Summary
Bu protokol, ev çökeltme, yoğunluk gradyan ultracentrifugation ve parçacık yakalama birleştirerek yüksek verimlilik ve verim ile virions uzak hücre dışı veziküller (EVs) izole aerodinamik bir iş akışı ve başlangıç bir azalma sağlamak için tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere tekrarlanabilir preparatlar ile sonuçlanan hacim gereksinimleri.
Abstract
Bir ekstrasellüler vezikül alanında önemli engellerden biri (EV) araştırma bugün viral bir enfeksiyon ortamında saflaştırılmış EV preparatları elde etmek için yeteneğidir. Sunulan yöntem, evleri virions'lardan (yani HIV-1) izole etmek ve geleneksel ultrasantrifüj yöntemlerine göre daha yüksek verimlilik ve verim sağlamak için tasarlanmıştır. Protokolümüz üç adımdan oluşur: EV çökeltme, yoğunluk gradyan ayırma ve parçacık yakalama. Downstream tahlilleri (yani, Western blot ve PCR) parçacık yakalama dan sonra doğrudan çalıştırılabilir. Bu yöntem, minimum başlangıç hacimlerinin kullanımına izin verdiği için diğer yalıtım yöntemlerine (örn. ultracentrifugation) göre avantajlıdır. Ayrıca, birden fazla ultrasantrifüj adımı gerektiren alternatif EV yalıtım yöntemlerinden daha kullanıcı dostudur. Ancak, sunulan yöntem bizim parçacıklardan bozulmamış EVs eute zor olduğu gibi fonksiyonel EV tahlilleri kapsamında sınırlıdır. Ayrıca, bu yöntem kesinlikle araştırma tabanlı bir ortama göre uyarlanmıştır ve ticari açıdan uygun olmayacaktır.
Introduction
Araştırma ekstrasellüler veziküller etrafında merkezli (EVs), özellikle ekzozomlar, 30-120 nm arasında değişen ve üç tetraspanin belirteçleri CD81, CD9 ve CD63 varlığı ile karakterize EV türü, büyük ölçüde izole etmek ve yöntemlerinin geliştirilmesi ile şekillenmiştir ilgi vezikülleri arındırmak. Çok yönlü mekanizmaları inceleme yeteneği, çok çeşitli içeriklere, boyutlara ve farklı yollardan üretilen heterojen vezikül popülasyonundan oluşan örnekler üreten karmaşık ve zaman alıcı teknikler nedeniyle engellenmiştir. Yoğun -luğunu. Bu hemen hemen tüm EV araştırma için bir sorun olmakla birlikte, virions ve virüs benzeri parçacıklar (VLPs) ilgi vezikülleri çapı benzer olabilir gibi, viral enfeksiyon bağlamında EVs incelerken özellikle önemlidir. Örneğin, İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) yaklaşık 100 nm çapında, kabaca evs birçok türde aynı boyuttadır. Bu nedenle, bu sorunları gidermek için yeni bir EV yalıtım iş akışı tasarladık.
EV izolasyonunun mevcut altın standardı ultrasantrifüjdür. Bu teknik çeşitli vezikül yoğunlukları kullanır, hangi veziküller her aşamada daha düşük yoğunluklu parçacıklar karşı yüksek yoğunluklu parçacıkların diferansiyel sedimantasyon ile santrifüj ile ayrılmasını sağlar 1,2. Bozulmamış hücreleri (10 dk için 300-400 x g), hücre enkazı (10 dk için~2.000 x g) ve apoptotik cisimler/büyük vezikülleri (10 dk için~10.000 x g) kaldırmak için birkaç düşük hızlı santrifüj adımı gereklidir. Bu ilk arıtmalar yüksek hızlı ultracentrifugation (100.000-200.000 x g 1.5-2 h) tortu EVs tarafından takip edilir. Yıkama adımları daha fazla EV saflık sağlamak için yapılır, ancak, izole EVs sayısının azaltılması bu sonuç, böylece toplam verim düşürücü 3,4. Bu yöntemin yardımcı programı, yeterli sonuçlar elde etmek için çok sayıda hücre (yaklaşık 1 x 108)ve büyük bir numune hacmi (> 100 mL) gereksinimi ile daha da sınırlıdır.
Artan endişeleri gidermek için, hidrofilik polimerler ile veziküllerin yağış son yıllarda yararlı bir teknik haline gelmiştir. Polietilen glikol (PEG) veya diğer ilgili çökeltme reaktifleri, kullanıcının numune içindeki vezikülleri, virüsleri ve protein-RNA agregalarını sadece tercih edilen reaktifle kuluçkaya yatırarak ve ardından tek bir düşük hız agregasını aşağı çekmesine olanak tanır. santrifüj1,2,5. Daha önce peg veya ilgili yöntemlerin kullanımı nın geleneksel ultrasantrifüj sonuçlarına kıyasla EV'leri çökertmek için önemli ölçüde daha yüksekverim6 olduğunu bildirmiştik. Bu strateji hızlı, kolay, ek pahalı ekipman gerektirmez, kolayca ölçeklenebilir ve EV yapısını korur. Ancak, bu yöntemin promiscuous doğası nedeniyle, ortaya çıkan örnekler serbest proteinler, protein kompleksleri, EV'ler bir dizi ve böylece istenilen popülasyon elde etmek için daha fazla saflaştırma gerektiren virions dahil olmak üzere çeşitli ürünler içerir1 ,2,7,8.
