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Behavior

신경 근육 질환의 마우스 모델의 행동 현상형에 대한 저렴한 걸음걸이 분석

Published: July 18, 2019 doi: 10.3791/59878

Summary

발자국 분석은 쥐의 운동 이상을 정량화하는 연구자들을 위한 디지털화된 걸음걸이 분석 프로그램에 대한 저비용 대안입니다. 속도, 단순성 및 세로 전위로 인해 마우스 모델의 행동 자형화에 이상적입니다.

Abstract

동물 운동의 측정은 주어진 질병, 상해 또는 약물 모형의 표현형을 기술하기 위하여 이용된 일반적인 행동 공구입니다. 여기에서 입증된 저비용 보행 분석 방법은 뮤린 모델에서 걸음걸이 이상을 간단하고 효과적으로 측정한 것입니다. 발자국은 무독성 세척 가능한 페인트로 마우스 발을 페인팅하고 피사체가 종이에 터널을 통과할 수 있도록 하여 분석됩니다. 테스트 터널의 설계는 자연 마우스 동작과 작은 어두운 장소에 대한 선호도를 활용합니다. 각 마우스의 보폭, 보폭 및 발가락 스프레드는 눈금자와 연필을 사용하여 쉽게 측정할 수 있습니다. 이는 확립되고 신뢰할 수 있는 방법이며 디지털 시스템과 유사한 몇 가지 메트릭을 생성합니다. 이 접근법은 표현형 프리젠테이션 초기에 보폭의 변화를 감지할 수 있을 만큼 민감하며, 비침습적 접근법으로 인해 수명 또는 표현형 프레젠테이션 전반에 걸쳐 그룹 테스트를 수행할 수 있습니다.

Introduction

운동은 복잡한 신경및 근골격계 협응을 필요로 하며, 운동 경로의 단일 측면에서 적자는 관찰 가능한걸음걸이 이상을 생성할 수 있는 1,2. 걸음걸이 분석은 주어진 질병, 상해 또는 약물이 동물의 움직임에 미치는 영향에 대한 정량적 행동 데이터를 제공하기 때문에 마우스 모델을 테스트하는 연구자를위한 중요한 도구입니다3. 그러나 디지털 걸음걸이 분석에는 러닝머신, 카메라 및 관련 소프트웨어를 구입해야 하는데, 이는 연구자에게 엄청나게 비쌀 수 있습니다. 걸음걸이 분석은 종종 모터 기능의 세로 변화를 추적하기 위해 간헐적으로 사용되므로 산발적으로 사용하는 경우 지출을정당화하기 어려울 수 있습니다 4. 디지털화된 분석은 단순한 발자국 분석보다 더 상세한 걸음걸이 메트릭을 제공할 수 있지만, 이러한 보다 복잡한 측정값이항상 행동 표현형의 특성화에 항상 필요하거나 관련이 있는 것은 아닙니다 5.

여기서 우리는 디지털화 보행 분석 프로그램6,7에대한 빠르고 민감한 대안으로 저렴한 수동 풋 프린트 분석 방법을 제시한다. 수동 발자국 분석은 뮤린 질병 모델 4,7,8, 9,10,11의 다수에서 유의한 보행 차이를 검출하는 것으로 입증되었습니다. ,12,13,14,15,16,17, 적어도 하나의 경우, 이 저렴한 방법은 걸음걸이의 변화를 확인 일반적인 디지털 화된 걸음걸이 분석프로그램(12)에의해 검출되지 않았다. 재료의 총 비용은 명목이며, 다른 설치류 연구 모델에 쉽게 적용 할 수 있습니다.

데이터를 그릴 수 있는 다양한 걸음걸이 메트릭이 있지만, 설명하는 방법은 보폭 길이, 보폭 폭(일명 "트랙 너비") 및 발가락 스프레드의 세 가지 특정 메트릭에 중점을 둡니다. 평가할 매개변수는 모델별로 결정해야 합니다. 이 보행 분석 방법은 인지 기능을 측정하도록 설계되지 않았으며 보행16의복잡한 생체 역학 측정이 필요한 연구에는 권장되지 않습니다.

