Summary
Detta protokoll isolerar extracellulära blåsor (EVs) bort från virioner med hög verkningsgrad och avkastning genom att införliva EV nederbörd, densitet lutning ultracentrifugation, och partikel fångst för att möjliggöra ett förenklat arbetsflöde och en minskning av Start volym krav, vilket resulterar i reproducerbara preparat för användning i all EV forskning.
Abstract
En av de största hindren inom området extracellulär vesikel (EV) forskning idag är förmågan att uppnå renade EV preparat i en viral Infection inställning. Den presenterade metoden är tänkt att isolera EVS bort från virioner (dvs hiv-1), vilket möjliggör en högre effektivitet och avkastning jämfört med konventionella ultracentrifugering metoder. Vårt protokoll innehåller tre steg: EV nederbörd, densitet gradient separation och partikel fångst. Nedströms analyser (dvs, Western blot, och PCR) kan köras direkt efter partikel fångst. Denna metod är fördelaktig framför andra isoleringsmetoder (dvs. ultracentrifugation) eftersom det möjliggör användning av minimala startvolymer. Dessutom är det mer användarvänligt än alternativa EV isoleringsmetoder som kräver flera ultracentrifugering steg. Den presenterade metoden är dock begränsad i sin omfattning av funktionella EV-analyser eftersom det är svårt att eluera intakt EVs från våra partiklar. Dessutom är denna metod skräddarsydd för en strikt forskningsbaserad miljö och skulle inte vara kommersiellt gångbar.
Introduction
Forskning centrerad kring extracellulära blåsor (EVs), specifikt exosomes, en typ av EV som sträcker sig 30-120 Nm och kännetecknas av närvaron av tre tetraspanin markörer CD81, CD9, och CD63, har till stor del formats av utvecklingen av metoder för att isolera och rena vesiklarna av intresse. Förmågan att dissekera mångfacetterade mekanismer har hindrats på grund av komplicerade och tidskrävande tekniker som genererar prover som består av en heterogen population av vesikler som genereras via olika vägar med ett brett spektrum av innehåll, storlekar och Tätheter. Även om detta är en fråga för nästan alla EV forskning, det är av särskild betydelse när man studerar EVs i samband med virusinfektion, som virioner och virusliknande partiklar (VLPs) kan vara liknande i diameter till vesikler av intresse. Till exempel, humant immunbrist virus typ 1 (HIV-1) är cirka 100 nm i diameter, vilket är ungefär samma storlek som många typer av EVs. Därför har vi utformat ett nytt EV-isolerings arbetsflöde för att lösa dessa problem.
Den nuvarande Guldstandarden för EV isolering är ultracentrifugation. Denna teknik utnyttjar de olika vesikeldensiteterna, vilket gör att vesiklarna kan separeras genom centrifugering med differentiell sedimentering av partiklar med högre densitet jämfört med partiklar med lägre densitet vid varje etapp 1,2. Flera lågfart centrifugering steg krävs för att ta bort intakt celler (300-400 x g för 10 min), cellfragment (~ 2 000 x g för 10 min), och apoptotiska organ/stora blåsor (~ 10 000 x g för 10 min). Dessa initiala reningar följs av hög hastighet ultracentrifugering (100000-200000 x g för 1.5-2 h) till sediment EVS. Tvätta steg utförs för att ytterligare säkerställa EV renhet, men detta resulterar i en minskning av antalet isolerade EVS, vilket sänker den totala avkastningen 3,4. Denna metodens nytta begränsas ytterligare av kravet på ett stort antal celler (ca 1 x 108) och en stor provvolym (≫ 100 ml) för att uppnå tillräckliga resultat.
För att ta itu med den växande oron har utfällning av vesikler med hydrofila polymerer blivit en användbar teknik under de senaste åren. Polyetylenglykol (PEG), eller andra relaterade nederbörd reagens, gör det möjligt för användaren att dra ner blåsor, virus, och protein eller protein-RNA aggregat i ett prov genom att helt enkelt inkuberar provet med reagens val, följt av en enda låg hastighet centrifugering1,2,5. Vi har tidigare rapporterat att användning av PEG eller relaterade metoder för att fälla ut EVS i jämförelse med traditionell ultracentrifugering resulterar i en betydligt högre avkastning6. Denna strategi är snabb, lätt, inte kräver extra dyr utrustning, är lätt skalbar, och behåller EV struktur. Men på grund av den promiskuösa karaktären hos denna metod, de resulterande proverna innehåller en mängd olika produkter, inklusive fria proteiner, proteinkomplex, en rad EVs, och virioner vilket kräver ytterligare rening för att få önskad population1 ,2,7,8.
