Summary
Este protocolo aísla las vesículas extracelulares (EV) lejos de los viriones con alta eficiencia y rendimiento mediante la incorporación de precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas para permitir un flujo de trabajo simplificado y una reducción del inicio requisitos de volumen, lo que resulta en preparaciones reproducibles para su uso en todas las investigaciones de vehículos eléctrico.
Abstract
Uno de los principales obstáculos en el campo de la investigación de vesículas extracelulares (EV) hoy en día es la capacidad de lograr preparaciones de EV purificadas en un entorno de infección viral. El método presentado está destinado a aislar los vehículos eléctricos lejos de los viriones (es decir, VIH-1), lo que permite una mayor eficiencia y rendimiento en comparación con los métodos de ultracentrifugación convencionales. Nuestro protocolo contiene tres pasos: precipitación EV, separación de gradiente de densidad y captura de partículas. Los ensayos aguas abajo (es decir, Western blot y PCR) se pueden ejecutar directamente después de la captura de partículas. Este método es ventajoso sobre otros métodos de aislamiento (es decir, ultracentrifugación) ya que permite el uso de volúmenes de inicio mínimos. Además, es más fácil de usar que los métodos alternativos de aislamiento EV que requieren múltiples pasos de ultracentrifugación. Sin embargo, el método presentado está limitado en su alcance de ensayos de EV funcionales, ya que es difícil eluir los vehículos eléctricos intactos de nuestras partículas. Además, este método se adapta a un entorno estrictamente basado en la investigación y no sería comercialmente viable.
Introduction
La investigación centrada en vesículas extracelulares (EV), específicamente exosomas, un tipo de EV que va de 30-120 nm y se caracteriza por la presencia de tres marcadores de tetraspanrina CD81, CD9 y CD63, ha sido moldeada en gran medida por el desarrollo de métodos para aislar y purificar las vesículas de interés. La capacidad de diseccionar mecanismos multifacéticos se ha visto obstaculizada debido a técnicas complejas y que consumen mucho tiempo que generan muestras compuestas por una población heterogénea de vesículas generadas a través de diferentes vías con una amplia gama de contenidos, tamaños y Densidades. Si bien esto es un problema para casi todas las investigaciones de vehículos eléctricos, es de particular importancia cuando se estudian los vehículos eléctricos en el contexto de la infección viral, ya que los viriones y partículas similares a virus (VLP) pueden ser similares en diámetro a las vesículas de interés. Por ejemplo, el Virus de Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 (VIH-1) tiene aproximadamente 100 nm de diámetro, que es aproximadamente del mismo tamaño que muchos tipos de vehículos eléctricos. Por esta razón, hemos diseñado un nuevo flujo de trabajo de aislamiento EV para abordar estos problemas.
El estándar de oro actual de aislamiento EV es ultracentrifugación. Esta técnica hace uso de las diversas densidades vesículas, lo que permite separar las vesículas por centrifugación con sedimentación diferencial de partículas de mayor densidad frente a partículas de menor densidad en cada etapa 1,2. Se requieren varias etapas de centrifugación de baja velocidad para eliminar las células intactas (300-400 x g durante 10 min), los desechos celulares (2.000 x g durante 10 min) y los cuerpos apoptóticos/vesículas grandes (10.000 x g durante 10 min). Estas purificaciones iniciales son seguidas por la ultracentrifugación de alta velocidad (100,000-200,000 x g para 1.5-2 h) a los vehículos eléctricos sedimentados. Los pasos de lavado se realizan para asegurar aún más la pureza ev, sin embargo, esto resulta en la reducción del número de vehículos eléctricos aislados, reduciendo así el rendimiento total 3,4. La utilidad de este método está limitada aún más por el requisito de un gran número de celdas (aproximadamente 1 x 108) y un gran volumen de muestra (> 100 ml) para lograr resultados adecuados.
Para abordar las crecientes preocupaciones, la precipitación de vesículas con polímeros hidrófilos se ha convertido en una técnica útil en los últimos años. El polietilenglicol (PEG), u otros reactivos de precipitación relacionados, permite al usuario bajar las vesículas, virus y agregados de proteína o proteína-ARN dentro de una muestra simplemente incubando la muestra con el reactivo de elección, seguido de un solo valor de baja velocidad centrifugación1,2,5. Hemos informado previamente que el uso de PEG o métodos relacionados para precipitar los vehículos eléctricos en comparación con los resultados tradicionales de ultracentrifugación en un rendimiento significativamente mayor6. Esta estrategia es rápida, fácil, no requiere equipos caros adicionales, es fácilmente escalable y retiene la estructura EV. Sin embargo, debido a la naturaleza promiscua de este método, las muestras resultantes contienen una variedad de productos, incluyendo proteínas libres, complejos proteicos, una gama de vehículos eléctricos y viriones que requieren una mayor purificación para obtener la población deseada1 ,2,7,8.