Çeşitli yağış yöntemlerinden elde edilen EVs heterojenliği aşmak için, yoğunluk gradyan ultracentrifugation (DG) yoğunluğuna göre parçacıkları daha iyi ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, iodixanol veya sakaroz gibi, eVs'lerin proteinlerden, protein komplekslerinden ve virüs veya virüs benzeri parçacıklardan (VLP) ayrılmasına olanak tanıyan bir yoğunluk gradyan ortamı kullanılarak adım adım gradyan kullanılarak gerçekleştirilir. Bir zamanlar DG'nin EV alt popülasyonlarının daha kesin ayrılmasına izin verdiği düşünülse de, çeşitli veziküllerin boyutlarının ve yoğunluklarının örtüştüğü bilinmektedir. Örneğin, ekzozomların yüzdürme yoğunlukları 1.08-1.22 g/mL9olarak bilinirken, Golgi'den izole edilen veziküllerinyoğunluğu 1.05-1.1.12 g/mL ve endoplazmik retikulum (COPII+ ) 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9de tortu . Ayrıca, eğer bir viral parçacıklar içeren fraksiyonları karşı ekzozomal kesirler karşılaştırmak için arzu, bu ilgi virüsün yoğunluğuna bağlı olarak daha zor olabilir-hiv-1 dışında virüsler var ki büyük olasılıkla aynı dengelemek ekzozomal pozitif kesirler2 olarak yoğunlukları .
Son olarak, downstream görselleştirme ve fonksiyonel tahliller için EV preps zenginleştirme EV araştırma için hayati önem taşımaktadır. EV zenginleştirici nano tanecikleri kullanımı, özellikle, çapı 700-800 nm aralığında çok fonksiyonlu hidrojel parçacıkları, konsantre EV preps ulaşmada kritik bir adımdır. Onlar seçicilik teşvik etmek için gözenekli bir dış sieving kabuk tarafından kapsüllenmiş yüksek bir affinity aromatik yem sahip. Bu çalışmada kullanılan nano partiküller farklı çekirdek yemleri (Reaktif Kırmızı 120 NT80; ve Cibacron Mavi F3GA NT82) çeşitli reaktifler ve biyoakışçılar DAN EVs yakalama artırmak için göstermiştir iki farklı preparatlar içerir (Malzemeler Tablosu bakınız )6,10,11,12,13,14,15. Parçacıklar iodixanol fraksiyonları, hücre kültürü supernatant yanı sıra plazma, serum, serebral spinal sıvılar (BOS) veidrar6 gibi hasta biyosıvıları da dahil olmak üzere çok sayıda başlangıç malzemelerinden EVs kolay zenginleştirme sunuyoruz,13 .
Burada sunulan yöntem çeşitli teknolojileri birleştirerek mevcut EV arıtma tekniklerinin verimliliğini artırır; EV yağış, yoğunluk gradyan ultracentrifugation, ve parçacık yakalama, iş akışını kolaylaştırmak için, örnek gereksinimlerini azaltmak, ve tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere daha homojen bir EV örnek elde etmek için verimi artırmak. Bu yöntem, büyük, istenmeyen vezikülleri ve VLP'leri dışlamak için 0,22 μm filtrasyon adımı içerdiğinden ve toplam EV popülasyonunun yoğunluğuna göre etkin bir şekilde ayrılmasını içerdiğinden, bu yöntem viral enfeksiyon sırasında evlerin ve içeriğinin araştırılmasında özellikle yararlıdır. EVs'leri virions'tan izole edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekstrasellüler Veziküllerin Filtrasyonu ve Çökeltisi (EVs)
- Enfekte veya transfekte hücrelerden (örn. hücre hatları ve/veya birincil hücreler) kültür supernatant hazırlamak için, kültür yaklaşık 10 mL geç günlük hücreleri 5 gün boyunca 37 °C ve 5% CO2 uygun kültür ortamı (yani, RPMI veya DMEM ile% 10 fetal sığır serum [FBS]).
NOT: Tüm kültür orta reaktifleri EVs'siz olmalı ve 90 dk için 100.000 x g'da serumun önceden ultrasantrifüjasyonu ile satın alınabilir (Bkz. Malzeme Tablosu)veya şirket içinde hazırlanabilir. Bu protokol, CEM, Jurkat, 293T, U937 (enfekte olmayan hatlar), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 ve HTLV-1 enfekte hatları), birden fazla transfected hücre ve primer miyeloid ve T hücreleri (her ikisi de dahil olmak üzere birçok yaygın olarak kullanılan hücre hatları için başarılı olmuştur enfekte ve enfekte olmayan); ancak, bu protokol, özel ortam veya kültür koşulları gerektirenler de dahil olmak üzere herhangi bir hücre türü için kullanılabilir. Hücrelerin yoğunluğu farklı hücre türleri için optimize edilmesi gerekebilir. En yüksek yoğunluğun 5 gün sonra en az hücre ölümü ile kullanılması önerilir. - 3.000 x g'de kültürü 5 dk boyunca pelet hücrelerine santrifüj edin ve peletatın.