För att övervinna heterogenitet av EVS erhålls från olika nederbörd metoder, densitet gradient ultracentrifugering (DG) utnyttjas för att bättre separera partiklar baserat på deras densitet. Denna metod utförs med hjälp av en stegvis gradient med hjälp av en densitet gradient medium, såsom iodixanol eller sackaros, som gör det möjligt för separation av EVs från proteiner, proteinkomplex, och virus eller virusliknande partiklar (VLPs). Det är viktigt att notera att även om det var en gång trodde att DG tillät mer exakt separation av EV subpopulationer, är det nu känt att storlekar och densiteter av olika blåsor kan överlappa varandra. Till exempel, exosomer är kända för att ha flotationdensiteter på 1,08-1,22 g/ml9, medan vesikler isolerade från Golgi (COPI+ eller proteinet+) har densiteter på 1,05-1,12 g/ml och de från endoplasmatiska Retikulum (copii+ ) sediment vid 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Dessutom, om man önskar att jämföra exosomala fraktioner mot fraktioner som innehåller viruspartiklar, detta kan bli svårare beroende på tätheten av viruset av intresse-det finns virus än hiv-1 som sannolikt jämvikt på samma densiteter som exosomalt positiva fraktioner2.
Slutligen, anrikning av EV Preps för nedströms visualisering och funktionella analyser är avgörande för EV forskning. Användningen av EV-berikande nanopartiklar, särskilt multifunktionella hydrogel partiklar som spänner 700-800 nm i diameter, är ett kritiskt steg för att uppnå koncentrerad EV Preps. De besitter en hög affinitet aromatiska bete som inkapslade av en porös yttre siktning skal för att främja selektivitet. De nanopartiklar som används i denna studie omfattar två distinkta preparat med olika kärn beten (reaktiv röd 120 NT80; och Cibacron Blue F3GA NT82) som har visat sig öka fångsten av EVs från olika reagenser och biofluider (se tabellen över material )6,10,11,12,13,14,15. Partiklarna erbjuder enkel anrikning av EVS från många utgångsmaterial inklusive iodixanol fraktioner, cellkultur supernatant, samt patient biofluider såsom plasma, serum, cerebral spinal vätskor (CSF), och urin6,13 .
Den metod som presenteras här förbättrar effektiviteten i nuvarande EV reningsteknik genom att kombinera flera tekniker; EV nederbörd, densitet lutning ultracentrifugation, och partikelavskiljning, att effektivisera arbetsflödet, minska provkraven, och öka avkastningen för att få en mer homogen EV prov för användning i all EV forskning. Denna metod är särskilt användbar i undersökningen av EVs och deras innehåll under virusinfektion eftersom det innehåller ett 0,22 μm filtrerings steg för att utesluta stora, oönskade blåsor och VLPs och separation av den totala EV populationen baserat på densitet för att effektivt isolera EVs från virions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. filtrering och utfällning av extracellulära blåsor (EVs)
- För att förbereda kulturen supernatanten från infekterade eller transfekterade celler (dvs cellinjer och/eller primära celler), kultur cirka 10 ml sena-log celler för 5 dagar vid 37 ° c och 5% Co2 i lämpliga odlingssubstrat (dvs, RPMI eller DMEM med 10% fetal Nötkreatur serum [FBS]).
Anmärkning: Alla odlingssubstrat reagenser bör vara fria från EVs, och kan antingen köpas (se tabell över material) eller förberedas i-huset av pre-ultracentrifugation av serum vid 100 000 x g för 90 min. Detta protokoll har varit framgångsrikt för flera vanligen använda cellinjer inklusive: Cem, Jurkat, 293t, U937 (icke-infekterade linjer), U1, j 1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (hiv-1 och HTLV-1 infekterade linjer), flera transfekterade celler, och primära myeloida och T-celler (båda infekterade och icke-infekterade); Det här protokollet kan dock användas för alla celltyper, inklusive de som kräver specialiserade medie-eller kultur villkor. Tätheten av celler kan behöva optimeras för olika celltyper. Det rekommenderas att den högsta densiteten användas med minimal celldöd efter 5 dagar. - Centrifugera kulturen vid 3 000 x g i 5 min till pellets celler och kassera pelleten.