Para superar la heterogeneidad de los vehículos eléctricos obtenidos a partir de diversos métodos de precipitación, la ultracentrifugación de gradiente de densidad (DG) se utiliza para separar mejor las partículas en función de su densidad. Este método se lleva a cabo utilizando un gradiente escalonado utilizando un medio de gradiente de densidad, como iodixanol o sacarosa, que permite la separación de los vehículos eléctricos de proteínas, complejos proteicos y partículas similares a virus (VLP). Es importante señalar que, si bien una vez se pensó que la DG permitía una separación más precisa de las subpoblaciones de vehículos eléctrico, ahora se sabe que los tamaños y densidades de varias vesículas pueden superponerse. Por ejemplo, se sabe que los exosomas tienen densidades de flotación de 1,08-1,22 g/mL9,mientras que las vesículas aisladas del Golgi (COPI+ o clathrin+) tienen densidades de 1,05-1,12 g/ml y las del retículo endoplasmático (COPII+ ) sedimento sin 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Además, si uno desea comparar fracciones exosomales con fracciones que contienen partículas virales, esto puede llegar a ser más difícil dependiendo de la densidad del virus de interés, hay virus distintos del VIH-1 que probablemente se equilibran al mismo tiempo densidades como fracciones positivas exosómicas2.
Por último, el enriquecimiento de los preparativos de EV para la visualización posterior y los ensayos funcionales es vital para la investigación de vehículos eléctrico. El uso de nanopartículas enriquecedoras de EV, específicamente partículas de hidrogel multifuncionales que miden 700-800 nm de diámetro, son un paso crítico para lograr preparaciones concentradas del EV. Poseen un cebo aromático de alta afinidad que encapsulado por una concha de tamizado exterior poroso para promover la selectividad. Las nanopartículas utilizadas en este estudio incluyen dos preparaciones distintas con diferentes cebos de núcleo (Reactivo Rojo 120 NT80; y Cibacron Azul F3GA NT82) que han demostrado aumentar la captura de vehículos eléctricos de diversos reactivos y biofluidos (ver la Tabla de Materiales )6,10,11,12,13,14,15. Las partículas ofrecen un fácil enriquecimiento de los vehículos eléctricos de numerosos materiales de partida, incluyendo fracciones de iodixanol, sobrenadante de cultivo celular, así como biofluidos del paciente como plasma, suero, fluidos cefalorraquídeos (CSF) y orina6,13 .
El método presentado aquí mejora la eficiencia de las técnicas actuales de purificación de EV mediante la combinación de varias tecnologías; Precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas, para agilizar el flujo de trabajo, reducir los requisitos de la muestra y aumentar el rendimiento para obtener una muestra de EV más homogénea para su uso en toda la investigación ev. Este método es particularmente útil en la investigación de los vehículos eléctricos y su contenido durante la infección viral, ya que incluye un paso de filtración de 0,22 m para excluir vesículas y VLP grandes y no deseadas y la separación de la población total de vehículos eléctricos en función de la densidad para aislar los vehículos eléctricos de los viriones.
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Protocol
1. Filtración y precipitación de vesículas extracelulares (EV)
- Para preparar el sobrenadante de cultivo a partir de células infectadas o transfectó (es decir, líneas celulares y/o células primarias), el cultivo de aproximadamente 10 ml de células de registro tardío durante 5 días a 37 oC y 5% de CO2 en un medio de cultivo adecuado (es decir, RPMI o DMEM con 10% de suero [FBS]).
NOTA: Todos los reactivos de medios de cultivo deben estar libres de vehículos eléctricos, y pueden adquirirse (ver Tabla de Materiales)o prepararse internamente mediante la preultracentrifugación del suero a 100.000 x g durante 90 min. Este protocolo ha tenido éxito para varias líneas celulares de uso común, incluyendo: CEM, Jurkat, 293T, U937 (líneas no infectadas), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (líneas infectadas por VIH-1 y HTLV-1), múltiples células infectadas y células mieloides y T primarias (ambas infectados y no infectados); sin embargo, este protocolo se puede utilizar para cualquier tipo de celda, incluidos aquellos que requieren medios especializados o condiciones de referencia cultural. Es posible que sea necesario optimizar la densidad de las células para diferentes tipos de celdas. Se recomienda utilizar la densidad más alta con una muerte celular mínima después de 5 días. - Centrifugar el cultivo a 3.000 x g durante 5 min a las células de pellets y desechar el pellet.