우리는 운동 신경 변성 및 근육 위축을 특징으로 하는 신경 근육 질환인 X-연결된 척추 및 구근 근육 위축(SBMA)을 모델링하는 전및 후 증상 마우스 집단의 행동 데이터를 제시합니다. 이 마우스는 그밖 질병 특정 표현형의 개시와 일치하는 보행에 있는 진보적인 적자를 개발합니다. 이것은 이 방법의 타당성 및 특이성을 보여주고, 영향 받은 동물과 영향을 받지 않는 동물 사이에서 안정적으로 구별할 수 있다는 것을 확인합니다.

본 연구에서 실험마우스는 C57BL/6 배경상에서 2.5(전증상) 및 9개월된 BAC fxAR121 형질전환 마우스(nexpt=12)였다. 이 모델은 우리의 실험실에서 생성되었으며 SBMA 9의 강력한 마우스모델로 완전히 특징지어졌습니다. 비형질성 래쉬메이트는 대조군으로사용하였다(n ctrl=8). SBMA는 남성에서만 완전히 나타나는 성 제한 질병이므로 남성 마우스가 이 연구를 위해 독점적으로 사용되었습니다. 계획 단계 도중, 연구원은 그룹 규모 및 조성물18를결정하기 위하여 생물학 변수로 성의 국립 학회의 고려사항을 고려해야 합니다.

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Protocol

마우스로 수행된 모든 테스트는 듀크 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 시험 및 채점을 담당하는 직원은 전체 코호트에 대해 걸음걸이 분석 및 논문 채점을 완료할 때까지 동물 유전자형 또는 실험 조건에 눈을 멀게 해야 합니다.

1. 시험 재료 준비

  1. 0.375 인치 두께의 3 개의 미리 절단 된 투명 아크릴 패널로 만들어진 터널로 테스트를 수행하십시오. 특히 아크릴을 결합하고 건조 할 때 냄새를 방출하지 않습니다 실란트와 함께 패널을 접착하여 터널을 조립.
    1. 표준 C57BL/6 마우스의 경우 너비 2.5in, 높이 3개, 길이 13인의 터널 측정값을 사용합니다. 마우스는 편안하게 터널을 통과하고 보행을 측정 할 수 있도록 충분한 단계 (>4)를 취할 수 있어야합니다.
  2. 터널에 사용되는 것과 동일한 실란트와 함께 접착, 0.375 인치 두께의 미리 잘라 회색 아크릴 패널과 목표 챔버를 구축 할 수 있습니다. 챔버의 내부 측정은 4 인치, 4 인치 길이, 3 인치 높이입니다. 이 챔버의 개구부를 터널의 개구부(2.5인치 x 3.0인치)와 일치시다. 마우스는 자연스럽게 밝은 공간에 어두운 공간을 선호하기 때문에 불투명하고 어두운 색상을 사용하는 재료를 사용합니다.
  3. 두껍고 매끄러운 단계를 추적하기 위해 용지를 사용합니다(수채화 용지가 잘 작동). 개별 용지 스트립을 터널의 너비와 길이보다 약간 넓고 길게 자른다. 여기에 설명된 터널 치수를 사용하는 경우 용지를 15in으로 줄입니다.
  4. 무독성 세척 가능한 수성 페인트의 두 가지 대비되는 색상(예: 녹색 및 보라색)을 사용합니다. 뒷다리에 한 가지 색상을 지정하고 두 번째 색상은 앞다리에 할당합니다. 마우스는 테스트 후 자신의 발에서 나머지 페인트를 핥아, 그래서 선택한 페인트는 완전히 무독성이어야합니다.
  5. 두 개의 둥근 배럴 페인트 브러시를 사용 하 여, 각 페인트 색상에 대 한 하나 (~ 0.5 cm 직경, 테이퍼/뾰족한 브러시 팁).
  6. 마킹이 밀리미터까지 표시된 눈금자를 선택하고, 0.1 mm까지 측정한 캘리퍼스는 점수 매기기 용지에 쓰는 것이 좋습니다.
  7. 선택 사항: 불안이 높거나 동기 부여가 낮은 동물의 경우 골방에서 행동 인센티브를 제공합니다. 이 살균 해바라기 씨앗의 소량을 포함 할 수있다 (가정 케이지에 배치 2 습관이 허용하기 위해 테스트 하기 전에 일). 테스트 당일, 골실 안에 해바라기 씨를 넣어 마우스가 멈추지 않고 걷도록 장려합니다.