- Filtrera kultur supernatanten med ett sterilt 0,22 μm filter och samla upp filtratet i ett rent rör.
- Lägg till samma volym av PEG nederbörd reagens (1:1 ratio) till filtrerad supernatant. Invertera röret flera gånger för att säkerställa en homogen blandning.
Anmärkning: Skaka inte . - Inkubera blandningen vid 4 ° c över natten (O/N).
- Centrifugera blandningen vid 1 500 x g i 30 min vid rumstemperatur (RT) för att ge en HETEROGEN EV-pellet.
Anmärkning: EV pelleten ska visas vit eller benvit i färg. - Kassera den EV-utarmade kulturen supernatanten.
- Omsuspendera EV-pelleten i 150 – 300 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium (PBS) och håll på isen.
2. konstruktion av en densitetsgradient
- Blanda iodixanol densitet gradient medium med 1x PBS att skapa 11 olika 1 mL densitet fraktioner från 6 till 18% iodixanol i 1,2% steg i separata microcentrifug rör som visas i figur 1a.
- Vortex varje tub att blanda.
- Skikt densitet fraktioner i en pre-rengöras och torrt svängig hink första röret börjar med bråk #18 och slutar med bråk #6 som anges i figur 1b.
Anmärkning: Alla rör bör saneras med hjälp av en 10% blekmedel spray följt av sköljning 3x med avjoniserat vatten och en sista tvätt av sterilt avjoniserat vatten före lastning av gradientfraktioner. - Tillsätt återsuspenderad EV-pellet (300 μl) till toppen av den skiktade gradienten i första-röret.
- Ultracentrifuge vid 100, 00 x g vid 4 ° c för 90 min.
- Ta försiktigt bort 1 ml-fraktionerna från första-röret och överför varje fraktion till nya mikrocentrifugrör.
3. anrikning av EV fraktioner uUsing nanopartiklar
- Skapa en 30% flytgödsel av nanopartiklar med lika volymer NT80, NT82, och 1x PBS.
Anmärkning: Blandningen bör vortexed före användning för att säkerställa homogenitet. - Tillsätt 30 μL av slam till varje microcentrifug rör som innehåller densitetsfraktioner och Pipettera/Invertera dem flera gånger för att blanda.
- Rotera EV-berikande nanopartikel-innehållande densitet fraktion mikrocentrifug rör O/N vid 4 ° c vid cirka 20 RPM.
- Centrifugera densitet fraktions mikrocentrifug rör på 20 000 x g för 5 min vid RT.
- Kassera vätskan och tvätta EV pelleten två gånger med 1x PBS.
Anmärkning: Nanopartikelpellets kan frysas vid-20 ° c eller omedelbart användas för olika nedströms analyser (dvs., PCR, Western blot, masspektrometri, och andra analyser).
4. Rekommenderad beredning av Nanopartikelpellet för nedströms analyser
-
För RNA-isolering
- Omsuspendera pelleten i 50 μL autoklav avjoniserat vatten som behandlats med 0,001% dietylenpyrokarbonat (DEPC) filtrerat genom ett 0,2 μm filter och isolera RNA enligt sats tillverkarens protokoll.
-
För gel elektrofores
- Omsuspendera pelleten direkt i 15 μL Laemmli-buffert.
- Värm provet 3x vid 95 ° c i 3 min. Vortexblanda försiktigt och snurra mellan varje värme cykel.
- Centrifugera provet för 15 s vid 20 000 x g och ladda allt eluerat material direkt på gelen.
Obs: för bästa resultat, begränsa mängden partiklar som lastas på gelen och kör gelen vid 100 V för att säkerställa att eventuella kvarvarande partiklar finns i brunnarna.