- Filtrar el sobrenadante de cultivo utilizando un filtro estéril de 0,22 m y recoger el filtrado en un tubo limpio.
- Agregue el mismo volumen de reactivo de precipitación PEG (relación 1:1) al sobrenadante filtrado. Invierta el tubo varias veces para asegurar una mezcla homogénea.
NOTA: NO vórtice. - Incubar la mezcla a 4oC durante la noche (O/N).
- Mezcla de centrífuga a 1.500 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) para producir un pellet de EV heterogéneo.
NOTA: El pellet EV debe aparecer de color blanco o blanquecino. - Desechar el sobrenadante de cultivo agotado por EV.
- Resuspende el pellet EV en 150–300 l de solución salina 1x con fosfato sin calcio y magnesio (PBS) y manténgalo en hielo.
2. Construcción de un Gradiente de Densidad
- Mezclar el medio gradiente de densidad de iodixanol con 1x PBS para crear 11 fracciones de densidad de 1 ml diferentes de 6 a 18% de iodixanol en incrementos de 1,2% en tubos de microcentrífuga separados como se muestra en la Figura 1A.
- Vórtice cada tubo para mezclar.
- Las fracciones de densidad de capa en un tubo de ultracentrífuga de cubo de balanceo prelimpiado y seco que comienzan con la fracción #18 y terminan con #6 fracción como se indica en la Figura 1B.
NOTA: Todos los tubos deben desinfectarse utilizando un spray de lejía del 10% seguido de un enjuague 3vecero con agua desionizada y un lavado final de agua desionizada estéril antes de cargar las fracciones de gradiente. - Añadir pellets EV resuspendidos (300 l) a la parte superior del gradiente en capas en el tubo de ultracentrífuga.
- Ultracentrifugar a 100,00 x g a 4 oC durante 90 min.
- Retire cuidadosamente las fracciones de 1 ml del tubo ultracentrífugo y transfiera cada fracción a nuevos tubos de microcentrífuga.
3. Enriquecimiento de fracciones EV uUsing Nanoparticles
- Cree una suspensión del 30% de nanopartículas utilizando volúmenes iguales de NT80, NT82 y 1x PBS.
NOTA: La mezcla debe ser vórtitada antes de su uso para garantizar la homogeneidad. - Añadir 30 sl de la suspensión a cada tubo de microcentrífuga que contenga las fracciones de densidad y pipetearlas/invertirlas varias veces para mezclarlas.
- Gire los tubos de microcentrífuga de fracción de densidad que contienen nanopartículas enriquecedoras de EV O/N a 4 oC a aproximadamente 20 rpm.
- Tubos de microcentrífuga de fracción de densidad centrífuga a 20.000 x g durante 5 min a RT.
- Deseche el líquido y lave el pellet EV dos veces con 1pbS.
NOTA: Los pellets de nanopartículas pueden congelarse a -20 oC o utilizarse inmediatamente para varios ensayos posteriores (es decir, PCR, mancha occidental, espectrometría de masas y otros ensayos).
4. Preparación recomendada de pellets de nanopartículas para ensayos aguas abajo
-
Para el aislamiento de ARN
- Resuspenda el pellet en 50 ml de agua desionizada autoclave tratada con pirocarbonato de dietil (DEPC) al 0,001% filtrada a través de un filtro de 0,2 m y aísle el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit.
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Para electroforesis de gel
- Resuspenda el pellet directamente en 15 s de tampón Laemmli.
- Muestra de calor 3x a 95oC durante 3 min. Vortex suavemente y girar hacia abajo entre cada ciclo de calor.
- Muestra de centrífuga para 15 s a 20.000 x g y cargue todo el material elulado directamente en el gel.
NOTA: Para obtener mejores resultados, limite la cantidad de partículas cargadas en el gel y ejecute el gel a 100 V para asegurarse de que las partículas restantes estén contenidas en los pozos.
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Para la digestión de la trippsina
- Resuspenda el pellet en 20 ml de urea antes de la alquilación y la trippsinización de la muestra. Las nanopartículas pueden ser peletizadas por una centrifugación de 14.000 x g a RT durante 10 minutos.