- Steril 0,22 μm filtre kullanarak kültür supernatant filtre ve temiz bir tüp içinde filtrat toplamak.
- Filtrelenmiş supernatant'a eşit hacimli PEG çökeltisi (1:1 oranı) ekleyin. Homojen bir karışım sağlamak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
NOT: GIRdap YAPMAYIN. - Gece leme (O/N) 4 °C'de kuluçka karışımı.
- Merkezci karışım 1.500 x g oda sıcaklığında 30 dakika (RT) heterojen bir EV pelet verim.
NOT: EV pelet beyaz veya off-beyaz renkli görünmelidir. - EV-tükenmiş kültür supernatant atın.
- 150-300 μL 1x fosfat tamponlu tuzlu kalsiyum ve magnezyum olmadan EV pelet resuspend ve buz üzerinde tutmak.
2. Yoğunluk Gradyanı nın Yapımı
- Şekil 1A'dagösterildiği gibi ayrı mikrosentrifuge tüplerde %1,2'lik artışlarda 11 farklı 1 mL yoğunluk fraksiyonu oluşturmak için 1x PBS ile iodixanol yoğunluk gradyan ortamını karıştırın.
- Girdap her tüp karıştırmak için.
- Katman yoğunluğu fraksiyonları önceden temizlenmiş ve kuru sallanan kova ultracentrifuge tüp içine kesir #18 başlayan ve şekil 1B'debelirtildiği gibi kesir #6 ile biten .
NOT: Tüm tüpler% 10 çamaşır suyu spreyi ile dezenfekte su ile 3x durulama ve degrade kesirler yüklemeden önce steril deiyonize su son bir yıkama ile takip dezenfekte edilmelidir. - Ultracentrifuge tüpündeki katmanlı degradenin üst kısmına yeniden askıda EV peleti (300 μL) ekleyin.
- Ultracentrifuge 100,00 x g 4 °C'de 90 dk.
- Ultracentrifuge tüpünden 1 mL fraksiyonu dikkatlice çıkarın ve her bir fraksiyonu yeni mikrosantrifüj tüplere aktarın.
3. EV Fraksiyonlarının Zenginleşmesi uUsing Nano tanecikleri
- Eşit hacimlerde NT80, NT82 ve 1x PBS kullanarak nano partiküllerin %30'luk bir bulamaç oluşturun.
NOT: Karışım homojenliği sağlamak için kullanılmadan önce girdap olmalıdır. - Yoğunluk fraksiyonları ve pipet içeren her mikrocentrifuge tüpe bulamaç 30 μL ekleyin / karıştırmak için birkaç kez ters.
- EV zenginleştirici nanopartikül içeren yoğunluk fraksiyonu mikrosantrifüj tüpleri O/N'yi 4 °C'de yaklaşık 20 rpm'de döndürün.
- Sentrifüj yoğunluk fraksiyonu mikrosantrifüj tüpler 20.000 x g 5 dk RT için.
- Sıvıyı atın ve EV peletini 1x PBS ile iki kez yıkayın.
NOT: Nanopartikül peletler -20 °C'de dondurulabilir veya hemen çeşitli downstream tahlilleri (pcr, western blot, kütle spektrometresi ve diğer tahliller) için kullanılabilir.
4. Downstream Tahliller için Nanopartikül Pelet Önerilen Hazırlanması
-
RNA yalıtımı için
- 0,2 μm filtreden filtrelenmiş %0,001 dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılan 50 μL'lik otoklavlı deiyonize sudaki peleti yeniden askıya alın ve kit üreticisinin protokolüne göre RNA'yı izole edin.
-
Jel elektroforez için
- Laemmli tampon 15 μL doğrudan pelet resuspend.
- Isı numunesi 35 °C'de 3 dk. Girdap yavaşça ve her ısı döngüsü arasında aşağı doğru döner.
- 20.000 x g'de 15 s için santrifüj numune stoğu ve doğrudan jel üzerine tüm eluted malzeme yükleyin.
NOT: En iyi sonuçlar için jelüzerine yüklenen partikülmiktarını sınırlayın ve kalan parçacıkların kuyulara içerdiğinden emin olmak için jeli 100 V'da çalıştırın.