-
För trypsin matsmältning
- Omsuspendera pelleten i 20 μL urea före alkylering och trypsinization av provet. Nanopartiklar kan pelleteras med en 14 000 x g centrifugering vid RT i 10 min. provinnehåll Ande den trypsinized peptiden kan överföras till ett rent uppsamlings rör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PEG nederbörd ökar EV avkastning
Vår kombination inställning till EV isolering är betydligt effektivare när det gäller EV återhämtning jämfört med traditionell ultracentrifugation, som framgår av 90% minskning av volymen av startmaterial som krävs. Ultracentrifugation, den nuvarande guldmynt standard i EV isolering, kräver cirka 100 mL av kulturen supernatanten att producera en adekvat EV prep för nedströms analyser, medan vårt nya protokoll kräver endast 10 mL. Denna minskning är möjlig genom användning av PEG EV nederbörd reagens som ger en betydande ökning av EV avkastning mätt med nanotracking analys (NTA). Resultaten i figur 2A, som tidigare har publicerats6, indikerar att vid användning av 10 ml kultur supernatanten PEG nederbörd resulterade i återvinning av 7,27 x 1010 evs, vilket var cirka 500-faldigt mer än antalet av EVS återhämtade sig från samma utgångsmaterial med ultracentrifugering (1,45 x 108). Ökad effektivitet av isolering av exosomer, en specifik EV subtyp, observerades också som framgår av ökade nivåer av väl kännetecknas exosome markör proteiner, CD81, CD63, och CD9. Western blot-analys jämföra EV Preps som framställts av antingen ultracentrifugering eller ev nederbörd med hjälp av en PEG nederbörd reagens visas i figur 2b. Dessa resultat visar en 3 000-faldig ökning av CD81, en 4-faldig ökning av CD63, och en 40-faldig ökning av CD9 mätt med densitometri analys. Sammantaget tyder dessa resultat på att det konturerade protokollet inte bara ökar den totala EV-avkastningen utan också förbättrar återhämtningen av exosomer jämfört med ultracentrifugation.
Karakterisering av EVs och separation av EVs bort från HIV-1-virus
För att karakterisera de blåsor som finns i varje fraktion efter nanopartikelberikning isolerades EVs från icke-infekterade CEM eller HIV-1-infekterade U1-cellkultursupernatanten med hjälp av det konturerade protokollet och kännetecknades av Western blot nanopartikelberikad iodixanol fraktion. Uppgifterna i figur 3a visar våra tidigare publicerade resultat som visar närvaron eller frånvaron av tre exosomala tetraspaniner (CD81, CD63 och CD9) i varje FRAKTION (CEM-celler; övre panelen). Resultaten indikerar att exosomer, såsom de definieras av närvaron av alla tre tetraspaniner inom fraktionen, återfinns i tre distinkta populationer: exo #1 som inkluderar fraktioner 10.8-12.0, EXO #2 som inkluderar fraktioner 15,6-16,8, och EXO # 3 som inkluderar endast 18,0-fraktionen. Trots närvaron av tre olika befolkningsgrupper kan protokollet inte utesluta möjligheten att det finns ytterligare typer av EVs inom varje fraktion. Dessutom utesluter dessa resultat inte slutgiltigt möjligheten att det finns blåsor i dessa populationer som är positiva för en kombination av de testade tetraspanin markörer. Dessa EVs kan sedan separeras ytterligare genom ytterligare renings strategier.