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Representative Results
La precipitación DE PEG aumenta el rendimiento de EV
Nuestro enfoque combinado para el aislamiento EV es significativamente más eficiente en términos de recuperación de EV en comparación con la ultracentrifugación tradicional, como lo demuestra la reducción del 90% en el volumen de material de partida requerido. La ultracentrifugación, el estándar de oro actual en aislamiento EV, requiere aproximadamente 100 ml de sobrenadante de cultivo para producir una preparación de EV adecuada para ensayos aguas abajo, mientras que nuestro nuevo protocolo requiere sólo 10 ml. Esta reducción es posible gracias al uso del reactivo de precipitación PEG EV, que proporciona un aumento significativo en el rendimiento de los vehículos eléctrico medido por el análisis de nanoseguimiento (NTA). Los resultados de la Figura 2A,que se han publicado previamente6, indican que cuando se utilizan 10 ml de precipitación PEG sobrenadante de cultivo dio lugar a la recuperación de 7,27 x 1010 vehículos eléctricos, que fue aproximadamente 500 veces más que el número de de vehículos eléctricos recuperados del mismo material de partida utilizando ultracentrifugación (1,45 x 108). También se observó un aumento de la eficiencia del aislamiento de los exosomas, un subtipo específico de EV, como evidente por el aumento de los niveles de proteínas marcadoras de exosomas bien caracterizadas, CD81, CD63 y CD9. El análisis de manchas occidentales que compara los preparativos de EV producidos a partir de la ultracentrifugación o la precipitación EV utilizando un reactivo de precipitación PEG se muestra en la Figura 2B. Estos resultados muestran un aumento de 3.000 veces en CD81, un aumento de 4 veces en CD63 y un aumento de 40 veces en CD9 medido por el análisis de densitometría. En conjunto, estos resultados sugieren que el protocolo descrito no sólo aumenta el rendimiento total de los vehículos eléctrico, sino que también mejora la recuperación de los exosomas en comparación con la ultracentrifugación.
Caracterización de los vehículos eléctricos y separación de los vehículos eléctricos lejos del virus VIH-1
Con el fin de caracterizar las vesículas presentes en cada fracción después del enriquecimiento de nanopartículas, los vehículos eléctricos se aislaron de CEM no infectado o de un sobrenadante de cultivo celular U1 infectado por el VIH-1 utilizando el protocolo descrito y caracterizados utilizando la mancha occidental de cada fracción de iodixanol enriquecida con nanopartículas. Los datos de la Figura 3A muestran nuestros resultados publicados anteriormente que demuestran la presencia o ausencia de tres tetraspaninas exosomales (CD81, CD63 y CD9) en cada fracción (células CEM; panel superior). Los resultados indican que los exosomas, tal como se definen por la presencia de las tres tetraspantinas dentro de la fracción, se encuentran en tres poblaciones distintas: Exo #1 que incluye las fracciones 10.8-12.0, Exo #2 que incluye las fracciones 15.6-16.8, y Exo-3 que incluye sólo la fracción 18.0. A pesar de la presencia de tres poblaciones distintas, el protocolo no puede descartar la posibilidad de la presencia de tipos adicionales de vehículos eléctricos dentro de cada fracción. Además, estos resultados no excluyen definitivamente la posibilidad de que haya vesículas en estas poblaciones que sean positivas para una combinación de los marcadores de tetraspantina probados. Estos vehículos eléctricos podrían separarse aún más mediante estrategias de purificación adicionales.
El campo en rápido desarrollo de la investigación de EV/exosomas ha explotado desde su descubrimiento y ha dado lugar a muchas funciones y aplicaciones recién descubiertas para estas vesículas. En particular, su papel como mensajeros intracelulares no sólo en la fisiología normal, sino también en la enfermedad ha llevado al uso de recursos significativos para diseccionar los efectos y la utilidad de las vesículas extracelulares, específicamente los exosomas, en las células receptoras16 , 17 , 18. Numerosos estudios han implicado vehículos eléctricos en la patogénesis de una variedad de infecciones, incluyendo VIH-16,10,12,19,20,21 , 22. Sin embargo, la similitud de tamaño entre los vehículos eléctricos y los viriones presenta un obstáculo potencial en la definición de estos mecanismos mediados por los vehículos eléctricos. Para abordar esta preocupación, hemos diseñado nuestro protocolo para implementar un gradiente de densidad para separar eficazmente las poblaciones de vehículos eléctrico de los viriones. Con este fin, el sobrenadante del cultivo celular de las células infectadas por el VIH-1 fue sometido al protocolo presentado y analizado por western blot para la presencia de HIV-1 Gag p24 para determinar qué fracción o fracciones contenían viriones VIH-1. Los resultados mostrados en la Figura 3A (panel medio) muestran la localización de p24 en tres condiciones independientes: en ausencia de un inductor, en presencia de un inductor (Phorbol 12-myristate 13-acetate; PMA), y en presencia de PMA y terapia antirretroviral combinada (cART), el tratamiento estándar para el VIH-1. Estos datos indican que el virus VIH-1 se localiza en la fracción 16,8 medida por la presencia de p24 y su poliproteína No desnudecida Pr55. Además, cuando las células están sometidas a cART, que incluye Indinavir, un inhibidor de la proteasa que evita el escote de Pr55 a p24, no se detectó p24 en ninguna fracción. En su lugar, sólo se detectó Pr55 y estuvo presente en las fracciones 16.8-18.0, lo que indica un desplazamiento del virus a fracciones más densas. Se obtuvieron resultados similares utilizando macrófagos primarios (panel inferior). Aunque el protocolo descrito da como resultado la cosedimentación de las poblaciones de Exo #2 y Exo #3 con virus, la población de Exo #1 (fracciones 10.8-12.0) permaneció libre de virus, permitiendo ensayos posteriores libres de contaminación por virus.