2. 데이터 수집

  1. 별도의 방에서 검사를 수행하는 경우, 30 분 동안 새로운 방에 마우스를 적응한 다음 행동 실험을 시작합니다. 또한, 마우스는 자연적으로 야행성이기 때문에 모든 마우스가 완전히 깨어 있고 테스트 하기 전에 적어도 5 분 동안 경고합니다.
  2. 터널을 용지 위에 배치하고 용지에 마우스 ID 및 테스트 날짜로 표시하여 테스트 설정을 준비합니다. 터널 끝에 골챔버를 배치하고 양쪽 열린 끝을 연결합니다. 필요한 경우 동기 부여를 위해 터널 끝에 해바라기 씨를 추가하십시오 (목표 챔버 내부).
  3. 케이지에서 테스트할 마우스를 제거하고 목덜미에 단단히 고정하여 꼬리를 잡고 뒷다리의 움직임을 안정시도록 합니다.
  4. 모든 발가락의 아래면과 발의 중심이 페인트로 완전히 덮여 있도록 페인트 앞발. 뒷발에 대비를 이루는 페인트 색상으로 이 작업을 반복합니다. 데이터 수집을 방해할 수 있는 얼룩을 방지하기 위해 깨끗한 젖은 천으로 마우스가 신체의 다른 부분에 도착하는 페인트를 닦아냅니다.
    참고: 마우스 취급은 동물의 스트레스를 최소화하기 위해 숙련된 연구자들이 수행해야 합니다.
  5. 터널의 시작 부분에 마우스를 놓고 목표 챔버에 모든 방법을 걸어 허용, 다음 마우스를 검색, 부드럽게 물 감쇠 천으로 발을 닦아, 홈 케이지에 반환.
  6. 점수를 매기기 전에 발자국이 있는 용지를 완전히 건조시키십시오. 에탄올이나 각 동물 사이에 동등한 세척용액으로 시험 장과 터널을 닦아냅니다.