Det snabbt växande området EV/exosome forskning har exploderat sedan upptäckten och har resulterat i många nyfunna funktioner och tillämpningar för dessa vesikler. I synnerhet deras roll som intracellulära budbärare i inte bara normal fysiologi utan också i sjukdom har lett till användning av betydande resurser för att dissekera effekterna och nyttan av extracellulära blåsor, specifikt exosomes, på mottagar celler16 , 17 , 18. många studier har inblandad EVS i patogenesen av en rad olika infektioner, inklusive hiv-16,10,12,19,20,21 , 22. storleken på likheten mellan EVS och virioner utgör dock ett potentiellt hinder för att definiera dessa EV-medierade mekanismer. För att ta itu med denna oro, har vi utformat vårt protokoll för att genomföra en densitet gradient för att effektivt separera EV populationer från virioner. För detta ändamål, cellkultur supernatanten från HIV-1 infekterade celler utsattes för det presenterade protokollet och analyseras av Western blot för förekomst av HIV-1 gag p24 att avgöra vilken fraktion eller fraktioner innehöll HIV-1 virions. Resultaten som visas i figur 3a (Mittenpanelen) visar lokaliseringen av p24 i tre oberoende villkor: i avsaknad av en inducerare, i närvaro av en inducerare (Phorbol 12-myristate 13-acetat; PMA), och i närvaro av PMA och antiretroviral kombinationsbehandling (cART), standardbehandling för HIV-1. Dessa data indikerar att HIV-1-viruset är lokaliserad till fraktion 16,8 mätt med närvaron av p24 och dess uncleaved polyprotein Pr55. Dessutom, när celler utsätts för cART, vilket inkluderar indinavir, en proteashämmare som förhindrar klyvning av Pr55 till p24, ingen p24 upptäcktes i någon fraktion. I stället upptäcktes endast Pr55 och var närvarande i fraktioner 16,8-18,0, vilket indikerar en förskjutning av viruset till tätare fraktioner. Liknande resultat erhölls med primära makrofager (nedre panelen). Även om det beskrivna protokollet resulterar i Co-sedimentation av EXO #2 och EXO #3 populationer med virus, EXO #1 befolkningen (fraktioner 10.8-12.0) förblev fritt från virus, vilket möjliggör nedströms analyser fria från viruskontaminering.
Denna typ av separation av virus bort från EVs tillåter oss att ta itu med möjligheten att bitar av virus in EVs eller utsöndras från infekterade celler som fritt protein. Resultat i figur 3b indikerar att hiv-1 NEF-protein kan hittas i exo #1 populationen utöver EXO #2-och EXO #3-populationerna. NEF förekommer också i 6,0 fraktionen, vilket indikerar att NEF kan potentiellt utsöndras från infekterade celler som ett fritt protein och inom en EV. Dessutom, HIV-1 VPR protein finns i 6,0 fraktionen medan HIV-1 tat protein är huvudsakligen återfinns i 6,0 fraktionen, men också förekommer i fraktioner 7.2-9.6. Vi testar för närvarande alla fraktioner för förekomst av TAT-protein av ELISA. Dessa resultat indikerar att både tat och VPR kan utsöndras från infekterade celler, sannolikt som fria proteiner, medan tat också kan införlivas i EVs. Kollektivt, dessa uppgifter tyder på att vår metod för EV isolering kan framgångsrikt isolera undanflykt (EXO #1) bort från hiv-1 virioner (EXO #2 och #3) och att EVS från hiv-1-infekterade celler innehåller vissa hiv-1-proteiner, som kan påverka hiv-1 patogenes.
Karakterisering av EVs och separation av EVs bort från andra virus
För att tillämpa detta protokoll på andra virus infektions modeller har vi karakteriserat vesikler från celler infekterade med flera olika virus. Figur 3c visar en illustration av tidigare erhållna vesikler och virus fördelningar efter nederbörd, separation och berikning enligt det beskrivna protokollet. Som tidigare visats i figur 3aförekommer EXOSOMER (CD9+CD63+CD81+) i tre olika populationer (EXO #1, fraktioner 10.8-12.0; EXO #2, fraktioner 15,6-16,8, och EXO # 3, 18,0 fraktion) och HIV-1-virus lokaliserar till den högre densiteten 16,8 och 18,0 fraktioner (Lanes 10-11). Inte överraskande, vid tillämpningen av detta protokoll för att karakterisera EVs släpptes från Human T-lymfotropic virus typ 1 (HTLV-1), ett retrovirus som är känt för att orsaka cancer hos vuxna, vi observerade resultat liknande den för HIV-1-relaterade EVs. Den tredje panelen i Fig. 3c visar att HTLV-1-viruset i första hand lokaliserades till den högsta densitetsfraktionen (18,0) och, i mindre utsträckning, fraktioner 13.2-16,8, vilket framgår av närvaron av HTLV-1 Matrix protein (P19). Dessutom har vi tidigare funnit att HTLV-1 transaktiverande protein, skatt, som är frånvarande från HTLV-1 Virion, är närvarande inom undanflykt frigörs från HTLV-1 infekterade celler15,23. Uppgifterna i diagram 3c visar att skatten var närvarande i de lägre densitetsfraktionerna (6,0-12,0), varav två har visat sig innehålla undanflykt (10,8 och 12,0).