Este tipo de separación del virus lejos de los vehículos eléctricos nos permite abordar la posibilidad de que trozos de virus entren en vehículos eléctricos o sean secretados de células infectadas como proteína libre. Los resultados de la Figura 3B indican que la proteína HIV-1 Nef se puede encontrar en la población de Exo #1 además de las poblaciones de Exo #2 y Exo #3. Nef también aparece en la fracción 6.0, lo que indica que Nef puede ser potencialmente secretado de las células infectadas como una proteína libre y dentro de un VEHÍCULO eléctrico. Además, la proteína VIH-1 Vpr se encuentra en la fracción 6.0, mientras que la proteína VIH-1 Tat se encuentra predominantemente en la fracción 6.0, pero también aparece en las fracciones 7.2-9.6. Actualmente estamos probando todas las fracciones para la presencia de proteína Tat por ELISA. Estos resultados indican que tanto Tat como Vpr pueden ser secretados de células infectadas, probablemente como proteínas libres, mientras que Tat también podría incorporarse a los vehículos eléctricos. En conjunto, estos datos indican que nuestro método de aislamiento de EV puede aislar con éxito los exosomas (Exo #1) lejos de los viriones VIH-1 (Exo #2 y #3) y que los vehículos eléctricos de las células infectadas por el VIH-1 contienen algunas proteínas VIH-1, que pueden afectar la patogénesis del VIH-1.
Caracterización de los vehículos eléctricos y separación de los vehículos eléctricos lejos de otros virus
Para aplicar este protocolo a otros modelos de infección viral, hemos caracterizado vesículas de células infectadas con varios virus diferentes. La Figura 3C muestra una ilustración de las distribuciones de vesículas y virus previamente obtenidas después de la precipitación, separación y enriquecimiento de acuerdo con el protocolo descrito. Como se muestra anteriormente en la Figura 3A,los exosomas (CD9+CD63+CD81+) están presentes en tres poblaciones diferentes (Exo #1, fracciones 10.8-12.0; Exo #2, las fracciones 15.6-16.8, y Exo-3, fracción 18.0) y el virus VIH-1 localizan a las fracciones de mayor densidad 16.8 y 18.0 (carriles 10-11). No es de extrañar que, al aplicar este protocolo para caracterizar los vehículos eléctricos liberados del virus linfotrópico humano Tipo 1 (HTLV-1), un retrovirus que se sabe que causa cáncer en adultos, observamos resultados similares a los de los vehículos eléctricos relacionados con el VIH-1. El tercer panel de la Fig. 3C muestra que el virus HTLV-1 se localizó principalmente a la fracción de mayor densidad (18.0) y, en menor medida, las fracciones 13.2-16.8 como lo demuestra la presencia de proteína matriz HTLV-1 (p19). Además, hemos encontrado previamente que la proteína transactivadora HTLV-1, Tax, que está ausente del virión HTLV-1, está presente dentro de los exosomas liberados de las células infectadas HTLV-115,23. Los datos de la Figura 3C muestran que el impuesto estaba presente en las fracciones de menor densidad (6.0-12.0), dos de las cuales hemos demostrado contener exosomas (10.8 y 12.0).
