целях. Недавно мы разработали альтернативные методы для расширения возможностей нашего комбинированного подхода к дополнительным методам изоляции ЭВ от мелкомасштабных биофлипов пациентов, таких как плазма и CSF, а также крупномасштабное коммерческое производство EV. Для изоляции ЭВ от вируса в материале пациента мы включили использование размеров исключения хроматографии (SEC) столбцов, которые используются вместо градиента плотности. Эти столбцы полезны тем, что они одноразовые и поэтому идеально подходят для лабораторий с высоким содержанием. Тем не менее, столбцы SEC разделяют частицы в зависимости от размера, поэтому из этого следует, что этот тип разделения применим только для разделения больших или очень маленьких вирусов, таких как EBOV (1 мкм) или ЗИКВ (40 нм), соответственно, от ЭВ или отделения от свободный белок. Что касается крупномасштабного производства Ev, то недавние достижения в области методов фильтрации, а именно тангенциальной фильтрации потока (ТФФ), позволили эффективно обезображять ЭВ от больших объемов выборки. TFF исторически использовался для очистки наноразмерных биомолекул, в том числе вирусов, и через оптимизацию протоколов эта система успешно адаптировалась для изоляции ЭВ24,25. Кратко, во время процесса TFF, потоки жидкости образца касательно через поверхность полупроницаемой мембраны которая селективно сохраняет пузырьки основанные на размере и молекулярном весе, таким образом позволяющ для разъединения EVs далеко от свободных протеинов и других загрязняющих биомолекулы26. По сравнению с ультрацентрифугированием, было сообщено, что TFF приводит к более высокой урожайности, меньше агрегации, и снижает много-много изменчивость EVs27. Кроме того, использование TFF для хорошей производственной практики (GMP) класса изоляции EVs для терапевтического применения также было сообщено28. Благодаря своей масштабируемости и воспроизводимости, эта технология предлагает большой потенциал для будущих исследований EV.
Вирусы бывают разных размеров и плотности, поэтому в зависимости от вируса, о котором идет речь, может потребоваться оптимизация этого протокола. Для очень больших вирусов, таких как Эбола (1 мкм или больше в длину), простая фильтрация может быть использована для удаления подавляющего большинства вирионов и крупных загрязняющих органов, таких как VLPs и апоптотические тела14. Это позволяет для большинства разделения вируса от EVs, чтобы быть исполняемым на переднем конце очистки. Однако в случае более мелких вирусов, таких как энтеровирус (30 нм), вирус Зика (40 нм), вирус гепатита В (42 нм), вирус гепатита С (55 нм) и другие, фракция, в которой осадок вирионов необходимо будет определить до дальнейшего снижения функционального Анализ. Нельзя всегда приблизить вероятную фракцию осадочных отложений, основанную только на диаметре частиц. Например, полиовирус, который составляет 30 нм в диаметре, также известно, инкапсулированы в секреторных аутофагосом29,30,31,32,33, и, следовательно, вероятно, будет найден на правую сторону градиента (более плотные фракции), а не левую (менее плотные фракции). В то время как мы оптимизировали этот протокол в случае ВИЧ-1, HTLV-1 и EBOV VLPs, дополнительные вирусы потребуют характеристики для тонкой настройки протокола для их специфической очистки от EVs.
Протокол, изложенный здесь(Рисунок 4) позволяет впервые, пользователь отделить EVs от вируса с повышенной эффективностью и меньшие объемы исходного материала по сравнению с золотым стандартом изоляции EV, ультрацентрифугации. Этот метод может быть легко адаптирован к условиям, включая различные размеры выборки, требуемые урожаи, тип исходного материала (т.е. культурный супернатант по сравнению с терпеливым материалом) и различные различные вирусы разных размеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L. является аффилированным лицом Ceres Nanosciences inc., которая производит реагенты и/или инструменты, используемые в этой статье. Все остальные авторы не заявляют о каких-либо потенциальных конфликтах интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории Кашанчи, особенно Гвен Кокс. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) Гранты (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, и NS099029 в Ф.К.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