3. 채점 기준

  1. 점수를 매기기 위해 얼룩이 없는 명확한 발자국으로 일관되게 간격을 두는 단계를 사용합니다. 그림 1B는 점수를 매을 낼 수 있는 풋프린트 시퀀스의 좋은 예입니다. 충분한 점수 매기기 데이터를 생성하려면 각 발에서 2단계 이상 연속되어야 하지만 발당 4-6걸음이 권장됩니다. 마우스가 보행 속도를 변경하기 때문에 정상적인 보행을 나타낼 가능성이 낮기 때문에 용지에 첫 번째 발자국과 마지막 발자국을 포함하지 마십시오.
  2. 보폭, 보폭 및 발가락 스프레드를 이 방법을 사용하여 분석할 수 있는 세 가지 보행 걸음 걸이 측정값으로 사용합니다.
    참고: 보폭 길이와 너비는 앞발 영역이 페인트에 잘 정의된 명확한 순차 인쇄가 필요합니다. 발가락 스프레드는 점수를 매기기 위해 순차적 인 인쇄가 필요하지 않으며 한 발과 마지막 발가락의 명확한 인쇄만 필요합니다. 그러나 지정된 풋프린트가 보폭 길이 또는 너비 측정에 포함되지 않은 경우 발가락 확산에 대해 점수를 매길 수 없습니다. 세 가지 측정은 모두 센티미터로 평가됩니다.
    1. 보폭 길이를 동일한 보행보행에 의해 생성된 두 개의 순차 풋프린트 사이의 거리로 정의합니다(예: 한 보폭)(그림1A,1B).
      1. 연필을 사용하여 두 앞다리 발자국(위에 지정된 색상으로 식별)의 앞발 영역 주위에 2-4mm 원을 그려 눈금자를 사용하여 둘 사이에 선을 그립니다.
      2. 각 원의 중간에서 두 인쇄(즉, 각 발 패드의 중심)에서 오른쪽 포어 1(RF1) 또는 왼쪽 포어 1(LF1)으로 사이의 거리를 기록합니다.
      3. 점수를 매을 넣을 수 있는 모든 단계(RF2, LF2, RF3, LF3 등)에 대해 반복합니다.
      4. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 발자국에 대해 반복합니다.
      5. 각 팔다리에 대해 기록된 모든 개별 보폭거리를 평균합니다. 통계 분석을 위해 개별 코호트 구성원을 함께 평균화할 수 있습니다.
    2. 보폭을 왼쪽 및 오른쪽 앞다리 또는 뒷다리 사이의 거리 측정값으로 정의합니다(그림1A,1B).
      1. 이 거리를 평가하려면 반대쪽 뒷다리의 보폭 길이에 대해 수직으로 교차하는 한 뒷다리의 원앞다리 영역에서 선을 그리고 측정합니다.
      2. 점수를 매을 받을 수 있는 모든 뒷쪽 사지 인쇄에 대해 이 작업을 반복한 다음 측정값을 평균화합니다. 보폭에 대한 계산 방법은 앞다리와 뒷다리의 경우 동일합니다.
    3. 발가락 스프레드를 단일 앞다리 또는 뒷다리 발자국에서 첫 번째 발가락과 마지막 발가락 사이의 거리로 정의합니다(그림1A,1B).
      1. 캘리퍼를 사용하여 첫 번째 발가락 인쇄의 끝과 마지막 발가락 인쇄의 끝 사이의 거리를 측정합니다.
      2. 점수를 매겨야 할 수 있는 모든 뒷다리 인쇄에 대해 반복하고 측정값을 평균화합니다. 발가락 스프레드에 대한 계산 방법은 전두부 및 뒷다리와 동일합니다.
  3. 종이를 채점할 수 없는 경우, 다시 시도하기 전에 동물이 10분 동안 쉬도록 합니다.

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Representative Results

동물의 충분한 수와 함께,이 절차는 시간이 지남에 따라 동일한 변형 내에서 마우스 유전자형 사이의 보행 차이를 감지 할 수있다. 그림 1B는 낮은 운동 신경 및 골격 근에 영향을 미치는 신경 퇴행성 질환인 X-연결된 척추 및 구근 근육 위축(SBMA)의 마우스 모델을 사용하여 실험실에서 수집된 발자국 이미지의 대표적인 흔적을 보여줍니다. 우리는 이전에 남성 BAC fxAR121 형질전환 마우스가 비형질전환 리터메이트 대조군과 비교했을 때 상당한 체중 감소, 그립 강도의손상 및 증상 후 연령대의 보폭 길이 단축을 개발한다고 보고했다 9.