-
Tripsin sindirimi için
- Alkillenme den önce üre 20 μL pelet resuspend ve örnek tripsinizasyon. Nano partiküller 10 dk. Triptotlu peptid içeren numune 14.000 x g santrifüj ile temiz bir toplama tüpüne aktarılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PEG yağış EV verimi artar
EV izolasyonuna yönelik kombinasyon yaklaşımımız, gerekli başlangıç malzemesi hacmindeki %90 azalmadan da anlaşılarak, ev geri kazanımı açısından geleneksel ultrasantrifüje kıyasla önemli ölçüde daha etkilidir. EV izolasyonunda mevcut altın standart olan ultracentrifugation, aşağı akım tahlilleri için yeterli bir EV hazırlığı üretmek için yaklaşık 100 mL kültür gerektirir, oysa yeni protokolümüz sadece 10 mL gerektirir. Bu azalma, nanotracking analizi (NTA) ile ölçülen EV veriminde önemli bir artış sağlayan PEG EV yağış reaktifinin kullanılması yla mümkün olur. Şekil 2A'daelde edilen sonuçlar , daha önce6olarak yayınlanmıştır , 10 mL kültür süpernatant PEG yağış kullanırken 7,27 x 1010 EV'lerin geri kazanılmasıyla sonuçlandığını göstermektedir, bu da sayıdan yaklaşık 500 kat daha fazladır. ultracentrifugation (1,45 x 108)kullanılarak aynı başlangıç malzemesi nden kurtarılan EVs. Ekzozomların izolasyonunun arttırılmış verimi, spesifik bir EV alt tipi, iyi karakterize ekzozom belirteç proteinleri, CD81, CD63 ve CD9 düzeylerinde artış ile belirgin olarak gözlenmiştir. PEG çökeltme reaktifi kullanılarak ultrasantrifüj veya EV çökeltmeden üretilen EV preparatlarını karşılaştıran batı leke analizi Şekil 2B'degösterilmiştir. Bu sonuçlar CD81'de 3.000 kat, CD63'te 4 kat artış ve densitometri analizi ile ölçülen CD9'da 40 kat artış göstermektedir. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar özetlenen protokol sadece toplam EV verimi artırır ama aynı zamanda ultracentrifugation ile karşılaştırıldığında ekzozomların kurtarma artırır öneririz.
EVs karakterizasyonu ve EVs uzak HIV-1 virüsü nden ayrılması
Nanopartikül zenginleştirmeden sonra her fraksiyonda bulunan vezikülleri karakterize etmek için, EVs, özetlenen protokol kullanılarak enfekte olmamış CEM veya HIV-1 enfekte U1 hücre kültüründen izole edilmiş ve her birinin batı lekesi kullanılarak karakterize edilmiştir. nanopartikül zenginleştirilmiş iodixanol fraksiyonu. Şekil 3A'daki veriler, her bir kesirde (CEM hücreleri; üst panel) üç ekzozomal tetraspaninin (CD81, CD63 ve CD9) varlığını veya yokluğunu gösteren daha önce yayınlanmış sonuçlarımızı göstermektedir. Sonuçlar, fraksiyon içinde her üç tetraspaninvarlığı ile tanımlanan ekzozomlar, üç ayrı popülasyonda bulunur: 10.8-12.0 kesirleri içeren Exo #1, kesirler içeren Exo #2 15.6-16.8 ve Exo #3 içerir sadece 18.0 kesir. Üç farklı popülasyonun varlığına rağmen, protokol her bir fraksiyonda ek ev türlerinin bulunma olasılığını göz ardı edemez. Ayrıca, bu sonuçlar test edilmiş tetraspanin belirteçlerinin bir kombinasyonu için pozitif olan bu popülasyonlarda veziküller olma olasılığını kesin olarak dışlamaz. Bu EVs daha sonra ek arıtma stratejileri ile daha da ayrılabilir.
EV/ ekzozom araştırmahızla gelişen alan onların keşfinden bu yana patladı ve birçok yeni fonksiyonlar ve bu veziküller için uygulamalar sonuçlandı. Özellikle, sadece normal fizyolojide değil, aynı zamanda hastalıkta hücre içi haberci ler olarak rolleri, hücre dışı veziküllerin, özellikle ekzozomların alıcı hücreler üzerindeki etkilerini ve yararlarını incelemek için önemli kaynakların kullanılmasına yol açmıştır16 , 17.000 , 18. Çok sayıda çalışma HIV-16,10,12,19,20,21 dahil olmak üzere çeşitli enfeksiyonların patogenezinde EV'leri etkilemışlardır. , 22- Ancak, EV'ler ve virions arasındaki boyut benzerliği bu EV aracılı mekanizmaların tanımlanmasında potansiyel bir engel teşkil etmektedir. Bu endişeyi gidermek için, ev popülasyonlarını virilerden etkili bir şekilde ayırmak için bir yoğunluk gradyanı uygulamak için protokolümüzü tasarladık. Bu amaçla, HIV-1 enfekte hücrelerden süpernatant hücre kültürü sunulan protokole tabi tutuldu ve hiv-1 Gag p24 varlığı için batı leke tarafından analiz hangi fraksiyonveya fraksiyonları HIV-1 virions içerdiğini belirlemek için. Şekil 3A'da (orta panel) gösterilen sonuçlar p24'ün üç bağımsız koşulda lokalizasyonunu gösterir: bir indükleyicinin yokluğunda, bir indükleyici nin varlığında (Phorbol 12-myristate 13-asetat; PMA), ve PMA ve kombinasyon antiretroviral tedavi varlığında (cART), HIV-1 için standart tedavi. Bu veriler, HIV-1 virüsünün p24 ve amcası adak poliprotein Pr55 varlığı ile ölçülen 16.8 kesir lokalize olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hücreler Pr55 ile p24 arasında bölünmeyi önleyen bir proteaz inhibitörü olan Indinavir'i içeren cART'a maruz kaldığında herhangi bir fraksiyonda p24 saptanmadı. Bunun yerine, sadece Pr55 tespit edildi ve 16.8-18.0 kesirler mevcuttu, daha yoğun kesirler içine virüs bir kayma gösteren. Benzer sonuçlar primer makrofajlar (alt panel) kullanılarak elde edilmiştir. Açıklanan protokol, Exo #2 ve Exo #3 popülasyonlarının virüsle birlikte sedimantasyonuyla sonuçlansa da, Exo #1 popülasyonu (fraksiyonları 10.8-12.0) virüssüz kalarak virüs kontaminasyonundan arınmış aşağı akım tahlillerine olanak sağladı.