Därefter testade vi isolerings protokollet i samband med större och mindre virus som Ebola-virus (EBOV) och zikavirus (ZIKV), respektive, eftersom HIV-1 och HTLV-1-virionerna är både retrovirus och mycket likartade i diameter. Använda VLP som en surrogat biosäkerhet nivå 2 (BSL-2) modell av ebov församling och utgång, fann vi att VLP, som är cirka 1 μm i längd, lokaliserar till den högsta densiteten fraktion (18,0) i avsaknad av 0,22 μm filtrering (mellersta panelen, figur 3c). Dessutom, när VP40, ebov Matrix protein, uttrycks på höga halter, utsöndras det från cellen genom flera olika mekanismer som resulterar i närvaron av VP40 i varje densitet fraktion, inklusive de som undanflykt är lokaliserade13 , 14. i motsats, zikv virioner är betydligt mindre än hiv-1 virioner, mäter cirka 40 Nm i diameter. Det representativa diagrammet i bottenpanelen i figur 3c visar närvaron av zikv virioner i både låg densitet (6.0-8.4) och hög densitet (15,6-18,0) fraktioner, vilket tyder på närvaron av både fria virus och ev-inkapslat virus, respektive.
Figur 1: Byggandet av en iodixanol densitet gradient. A) relativa mängder av iodixanol och PBS som används för att skapa varje densitet fraktion (bråk #). Bråk # betecknar den procentuella andelen iodixanol som ingår i varje bråk. Deras relativa densiteter och placering i gradienten avbildas från tyngsta till ljusast. (B) placeringen av densitetsfraktionerna (6.0-18) i första röret visas (vänster sida) samt placeringen av de tre EV populationer (EXO #1, EXO #2, EXO #3), EXO-liknande blåsor, och proteinkomplex. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: pinnutfällning reagens ökar EV avkastning. (A) för att jämföra EV återhämtning, var EVS isolerade från 5 d hiv-1-infekterade monocyt (U1) kultur supernatanten (10 ml) med hjälp av traditionell ultracentrifugering (100 000 x g) eller PEG nederbörd reagens (inkubation vid en 1:1 ratio). EVs från båda anriknings procedurerna analyserades med hjälp av nanotracking analys för att bedöma resulterande EV koncentration som beskrivs i DeMarino, et al.6. NTA mättes vid 11 oberoende positioner i tekniska tre exemplar. De blå staplarna representerar ett genomsnitt av 33 mätningar ± SD-statistisk signifikans fastställdes med hjälp av en tvåsidiga Students t-test; p < 0,001. B. EVS från 5-dagars CEM kultur supernatanten med antingen ultracentrifugering (UC) eller PEG nederbörd följt av iodixanol densitet separation. Ultracentrifugation utfördes med 100 mL kultur supernatanten (Lane 1) medan PEG nederbörd och efterföljande iodixanol fraktionering utfördes med 10 mL av kulturen supernatanten (Lane 2). Den totala EV-pelleten som erhållits från ultracentrifugering och 10,8-fraktionen från separation med PEG/iodixanol analyserades av Western blot för förekomst av exosomal markör proteiner (CD81, CD63 och CD9) med Actin som kontroll. För tydlighetens skull visas valda banor från samma blot med identiska exponeringar i panel B. Denna siffra har modifierats från DeMarino, et al.6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: isolering av EVs bort från virus. A) fem dagars kultursupernatanter från icke-infekterade CEM-celler (övre panelen), hiv-1 (ba-L; MOI: 0,01) infekterade U1-celler (± PMA och ± cART behandling, mitten panelen) eller HIV-1 infekterade primära makrofager (nedre panelen) inkuberades med PEG nederbörd reagens vid 4 ° c över natten. EVs separerades i bråk med en iodixanol densitet gradient. EVs från alla fraktioner berikades med NT80/82 partiklar över natten vid 4 ° c. CEM nanopellets analyserades med hjälp av Western blot för förekomst av exosomal markör proteiner CD81, CD63 och CD9. U1 (± PMA-och ± cART-behandling) och hiv-1-infekterade primära makrofager analyserades för förekomst av hiv-1-gag-protein (p24 och Pr55; klyvs och uncleaved hiv-1 gag polyprotein, respektive), samt CD63. Blots var sonderade för aktin som en kontroll. Sann exosome populationer (CD81+CD63+CD9+) beskrivs i rött. Denna siffra har modifierats från DeMarino, et al.6 (B) femdagars kultur samman supernatanterna från infekterade U1-celler inkuberades med PEG nederbörd reagens vid 4 ° c över natten. EVs separerades i bråk med en iodixanol densitet gradient. EVs från alla fraktioner berikades med NT80/82 partiklar över natten vid 4 ° c. Fraktioner kördes på en västerländsk blot för förekomst av HIV-1 NEF, VPR, och TAT. Actin användes som kontroll. Sann exosome populationer (CD81+CD63+CD9+) beskrivs i rött som tidigare definierats i DeMarino, et al.6 (C) representativ illustration av tidigare karakteriserade EV separations profiler från fyra olika virus: HIV-1, HTLV-1, EBOV, och ZIKV. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: protokoll arbetsflöde. Det nya arbetsflödet kombinerar flera tekniker inklusive filtrering, EV nederbörd med hjälp av PEG nederbörd reagens, iodixanol densitet gradient separation och nanopartikel anrikning av EVs. Utnyttjandet av detta protokoll separerar EVs från olika virus och ger ett litet volym prov för nedströms analyser inklusive qPCR, Western blot, masspektrometri, RNA-sekvensering, cytokinanalys, ELISA och cellbaserade analyser. Denna siffra har modifierats från DeMarino, et al.6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den skisserat metod Tillåt för ökat EV avkastning och separationen av virus från EVs användande en kombination närma sig till isolering. Relativt stora mängder utgångsmaterial (dvs. cell supernatant) kan filtreras före EV-isolering genom nederbörd, DG separation och nanopartikelberikning, vilket resulterar i en slutlig volym på ~ 30 μL, vilket möjliggör omedelbar användning i en mängd nedströms analyser. Användningen av nanopartikelberikning är nödvändig eftersom, jämfört med traditionell ultracentrifugation, dessa EV-berikande nanopartiklar har visat sig fånga vesikler mer effektivt, vilket ger en större än eller lika stor mängd blåsor från 1 mL kultur supernatanten jämfört med 10 mL ultracentrifuged kultur supernatanten15. Sammantaget innehåller det beskrivna protokollet kombinationen av flera välkända tekniker och bör därför medföra begränsade svårigheter. Men införlivandet av EV-berikande nanopartiklar introducerar en ny teknik som kan kräva felsökning och/eller modifieringar för att uppnå önskvärda resultat beroende på nedströms analys eller biologiskt mål av intresse. Vi rekommenderar att nanopartiklar inkuberas med filtrerade cellkulturer samman supernatanterna över natten. Om målet protein eller RNA av intresse är av låg förekomst i modell systemet, kan protokollet anpassas för att öka inkubationstiden för att säkerställa fångst av målet. Utnyttjandet av nanopartiklar i nedströms analyser kan vanligtvis åstadkommas genom att omlägga pelleten i önskad provbuffert för varje analys. Till exempel kan nanopartiklar återsuspenderas direkt i Laemmli buffert för Western blot-analys. Det fångade materialet bör sedan mer effektivt elueras från nanopartiklar i SDS via uppvärmning och vortexa cykler. För att uppnå tillräcklig separation av protein bör försiktighet iakttas för att begränsa mängden nanopartiklar som lastas in i gelen, och gelen bör köras vid cirka 100 V för att säkerställa att eventuella kvarvarande partiklar finns i brunnarna. För visualisering av proteiner med låg molekylvikt uppnår dessutom en våt överföring över natten optimala resultat. Även om användningen av nanopartiklar resulterar i betydande anrikning av vesikelpopulationer, måste ytterligare åtgärder vidtas för att eluera fångade material från partiklarna. Dessutom kan eluering av materialet potentiellt begränsa nyttan av EVs i nedströms funktionella analyser, eftersom många elutionsbuffertar kan skada EV-membranets integritet. Ytterligare forskning behövs för att konstruera en strategi för att möjliggöra avlägsnande av intakt blåsor från nanopartiklar efter inkubering. En annan nackdel med dessa partiklar är den nuvarande bristen på karakterisering. Partikelns yttre skal har utformats för att utesluta molekyler med hög molekylvikt. Specifik inriktning av partiklarna till EVs sker dock inte, och därför kan många störande faktorer och bakgrunds signaler potentiellt förekomma i nedströms analyser.