여기서 우리는 전증상(2.5개월) 및 증상 후(9개월) BAC fxAR121 형질전환 및 리터메이트 대조군 수컷 마우스의 코호트로부터의보행 분석 결과를 제시한다(도 2). 질병 발병 전에 BAC fxAR121 형질전환 마우스는 그들의 리터메이트 비형질전환 대조군과 비교하여 보폭, 보폭 및 발가락 스프레드가 유사하게 나타낸다. 질병 발병 후, BAC fxAR121 형질전환 마우스는 보폭 길이가 현저히 짧다(p앞다리= 0.001, p뒷다리= 0.009)(도2A). 유사한 세로 분석은 어느 연령에서보폭의 차이가 없음을 테스트하였다(p2.5개월=0.709= p9개월=0.204)(그림2B). 후 증상 BAC fxAR121 형질전환 마우스는 또한 연령일치 리터메이트 대조군보다 뒷발가락 스프레드(p=0.01)가 현저히 좁습니다(그림2C). BAC fxAR121 마우스 모델은 주로 뒷다리에 영향을 미치는 신경 근육 질환을 모델링하므로 앞다리 걸음걸이의 상세한 측정은 수집되지 않았다. 우리는 이 걸음걸이 분석 방법을 사용하여 마우스 모델의 표현형을 고려하고 그에 따라 앞다리 또는 뒷다리 보행 메트릭을 선택하는 것이 좋습니다.

Figure 1
그림 1: 걸음걸이 분석 조치 및 문제 해결.
마우스에대한 걸음걸이 분석의 개략적 표현으로 보폭, 보폭 및 발가락 확산 정보를 묘사합니다. B.세 가지 파라미터 모두의 측정을 묘사하여 점수를 매겨야 할 걸음걸이 분석 풋프린트 시퀀스의 대표적인 예입니다. C.점수를 매겨야 할 문제가 있는 걸음걸이 분석 풋프린트 시퀀스의 대표적인 예입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: SBMA BAC fxAR121 형질전환 마우스는 걸음걸이 분석을 통해 검출될 수 있는 진행성, 퇴행성 보행 표현형을 나타낸다.
A.증상 전 연령(2.5개월,nctl=11, n익스프트=12)에도 불구하고 BAC fxAR121 마우스는 증상 후 단계에서 비형질전환 리터메이트 대조군과 비교하여 보폭이 현저히 감소합니다(9 월, nctl=8, n익스프트=12). B.어느 나이에보폭에서 변화가 발견되지 않았다. C.증상 SBMA BAC fxAR121 형질전환 마우스 디스플레이는 비형질전환 리터메이트 대조군과 비교하여 뒷사지 발가락 확산을 현저히 감소하였다. N = 8-12/그룹. ANOVA 포스트 혹 Tukey 테스트 * p & 0.05, ** p & 0.01. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

위에서 설명한 저비용 보행 분석 방법을 사용하여, 우리는 SBMA의 BAC fxAR121 마우스 모델에서 증상 후 연령대에서 보행 기능 장애의 여러 매개 변수의 성공적인 식별을 보여줍니다. 보폭의 감소는 마우스 모델 및 인간 환자의 이전SBMA 연구와 일치9. 우리는 또한 비 형질전환 littermate 대조에 비해 증상 SBMA 마우스에서 뒷다리 발가락 확산에 상당한 차이가 있다는 것을 처음으로 보여줍니다. 흥미롭게도, 뒷발가락 확산의 감소는 발 신근 근육의 약점, 발 굴곡 근육의 압박감, 또는SBMA의 병인과 일치하는 가난한 신경 내심 2,19에의해 발생할 수 있습니다.

마우스는 작은 어두운 공간에 대한 자연적인 행동 선호로 인해 목표 챔버로 쉽게 실행해야하지만 일부 마우스는 터널을 통해 지속적으로 이동하지 않을 수 있습니다. 마우스가 터널 내에서 점프, 중지 또는 회전하는 경우(그림 1C의예 참조), 새 채점 용지에 휴식 기간 이후에 분석을 반복합니다. 마우스가 터널의 맨 처음에 멈추면 목표 상자로 부드럽게 달려갈 수 있기 때문에 결과를 회수할 수 있습니다.

마우스 발에 페인트를 너무 많이 또는 너무 적게 바르면 사용할 수 없는 결과를 얻을 수 있습니다. 과도한 페인트는 얼룩이 지거나 왜곡된 인쇄로 이어질 수 있으며, 페인트가 부족하면희미하거나 식별할 수 없는 인쇄물이 생성될 수 있습니다(그림 1C). 두 경우 모두 부정확한 측정을 방지하기 위해 깨끗한 점수 매기기 용지에 분석을 반복합니다.