A continuación, probamos el protocolo de aislamiento en el contexto de virus más grandes y más pequeños como el virus del Ebola (EBOV) y el virus del Zika (ZIKV), respectivamente, ya que los viriones VIH-1 y HTLV-1 son retrovirus y de diámetro muy similar. Utilizando VLP como un modelo de nivel de bioseguridad suplente 2 (BSL-2) de montaje y salida de EBOV, encontramos que VLP, que es de aproximadamente 1 m de longitud, se localiza a la fracción de densidad más alta (18.0) en ausencia de filtración de 0,22 m (panel medio, Figura 3C). Además, cuando el VP40, la proteína matriz EBOV, se expresa en niveles altos, se secreta de la célula a través de varios mecanismos diferentes que resultan en la presencia de VP40 en cada fracción de densidad, incluyendo aquellos a los cuales se localizan los exosomas13 , 14. Por el contrario, los viriones ZIKV son significativamente más pequeños que los viriones VIH-1, midiendo aproximadamente 40 nm de diámetro. El diagrama representativo en el panel inferior de la Figura 3C muestra la presencia de viriones ZIKV tanto en fracciones de baja densidad (6.0-8.4) como de alta densidad (15.6-18.0), lo que sugiere la presencia de virus libres y virus encapsulados en EV, respectivamente.
Figura 1: Construcción de un gradiente de densidad iodixanol. (A) Cantidades relativas de iodixanol y PBS utilizadas para crear cada fracción de densidad (Fracción). La fracción - denota el porcentaje de iodixanol incluido en cada fracción. Sus densidades relativas y la colocación en el gradiente se representan de más pesado a más ligero. (B) Se muestra la colocación de las fracciones de densidad (6,0-18) en el tubo de ultracentrífuga (lado izquierdo), así como la ubicación de las tres poblaciones de vehículos eléctrico (Exo #1, Exo #2, Exo #3), vesículas similares a Exo y complejos proteicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El reactivo de precipitación PEG aumenta el rendimiento ev. (A) Para comparar la recuperación de vehículos eléctricos, los vehículos eléctricos se aislaron del sobrenadante del cultivo del monocitos infectados por el VIH-1 5 d (U1) (10 ml) utilizando la ultracentrifugación tradicional (100.000 x g)o el reactivo de precipitación PEG (incubación en una proporción 1:1). Los vehículos eléctricos de ambos procedimientos de enriquecimiento se analizaron utilizando el análisis de nanoseguimiento para evaluar la concentración de EV resultante, tal como se describe en DeMarino, et al.6. LA NTA se midió en 11 posiciones independientes en triplicado técnico. Las barras azules representan un promedio de las 33 mediciones de S.D. Se determinó la significancia estadística utilizando una prueba tde dos colas del estudiante; p < 0.001. B. EVs de sobrenadante de cultivo CEM de 5 días utilizando precipitación de ultracentrifugación (UC) o PEG seguida de separación de densidad de iodixanol. La ultracentrifugación se realizó utilizando 100 ml de sobrenadante de cultivo (Carril 1) mientras que la precipitación PEG y posterior fraccionamiento de iodixanol se realizaron utilizando 10 ml de sobrenadante de cultivo (carril 2). El pellet EV total obtenido de la ultracentrifugación y la fracción de 10,8 de la separación PEG/iodixanol fueron analizados por la mancha occidental para detectar la presencia de proteínas marcadoras exosomales (CD81, CD63 y CD9) con Actin como control. Para mayor claridad, los carriles seleccionados de la misma mancha con exposiciones idénticas se muestran en el panel B. Esta cifra ha sido modificada de DeMarino, et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aislamiento de los vehículos eléctricos lejos de los virus. (A) Supernatantes de cultivo de cinco días de células CEM no infectadas (panel superior), VIH-1 (Ba-L; MOI: 0,01) células U1 infectadas (tratamiento de PMA y cART; panel medio) o macrófagos primarios infectados por el VIH-1 (panel inferior) fueron incubadas con reactivo de precipitación PEG a 4 oC durante la noche. Los vehículos eléctricos se separaron en fracciones utilizando un gradiente de densidad de iodixanol. Los vehículos eléctricos de todas las fracciones se enriquecieron utilizando partículas NT80/82 durante la noche a 4 oC. Los nanopellets CEM se analizaron utilizando la mancha occidental para detectar la presencia de proteínas de marcador exosomal CD81, CD63 y CD9. U1 (tratamiento de PMA y CART) y macrófagos primarios infectados por el VIH-1 se analizaron para detectar la presencia de proteína amordalga VIH-1 (p24 y Pr55; poliproteína de detección del VIH-1 de la nula y la desnudez, respectivamente), así como CD63. Blots fueron sondeados por actina como un control. Las poblaciones reales de exosomas (CD81+CD63+CD9+) se describen en rojo. Esta cifra ha sido modificada de DeMarino, et al.6 (B) Los supernatantes de cultivo de cinco días de células U1 infectadas fueron incubados con reactivo de precipitación