Virüsün EVs'den bu şekilde ayrılması, virüs parçalarının EVs'e girme veya enfekte hücrelerden serbest protein olarak salgılanma olasılığını ele almamızı sağlar. Şekil 3B'deki sonuçlar, Exo #2 ve Exo #3 popülasyonlarına ek olarak EXo #1 popülasyonunda HIV-1 Nef proteininin bulunabildiği ortaya konabilir. Nef de 6.0 fraksiyonu görünür, Nef potansiyel olarak serbest protein olarak enfekte hücrelerden salgılanan olabilir ve bir EV içinde gösteren. Ayrıca, HIV-1 Vpr proteini 6.0 fraksiyonunda bulunurken, HIV-1 Tat proteini ağırlıklı olarak 6.0 fraksiyonunda bulunur, ancak 7.2-9.6 kesirlerinde de görünür. Şu anda ELISA tarafından Tat proteinvarlığı için tüm fraksiyonları test ediyoruz. Bu sonuçlar hem Tat hem de Vpr'nin enfekte hücrelerden salgılanabileceğini göstermektedir, muhtemelen serbest protein ler olarak, Tat ise EVs'e dahil edilebilir. Bu veriler, EV izolasyon yöntemimizin ekzozomları (Exo #1) HIV-1 virions (Exo #2 ve #3) uzak bir şekilde izole edebileceğini ve HIV-1-enfekte hücrelerden gelen EV'lerin HIV-1 patogenezi etkileyebilecek bazı HIV-1 proteinleri içerdiğini göstermektedir.
EVs karakterizasyonu ve EVs diğer virüslerden uzak ayrılması
Bu protokolü diğer viral enfeksiyon modellerine uygulamak için, birkaç farklı virüs ile enfekte hücrelerden veziküller karakterize var. Şekil 3C, açıklanan protokole göre yağış, ayırma ve zenginleştirme sonrasında daha önce elde edilen vezikül ve virüs dağılımlarının bir örneğini göstermektedir. Şekil 3A'dadaha önce gösterildiği gibi, ekzozomlar (CD9+CD63+CD81+) üç farklı popülasyonda bulunur (Exo #1, kesirler 10.8-12.0; Exo #2, kesirler 15.6-16.8 ve Exo #3, 18.0 fraksiyonu) ve HIV-1 virüsü daha yüksek yoğunlukta 16.8 ve 18.0 fraksiyonları (şerit 10-11) lokalize. Beklendiği gibi, Bu protokolü, erişkinlerde kansere neden olduğu bilinen bir retrovirüs olan Human T-lenfotropic virus Type 1 (HTLV-1) salınan EVs karakterize etmek için uygularken, HIV-1 ile ilgili EVs benzer sonuçlar gözlendi. Şekil 3C'deki üçüncü panel, HTLV-1 virüsünün öncelikle en yüksek yoğunlukfraksiyonuna (18.0) lokalize olduğunu ve daha az bir ölçüde HTLV-1 matris proteininin (p19) varlığından da kanıtgörüldüğü üzere 13.2-16.8 kesirlerinin olduğunu göstermektedir. Ayrıca, daha önce HTLV-1 transaktive protein, Vergi, HTLV-1 virion yok, HTLV-1 enfekte hücrelerden salınan ekzozomlar içinde mevcut olduğunu bulduk15,23. Şekil 3C'deki veriler, verginin alt yoğunlukkklarda (6.0-12.0) mevcut olduğunu ve bunlardan ikisinin ekzozom (10.8 ve 12.0) içerdiğini göstermiştir.