아주 어린 마우스 (&3 개월)는 터널에서 앞으로 뛰어 들 확률이 높으며, 나이가 들린 (>8 개월) 또는 매우 자형형 마우스는 전진 운동을 완전히 멈추거나 저항 할 가능성이 더 높습니다. 목표 챔버에 행동 인센티브 (해바라기 씨앗)를 추가하면 의도하지 않은 마우스가 멈추지 않고 터널을 통과하도록 장려하여 문제가있는 행동의 빈도를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

터널 치수는 피사체의 치수를 반영해야 합니다. 평균 실험실 마우스보다 훨씬 크거나 작은 마우스를 사용하는 경우(나이, 식단 또는 유전자 돌연변이로 인해), 동물의 크기에 맞게 터널 및 목표 챔버 치수를 변경하는 것이 좋습니다. 터널에서 마우스는 직선으로 편안하게 걸을 수 있어야하지만,이 동작을 억제하기 위해 주위를 돌리는 데 어려움이 있어야합니다. 골 챔버는 터널의 높이와 일치해야하며 마우스는 챔버 내부에 편안하게 맞아야합니다.

그들의 마우스를 위한 식별의 발가락 클리핑 방법을 사용하는 연구원은 발가락 퍼짐에 데이터를 수집하지 못할 지도 모르지만, 보폭 길이 및 보폭 같이 보행의 그밖 측정은 아직도 수집될 수 있습니다. 발가락 클리핑은 마우스 20개당 발가락이 2개 이하가 클리핑되지 않는한 마우스의 걸음걸이에 큰 영향을 미치지 않는다.

이 걸음걸이 분석 방법은 인지 기능을 반영하지 않으므로 인식의 척도로 사용해서는 안됩니다. 이 방법을 사용 하려는 다른 그들의 마우스 모델에 영향을 받는 신경 근육 그룹을 고려해 야 한다, 다음 에 따라 앞 또는 뒷 다리 메트릭을 선택. 보행 분석의이 방법은 풋 패드 주사를 필요로 하는 통증 응답을 연구 하는 연구자, 또는 혼자 발자국에 의해 설명 될 수 없는 운동의 생체 역학 측정을 필요로 하는 연구에 대 한 권장 하지 않습니다., 사지의 시간 측정 처럼 모션 또는 관절 회전21.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 동물 식별 지원에 대한 오전에 감사드립니다. 이 작품은 미국 국립 보건원 (R01 7 RF1 AG057264에서 A.R.L.S. 및 C.J.C.와 R01 NS100023에서 A.R.L.S.에) 및 근 이영양증 협회 (A.R.L.S.에 대한 기본 연구 보조금, C.J.C.에 대한 개발 보조금)의 보조금에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Caliper n/a n/a must have markings down to 0.1 mm
Craft Glue E6000 n/a
Footprint Paint (Tempera Paint) Artmind n/a must be non-toxic
Round Barrel Paintbrushes Symply Simmons n/a 0.5 cm diameter
Ruler n/a n/a must have markings down to millimeters
Scoring Paper (Watercolor Pads) Canson n/a cut to size
Tunnel and Goal Chamber Interstate Plastics n/a cut to size

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References

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행동 문제 149 보행 분석 보폭 길이 발자국 분석 표현형 행동 신경 퇴행성 질환 신경 근육 질환 마우스 모델
신경 근육 질환의 마우스 모델의 행동 현상형에 대한 저렴한 걸음걸이 분석
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Wertman, V., Gromova, A., La Spada,More

Wertman, V., Gromova, A., La Spada, A. R., Cortes, C. J. Low-Cost Gait Analysis for Behavioral Phenotyping of Mouse Models of Neuromuscular Disease. J. Vis. Exp. (149), e59878, doi:10.3791/59878 (2019).

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