Den beskrivna metoden ska i första hand användas för laboratorieändamål. Vi har nyligen utvecklat alternativa metoder för att utöka möjligheterna i vår kombinations metod till ytterligare tekniker för att isolera EVs från småskaliga, tålmodiga biofluider som plasma och CSF och storskalig, kommersiell EV-produktion. För isolering av EVs bort från virus i patientmaterial vi har införlivat användningen av storlek uteslutning kromatografi (SEC) kolumner, som utnyttjas i stället för en densitet gradient. Dessa kolumner är fördelaktigt i att de är disponibla och därför är idealiska i hög inneslutning laboratorier. Men, SEC kolumner separata partiklar beroende på storlek, därför Härav följer att denna typ av separation är endast tillämplig för separation av stora eller mycket små virus, såsom EBOV (~ 1 μm) eller ZIKV (~ 40 Nm), respektive, från EVs eller separation bort från fritt protein. När det gäller storskalig EV-produktion har de senaste framstegen inom filtreringsbaserade metoder, nämligen tangentiell flödes filtrering (TFF), tillåtit en effektiv isolering av EVs från stora provvolymer. TFF har historiskt använts för rening av nanosized biomolekyler, inklusive virus, och genom optimering av protokoll detta system har framgångsrikt anpassats för isolering av EVS24,25. Kort, under TFF-processen, prov vätskeflöden tangentiellt över ytan av ett semi-permeabla membran som selektivt behåller blåsor baserat på storlek och molekylvikt, vilket möjliggör separation av EVs bort från fria proteiner och andra kontaminerande biomolekyler26. Jämfört med ultracentrifugation, det har rapporterats att TFF resulterar i högre avkastning, mindre aggregering, och minskar parti-till-Lot variation av EVs27. Dessutom har användningen av TFF för god tillverkningssed (GMP)-grad isolering av EVs för terapeutisk tillämpning också rapporterats28. Tack vare sin skalbarhet och reproducerbarhet erbjuder denna teknik stor potential för framtida EV-forskning.
Virus finns i olika storlekar och tätheter, därför beroende på viruset i fråga, optimering av detta protokoll kan krävas. För mycket stora virus som ebola (~ 1 μm eller större i längd), enkel filtrering kan utnyttjas för att ta bort de allra flesta virioner och stora kontaminerande organ såsom VLPs och apoptotiska organ14. Detta gör det möjligt för de flesta av separation av virus bort från EVs att vara körbara på den främre änden av rening. Emellertid, i fallet med mindre virus såsom enterovirus (~ 30 Nm), zika virus (~ 40 Nm), hepatit B-virus (~ 42 nm), hepatit C-virus (~ 55 nm), och andra, den fraktion där virioner sediment kommer att behöva bestämmas innan ytterligare nedströms funktionella Analyser. Man kan inte alltid approximera den sannolika fraktionen av sedimentering baserad på enbart partikeldiameter. Till exempel, poliovirus, som är 30 Nm i diameter, är också känt för att vara inkapslat i sekretoriska autofagi29,30,31,32,33, och därför är sannolikt att hittas på den högra sidan av övertoningen (tätare fraktioner) i stället för vänster (mindre täta fraktioner). Även om vi har optimerat detta protokoll i fallet med HIV-1, HTLV-1, och EBOV VLPs, ytterligare virus kommer att behöva karakterisering för att finjustera protokollet för deras specifika rening bort från EVs.
Det protokoll som beskrivs här (figur 4) tillåter för första gången användaren att separera EVS från virus med förbättrad effektivitet och mindre volymer av utgångsmaterial jämfört med den gyllene standarden för EV-isolering, ultracentrifugation. Denna metod kan lätt anpassas till de villkor till hands inklusive varierande urvalsstorlekar, krävs avkastning, startmaterial typ (dvs, kultur supernatanten kontra patientmaterial), och olika olika virus i olika storlekar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
F.L. är anslutet till Ceres Nanosciences Inc. som producerar reagenser och/eller instrument som används i denna artikel. Alla andra författare deklarerar inga potentiella intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi skulle vilja tacka alla medlemmar i Kashanchi Lab, särskilt Gwen Cox. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, och NS099029 till F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