Daha sonra, HIV-1 ve HTLV-1 virions hem retrovirüsler ve çapı çok benzer olarak, sırasıyla Ebola virüsü (EBOV) ve Zika virüsü (ZIKV) gibi daha büyük ve daha küçük virüsler bağlamında izolasyon protokolü test etti. VLP'yi EBOV montaj ve çıkışının vekil biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) modeli olarak kullanarak, yaklaşık 1 μm uzunluğunda olan VLP'nin 0,22 μm filtrasyon (orta panel, Şekil 3C)yokluğunda en yüksek yoğunluk fraksiyonuna (18,0) lokalize olduğunu bulduk. Ayrıca, EBOV matriks proteini OLAN VP40 yüksek seviyelerde ifade edildiğinde, ekzozomların lokalize olduğu dahil olmak üzere her yoğunluk fraksiyonunda VP40 varlığıyla sonuçlanan birkaç farklı mekanizma aracılığıyla hücreden salgılanır13 , 14. Buna karşılık, ZIKV virions hiv-1 virions önemli ölçüde daha küçüktür, çapı yaklaşık 40 nm ölçme. Şekil 3C'nin alt panelindeki temsili diyagram, zikv virions'ın hem düşük yoğunluklu (6.0-8.4) hem de yüksek yoğunluklu (15.6-18.0) fraksiyonlarında varlığını göstererek, sırasıyla hem serbest virüsün hem de EV kapsüllü virüsün varlığını göstermektedir.
Şekil 1: Bir iodixanol yoğunluk gradient inşaat. (A) Her yoğunluk fraksiyonu oluşturmak için kullanılan iodixanol ve PBS göreli miktarları (Kesir #). Kesir # her kesir de dahil iodixanol yüzdesini gösterir. Göreceli yoğunlukları ve degradedeki yerleşimleri en ağırdan en hafife doğru betimlenmiştir. (B) Yoğunluk fraksiyonlarının (6.0-18) ultrasantrifüj tüpüne yerleştirilmesi (sol taraf) ve üç EV popülasyonunun (Exo #1, Exo #2, Exo #3), Exo benzeri veziküllerin ve protein komplekslerinin yeri gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PEG çökeltme reaktifi EV verimini artırır. (A) EV kurtarma karşılaştırmak için, EVs izole edildi 5 d HIV-1 enfekte monosit (U1) kültür supernatant (10 mL) geleneksel ultrasantrifüj (100.000 x g)veya PEG yağış reaktifi (1:1 oranında kuluçka). Her iki zenginleştirme prosedüründen eVs DeMarino, ve ark.6açıklandığı gibi ortaya çıkan EV konsantrasyonu değerlendirmek için nanotracking analizi kullanılarak analiz edildi. NTA teknik triplicate 11 bağımsız pozisyonlarda ölçüldü. Mavi çubuklar 33 ölçümün ortalamasını temsil eder ± S.D. İki kuyruklu öğrencinin t-testikullanılarak istatistiksel anlamlılık belirlenmiştir; p < 0.001. B. Ultracentrifugation (UC) veya PEG yağış kullanarak 5 günlük CEM kültürü supernatant gelen EVs iodixanol yoğunluk ayrımı takip. Ultrasantrifüj 100 mL kültür supernatant (Lane 1) kullanılarak gerçekleştirilirken PEG yağış ve sonraki iyodixanol fraksiyonu 10 mL kültür supernatant (şerit 2) kullanılarak gerçekleştirildi. Ultracentrifugation'dan elde edilen toplam EV peleti ve PEG/iodixanol ayırmadan elde edilen 10.8 fraksiyonu, aktin kontrollü ekzozomal marker proteinlerin (CD81, CD63 ve CD9) varlığı için batı lekeleri ile analiz edildi. Netlik için, aynı pozlamaya sahip aynı lekeden seçilen şeritler B panelinde gösterilir. Bu rakam DeMarino, ve ark.6değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: EVs'nin virüslerden uzak yalıtımı. (A) Enfekte olmamış CEM hücrelerinden (üst panel), HIV-1 (Ba-L; MOI: 0.01) enfekte U1 hücreleri (±PMA ve ±cART tedavisi; orta panel) veya HIV-1 enfekte primer makrofajlar (alt panel) bir gecede 4 °C'de PEG yağış reaktifi ile inkübe edildi. EV'ler iodixanol yoğunluk gradienti kullanılarak kesirlere ayrılmıştır. Tüm fraksiyonlardan gelen EV'ler bir gecede 4 °C'de NT80/82 parçacıkları kullanılarak zenginleştirilmiştir. CEM nanopelletler ekzozomal marker proteinlercd81, CD63 ve CD9 varlığı için batı leke kullanılarak analiz edildi. U1 (±PMA ve ±cART tedavisi) ve HIV-1 enfekte primer makrofajlar HIV-1 Gag proteini (p24 ve Pr55; sırasıyla yarık ve amcaaved HIV-1 Gag poliproteini) ve CD63 varlığı açısından analiz edildi. Lekeler kontrol olarak aktin için incelendi. Gerçek ekzozom popülasyonları (CD81+CD63+CD9+) kırmızı ile özetlenmiştir. Bu rakam DeMarino, ve ark.6 (B) Enfekte U1 hücrelerinden beş günlük kültür supernatants 4 ° C gecede PEG yağış reaktifi ile kuluçkaya yatırıldı değiştirilmiştir. EV'ler iodixanol yoğunluk gradienti kullanılarak kesirlere ayrılmıştır. Tüm fraksiyonlardan gelen EV'ler bir gecede 4 °C'de NT80/82 parçacıkları kullanılarak zenginleştirilmiştir. Fraksiyonları HIV-1 Nef, Vpr ve Tat varlığı için bir Batı leke üzerinde çalıştırıldı. Actin kontrol olarak kullanıldı. Gerçek ekzozom popülasyonları (CD81+CD63+CD9+) daha önce DeMarino'da tanımlandığı gibi kırmızı ile özetlenmiştir, ve diğerleri6 (C) Daha önce karakterize edilmiş EV ayırma profillerinin dörtten temsili illüstrasyonu farklı virüsler: HIV-1, HTLV-1, EBOV ve ZIKV. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Protokol iş akışı. Yeni iş akışı filtrasyon, PEG çökelti reaktifi kullanarak EV çökeltme, iyodixanol yoğunluk gradyan ayırma ve EVs nanopartikül zenginleştirme dahil olmak üzere çeşitli teknikleri birleştirir. Bu protokolün kullanımı EVs çeşitli virüslerden ayırır ve qPCR, Batı leke, kütle spektrometresi, RNA sıralama, sitokin analizi, ELISA ve hücre bazlı tahliller de dahil olmak üzere downstream tahliller için küçük bir hacim örneği sağlar. Bu rakam DeMarino, ve ark.6değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ana hatlarıyla kullanılan yöntem, gelişmiş EV verimi ve virüsün izolasyona kombinasyon yaklaşımı kullanarak EV'lerden ayrılmasına olanak tanır. Nispeten büyük miktarlarda başlangıç malzemesi (örn. hücre süpernatantı) EV izolasyonundan önce çökelme, DG ayrıştırma ve nanopartikül zenginleştirme ile filtrelenebilir ve bu da ~30 μL'lik son bir hacimle sonuçlanabilir ve bu da çeşitli alanlarda hemen kullanıma olanak sağlar. downstream tahlilleri. Nanopartikül zenginleştirme kullanımı, geleneksel ultrasantrifüj ile karşılaştırıldığında, bu EV zenginleştirici nano tanecikleri daha verimli veziküller yakalamak için gösterilmiştir, daha büyük veya kültür 1 mL vezikül miktarına eşit verim supernatant ultracentrifuged kültür supernatant1510 mL ile karşılaştırıldığında . Genel olarak, açıklanan protokol birkaç iyi bilinen tekniklerin birleşimini içerir ve bu nedenle sınırlı zorluklar sunmalıdır. Ancak, EV zenginleştirici nano tanecikleri dahil aşağı taht taht veya ilgi biyolojik hedefe bağlı olarak istenen sonuçlar elde etmek için sorun giderme ve / veya değişiklikler gerektirebilir yeni bir teknik tanıttı. Nano partiküllerin bir gecede filtrelenmiş hücre kültürü süpernatants ile kuluçkaya yatırılmasını öneririz. Eğer hedef protein veya RNA'nın ilgi çekici liği model sisteminde düşük bollukta ise, protokol, hedefin yakalanmasını sağlamak için kuluçka süresini artırmak için uyarlanabilir. Aşağı tahlillerde nano taneciklerin kullanımı genellikle her tahlil için istenen örnek arabellek pelet resuspend tarafından gerçekleştirilebilir. Örneğin, nano tanecikleri batı leke analizi için Laemmli tampon doğrudan askıya alınabilir. Yakalanan malzeme daha verimli ısıtma ve girdap döngüleri ile SDS nano tanecikleri eluted olmalıdır. Proteinin yeterli ayrıştırılması için, jel içine yüklenen nano tanecikleri miktarını sınırlamak için dikkatli alınmalıdır, ve jel kalan parçacıkların kuyulara içerdiğinden emin olmak için yaklaşık 100 V çalıştırılmalıdır. Ayrıca, düşük molekül ağırlıklı proteinlerin görüntülenmesi için, bir gecede ıslak transfer en iyi sonuçları elde eder. Nano partiküllerin kullanımı vezikül popülasyonlarının önemli ölçüde zenginleşmesine yol açsa da, parçacıklardan yakalanan maddeyi çıkarmak için ek adımlar atılmalıdır. Ayrıca, birçok elüsyon tamponları EV membran bütünlüğüne zarar verebilir gibi malzemenin elution potansiyel olarak aşağı fonksiyonel tahlillerde EVs yarar sınırlayabilir. Ek araştırma nano tanecikleri sonrası kuluçka bozulmamış veziküllerin kaldırılması için izin vermek için bir strateji mühendisi gereklidir. Bu parçacıkların bir diğer dezavantajı karakterizasyon mevcut eksikliğidir. Parçacığın dış kabuğu yüksek molekül ağırlıklı molekülleri dışlamak için tasarlanmıştır. Ancak, evs parçacıkların özel hedefleme yer almaz ve sonuç olarak birçok şaşırtıcı faktörler ve arka plan sinyalleri potansiyel downstream tahlillerde mevcut olabilir.