PEG a 4 oC durante la noche. Los vehículos eléctricos se separaron en fracciones utilizando un gradiente de densidad de iodixanol. Los vehículos eléctricos de todas las fracciones se enriquecieron utilizando partículas NT80/82 durante la noche a 4 oC. Las fracciones se ejecutaron en una mancha occidental por la presencia de HIV-1 Nef, Vpr y Tat. Actin fue usado como control. Las poblaciones de exosomas verdaderos (CD81+CD63+CD9+) se describen en rojo como se definió anteriormente en DeMarino, et al.6 (C) Ilustración representativa de perfiles de separación EV previamente caracterizados de cuatro perfiles de separación EV previamente caracterizados de cuatro diferentes virus: VIH-1, HTLV-1, EBOV y ZIKV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Flujo de trabajo de protocolo. El nuevo flujo de trabajo combina varias técnicas, incluyendo filtración, precipitación EV utilizando reactivo de precipitación PEG, separación de gradiente de densidad de iodixanol y enriquecimiento de nanopartículas de vehículos eléctricos. La utilización de este protocolo separa los vehículos eléctricos de varios virus y proporciona una muestra de pequeño volumen para ensayos posteriores que incluyen qPCR, western blot, espectrometría de masas, secuenciación de ARN, análisis de citoquinas, ELISA y ensayos basados en células. Esta cifra ha sido modificada de DeMarino, et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método descrito permite mejorar el rendimiento de los vehículos eléctricos y la separación del virus de los vehículos eléctricos mediante un enfoque combinado para el aislamiento. Las cantidades relativamente grandes de material de partida (es decir, sobrenadante celular) se pueden filtrar antes del aislamiento del EV por precipitación, separación DG y enriquecimiento de nanopartículas, lo que resulta en un volumen final de 30 ol, lo que permite un uso inmediato en una variedad de ensayos aguas abajo. El uso del enriquecimiento de nanopartículas es esencial, ya que, en comparación con la ultracentrifugación tradicional, se ha demostrado que estas nanopartículas enriquecedoras de EV capturan las vesículas de manera más eficiente, produciendo una cantidad mayor o igual a la cantidad de vesículas a partir de 1 ml de cultivo sobrenadante comparado con 10 ml de sobrenadante de cultivo ultracentrifuged15. En general, el protocolo descrito incluye la combinación de varias técnicas conocidas y, por lo tanto, debe presentar dificultades limitadas. Sin embargo, la incorporación de nanopartículas enriquecedoras de EV introduce una nueva técnica que puede requerir la solución de problemas y/o modificaciones para lograr resultados deseables dependiendo del ensayo descendente o del objetivo biológico de interés. Recomendamos que las nanopartículas se incuban con supernatantes de cultivo celular filtrado durante la noche. Si la proteína diana o ARN de interés es de baja abundancia en el sistema modelo, el protocolo se puede adaptar para aumentar el período de incubación para asegurar la captura del objetivo. La utilización de nanopartículas en ensayos aguas abajo normalmente se puede lograr mediante la repetición del pellet en el búfer de muestra deseado para cada ensayo. Por ejemplo, las nanopartículas se pueden resuspender directamente en el búfer de Laemmli para el análisis de manchas occidentales. El material capturado debe entonces ser eluted más eficientemente de las nanopartículas en SDS a través de ciclos de calentamiento y vórtice. Para lograr una separación adecuada de la proteína, se debe tener cuidado de limitar la cantidad de nanopartículas cargadas en el gel, y el gel debe funcionar a aproximadamente 100 V para garantizar que las partículas restantes estén contenidas en los pozos. Además, para la visualización de proteínas de bajo peso molecular, una transferencia húmeda durante la noche logra resultados óptimos. Aunque el uso de nanopartículas resulta en un enriquecimiento significativo de las poblaciones de vesículas, se deben tomar medidas adicionales para eludir el material capturado de las partículas. Además, la elución del material puede potencialmente limitar la utilidad de los vehículos eléctricos en ensayos funcionales aguas abajo, ya que muchos tampones de elución pueden dañar la integridad de la membrana EV. Se necesita investigación adicional para diseñar una estrategia que permita la eliminación de vesículas intactas de las nanopartículas después de la incubación. Otra desventaja de estas partículas es la actual falta de caracterización. La cáscara externa de la partícula ha sido diseñada para excluir moléculas de alto peso molecular. Sin embargo, la orientación específica de las partículas a los vehículos eléctricos no tiene lugar, y como resultado muchos factores de confunción y señales de fondo pueden estar potencialmente presentes en los ensayos posteriores.