Açıklanan yöntem öncelikle laboratuvar amaçlı kullanılacaktır. Yakın zamanda, plazma ve BOS gibi küçük ölçekli, hasta biyosıvılarından ve büyük ölçekli, ticari EV üretimigibi evleri izole etmek için ek tekniklere kombinasyon yaklaşımımızın yeteneklerini genişletmek için alternatif yöntemler geliştirdik. Hasta materyalinde EVs'lerin virüsten uzak tutulması için yoğunluk gradyanı yerine kullanılan boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonlarının kullanımını birleştirdik. Bu sütunlar tek kullanımlık olmaları ve bu nedenle yüksek çevreleme laboratuvarlarında ideal olmaları açısından yararlıdır. Ancak, SEC sütunları parçacıkları boyuta göre ayırır, bu nedenle, bu tür ayırmaların yalnızca EBOV (~1 μm) veya ZIKV (~40 nm) gibi büyük veya çok küçük virüslerin ayrılması için geçerli olduğunu, sırasıyla EV'lerden veya uzaklara ayrılmasını izler. serbest protein. Büyük ölçekli EV üretimi açısından, filtrasyon aparatı nadayalı yöntemlerdeki son gelişmeler, yani teğetsel akış filtrasyonu (TFF), EV'lerin büyük numune hacimlerinden verimli bir şekilde izole edilmesine olanak sağlamıştır. TFF tarihsel virüsler de dahil olmak üzere nanoboyutlu biyomoleküllerin saflaştırılması için kullanılmıştır, ve protokollerin optimizasyonu yoluyla bu sistem başarıyla EVs24,25izolasyon için adapte edilmiştir. Kısaca, TFF işlemi sırasında, numune sıvısı, boyut ve molekül ağırlığına göre vezikülleri seçici olarak koruyan yarı geçirilebilir bir zarın yüzeyinde teğet olarak akar ve böylece EVs'lerin serbest proteinlerden ve diğer kirletici biyomoleküller26. Ultracentrifugation ile karşılaştırıldığında, BU TFF daha yüksek verim, daha az toplama sonuçları ve EVs27lot-to-lot değişkenliğini azaltır bildirilmiştir. Ayrıca, iyi üretim uygulaması için TFF kullanımı (GMP)-grade izolasyon EVs terapötik uygulama için debildirilmiştir 28. Ölçeklenebilirliği ve tekrarlanabilirliği sayesinde, bu teknoloji gelecekteki EV araştırmaları için büyük bir potansiyel sunar.
Virüsler farklı boyutlarda ve yoğunluklarda gelir, bu nedenle söz konusu virüsbağlı olarak, bu protokolün optimizasyonu gerekebilir. Ebola gibi çok büyük virüsler için (~1 μm veya daha büyük uzunlukta), basit filtrasyon virions ve VLPs ve apoptotic organları14gibi büyük kirletici organların büyük çoğunluğu kaldırmak için kullanılabilir. Bu, virüsün EVs'den uzak bir şekilde ayrılmasının çoğuna, arınmanın ön ucunda çalıştırılabilir olmasını sağlar. Ancak, enterovirüs (~30 nm), Zika virüsü (~40 nm), hepatit B virüsü (~42 nm), hepatit C virüsü (~55 nm) ve diğerleri gibi daha küçük virüslerde, virions tortularının daha fazla aşağı fonksiyonel olarak belirlenmesi gereken fraksiyon Analiz. Tek başına parçacık çapına göre sedimantasyonun olası kısmını her zaman tahmin edemezsiniz. Örneğin, çapı 30 nm olan çocuk felci virüsü, aynı zamanda salgı otofazomlarıkapsüllenmişolduğu bilinmektedir 29,30,31,32,33, ve bu nedenle bulunabilir olması muhtemeldir degradenin sağ tarafı (daha yoğun kesirler) yerine sol (daha az yoğun kesirler). Biz HIV-1, HTLV-1 ve EBOV VLPs durumunda bu protokolü optimize etmiş olsa da, ek virüsler evs uzak kendi özel arıtma için protokol ince ayar için karakterizasyon gerekir.
Burada özetlenen protokol(Şekil 4)ilk kez, kullanıcının EV izolasyonunun altın standardına göre gelişmiş verimlilik ve daha küçük hacimlerde başlangıç malzemesi ile EVs'leri virüsten ayırmasına olanak tanır, ultrasantrifüj. Bu yöntem, değişen numune boyutları, gerekli verimler, başlangıç materyali türü (örn. hasta materyaline karşı kültür süpernatant) ve farklı boyutlardaki çeşitli virüsler dahil olmak üzere eldeki koşullara kolayca adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L., bu makalede kullanılan reaktifler ve/veya enstrümanlar üreten Ceres Nanosciences inc. şirketine bağlıdır. Diğer tüm yazarlar olası çıkar çatışmaları beyan etmez.
Acknowledgments
Keşançi laboratuvarının tüm üyelerine teşekkür etmek istiyoruz, özellikle Gwen Cox'a. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibeleri (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 ve NS099029 to F.K.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