El método descrito debe utilizarse principalmente con fines de laboratorio. Recientemente hemos desarrollado métodos alternativos para ampliar las capacidades de nuestro enfoque de combinación a técnicas adicionales para aislar los vehículos eléctricos a partir de biofluidos de pacientes a pequeña escala, como plasma y LCV, y la producción comercial de vehículos eléctricos a gran escala. Para el aislamiento de los vehículos eléctricos lejos del virus en el material del paciente hemos incorporado el uso de columnas de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), que se utilizan en lugar de un gradiente de densidad. Estas columnas son beneficiosas en el que son desechables y por lo tanto son ideales en laboratorios de alta contención. Sin embargo, las columnas SEC separan las partículas según el tamaño, por lo tanto, se deduce que este tipo de separación sólo es aplicable para la separación de virus grandes o muy pequeños, como EBOV (1 m) o ZIKV (40 nm), respectivamente, de los vehículos eléctricos o la separación de proteínalibre. En términos de producción de vehículos eléctricos a gran escala, los recientes avances en los métodos basados en filtración, a saber, la filtración de flujo tangencial (TFF), han permitido el aislamiento eficiente de los vehículos eléctricos de grandes volúmenes de muestra. TFF se ha utilizado históricamente para la purificación de biomoléculas nanométricas, incluidos los virus, y a través de la optimización de protocolos este sistema se ha adaptado con éxito para el aislamiento de los vehículos eléctricos24,25. Brevemente, durante el proceso tFF, el fluido de muestra fluye tangencialmente a través de la superficie de una membrana semipermeable que retiene selectivamente las vesículas en función del tamaño y el peso molecular, lo que permite la separación de los vehículos eléctricos lejos de las proteínas libres y otras biomoléculas contaminantes26. En comparación con la ultracentrifugación, se ha informado de que TFF resulta en mayores rendimientos, menos agregación y reduce la variabilidad de lote a lote de los Vehículos Eléctricos27. Además, el uso de TFF para las buenas prácticas de fabricación (GMP) aislamiento de grado de los vehículos eléctricos para la aplicación terapéutica también se ha informado28. Debido a su escalabilidad y reproducibilidad, esta tecnología ofrece un gran potencial para futuras investigaciones de vehículos eléctrico.
Los virus vienen en diferentes tamaños y densidades, por lo tanto, dependiendo del virus en cuestión, la optimización de este protocolo puede ser necesaria. Para virus muy grandes como el ébola (1 m o más de longitud), se puede utilizar una filtración simple para eliminar la gran mayoría de los viriones y grandes cuerpos contaminantes como los VLP y los cuerpos apoptoticos14. Esto permite que la mayor parte de la separación del virus lejos de los vehículos eléctricos sea ejecutable en el extremo frontal de la purificación. Sin embargo, en el caso de virus más pequeños como el enterovirus (30 nm), el virus del Zika (40 nm), el virus de la hepatitis B (42 nm), el virus de la hepatitis C (55 nm) y otros, la fracción en la que los viriones de sedimento tendrán que determinarse antes de que sea funcional posterior Análisis. No siempre se puede aproximar la fracción probable de sedimentación basada únicamente en el diámetro de las partículas. Por ejemplo, el poliovirus, que tiene un diámetro de 30 nm, también se sabe que está encapsulado en autagounosas secretores29,30,31,32,33, y por lo tanto es probable que se encuentre en el lado derecho del gradiente (fracciones más densas) en lugar del izquierdo (fracciones menos densas). Si bien hemos optimizado este protocolo en el caso de los VLP VIH-1, HTLV-1 y EBOV, los virus adicionales necesitarán caracterización para ajustar el protocolo para su purificación específica lejos de los vehículos eléctricos.
El protocolo descrito aquí(Figura 4) permite, por primera vez, al usuario separar los vehículos eléctricos del virus con una mayor eficiencia y volúmenes más pequeños de material de partida en comparación con el estándar de oro de aislamiento EV, ultracentrifugación. Este método se puede adaptar fácilmente a las condiciones a mano, incluyendo diferentes tamaños de muestra, rendimientos requeridos, tipo de material de partida (es decir, sobrenadante de cultivo frente a material del paciente), y varios virus diferentes de diferentes tamaños.
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Disclosures
B.L. está afiliada a Ceres Nanosciences inc. que produce reactivos y/o instrumentos utilizados en este artículo. Todos los demás autores no declaran posibles conflictos de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del laboratorio de Kashanchi, especialmente a Gwen Cox. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud (NIH) (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 y NS099029 a F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
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