Summary
A análise de pegada é uma alternativa de baixo custo para programas digitalizados de análise da marcha para pesquisadores que quantifiquem anormalidades de movimento em camundongos. Devido à sua velocidade, simplicidade e potencial longitudinal, é ideal para a fenotipagem comportamental de modelos de mouse.
Abstract
A medida da locomoção animal é uma ferramenta comportamental comum usada para descrever o phenotype de uma doença, de um ferimento, ou de um modelo de droga dado. O método de baixo custo da análise da marcha demonstrado aqui é uma medida simples, mas efetiva, de anormalidades da marcha em modelos murinos. As pegadas são analisadas pintando os pés de um rato com a pintura washable não-tóxica e permitindo que o assunto ande através de um túnel em uma folha de papel. O projeto do túnel do teste aproveita-se do comportamento natural do rato e de sua afinidade para lugares escuros pequenos. O comprimento da passada, a largura da passada e a propagação do dedo do pé de cada mouse são facilmente medidos usando uma régua e um lápis. Este é um método bem estabelecido e confiável, e gera várias métricas que são análoga aos sistemas digitais. Esta aproximação é sensível bastante para detectar mudanças no Stride cedo na apresentação do phenotype, e devido a sua aproximação não invasora, permite o teste dos grupos através da vida-extensão ou da apresentação fenotípica.
Introduction
A locomoção requer coordenação neurológica e musculoesquelética complexa, e déficits em um único aspecto das vias motoras podem produzir anormalidades observáveis da marcha1,2. A análise da marcha é uma ferramenta crítica para pesquisadores testando modelos de mouse, pois fornece dados comportamentais quantificáveis sobre como uma determinada doença, lesão ou droga impacta o movimento de um animal3. No entanto, a análise de marcha digitalizada requer a compra de uma esteira, uma câmera e software associado, que pode ser proibitivamente caro para os pesquisadores. A análise da marcha é freqüentemente usada intermitentemente para rastrear mudanças longitudinais na função motora, podendo, portanto, ser difícil justificar a despesa se usada esporadicamente4. Embora as análises digitalizadas possam fornecer métricas de marcha mais detalhadas do que a análise de pegada simples, essas medidas mais complexas nem sempre são necessárias ou relevantes para a caracterização de um fenótipo comportamental5.
Aqui apresentamos um método de análise de pegada manual de baixo custo como uma alternativa rápida e sensível aos programas digitalizados de análise da marcha6,7. A análise manual da pegada foi demonstrada para detectar diferenças significativas da marcha em uma multidão de modelos da doença de murino4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17, e em pelo menos um caso, este método de baixo custo identificou mudanças na marcha que Não foram detectados por um programa comum de análise de marcha digitalizada12. O custo total dos materiais é nominal e pode ser facilmente adaptado a outros modelos de pesquisa de roedores.
Embora existam muitas métricas de marcha diferentes das quais os dados podem ser desenhados, o método que descrevemos concentra-se em três métricas específicas: comprimento da passada, largura da passada (também conhecida como "largura da faixa") e propagação do dedo do pé. É importante notar que os parâmetros a serem avaliados devem ser determinados numa base modelo a modelo. Este método de análise da marcha não é projetado para medir a função cognitiva, e não é recomendado para estudos que exijam medições biomecânicas complexas da marcha16.
Nós apresentamos dados comportáveis de uma coorte de ratos pre-e borne-sintomáticos que modelam a atrofia muscular espinal e bulbar X-lig (SBMA), uma doença neuromuscular caracterizada pela degeneração do neurónio de motor e pela atrofia do músculo. Estes ratos desenvolvem deficits progressivos no porte que coincidem com o início de outros phenotypes doença-específicos. Isso demonstra a validade e especificidade desse método, e confirma que pode discriminar de forma confiável entre animais afetados e não afetados.
Os camundongos experimentais deste estudo foram 2,5 (pré-sintomáticos) e camundongos transgênicos com 9 meses de idade (pós-sintomático) fxAR121 em um fundo C57BL/6 (nexpt= 12). Este modelo foi gerado em nosso laboratório e foi caracterizado inteiramente como um modelo poderoso do rato de SBMA9. Os littermates não transgênicos foram utilizados como controles (nCtrl= 8). A SBMA é uma doença limitada ao sexo, que se manifesta inteiramente em machos, de modo que os camundongos machos foram utilizados exclusivamente para este estudo. Durante as etapas de planejamento, os pesquisadores devem levar em consideração as considerações do sexo dos institutos nacionais de saúde como uma variável biológica para determinar os tamanhos dos grupos e a composição18.
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Protocol
Todos os testes realizados com camundongos foram revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Duke University. O pessoal responsável pelo teste e a pontuação devem ser cegos ao genótipo animal ou condição experimental até que a análise da marcha e a Pontuação dos artigos tenham sido concluídas para toda a coorte.
1. preparação do material de teste
- Conduza o teste com um túnel construído de 3 painéis acrílicos desobstruídos pre-cut que são 0,375 polegadas grossos. Monte o túnel colando os painéis junto com um vedador que lig especificamente o acrílico e não emita odores quando secado.
- Para camundongos C57BL/6 padrão, use as seguintes medições de túnel: 2,5 in. Wide, 3 in. High e 13 in. Long. Os camundongos devem ser capazes de caminhar confortavelmente pelo túnel e tomar medidas suficientes (> 4) para que a marcha possa ser medida.
- Construa a câmara do objetivo com os painéis acrílicos cinzentos pre-cut 0,375 polegadas grossos, colados junto com o mesmo vedador como usado no túnel. As medidas interiores da câmara são 4 in. Wide, 4 in. Long, e 3 in. Tall. Combine a abertura desta câmara à abertura do túnel (2,5 in. Wide x 3,0 dentro. Tall). Porque os ratos preferem naturalmente espaços escurecidos aos espaços bem iluminados, use o material que é opaco e escuro na cor.
- Use papel para rastrear as etapas que são grossas e suaves (papel aquarela funciona bem). Corte os papéis individuais tiras para ser ligeiramente mais largo e mais longo do que a largura e comprimento do túnel. Se usando as dimensões do túnel descritas aqui, corte papéis a 15 dentro. por muito tempo por 3,5 in. Wide.
- Use duas cores contrastantes (por exemplo, verde e roxa) de tinta à base de água lavável não tóxica. Atribua uma cor para os membros posteriores, o segundo para o forelimbs. Os ratos vão lamber a tinta restante de seus pés após o teste, de modo que a pintura selecionada deve ser completamente não-tóxico.
- Use dois paintbrushes redondos do tambor, um para cada cor da pintura (~ 0,5 cm no diâmetro, ponta afilada/pointed da escova).
- Selecione uma régua com marcações para baixo a milímetros, e um compasso de calibre com medidas para baixo a 0,1 milímetros. lápis é recomendado para escrever sobre os papéis de pontuação.
- Opcional: para animais com alta ansiedade ou baixa motivação, forneça um incentivo comportamental na câmara de gol. Isto pode incluir pequenas quantidades de sementes de girassol esterilizadas (colocadas na gaiola de casa 2 dias antes do teste para permitir a habituação). No dia do teste, coloc sementes do girassol dentro da câmara do objetivo para incentivar ratos a andar completamente sem parar.
2. recolha de dados
- Se o teste é realizado em uma sala separada, aclimatar os ratos para a nova sala por 30 minutos e, em seguida, iniciar os ensaios comportamentais. Além disso, como os camundongos são naturalmente noturnos, assegure-se de que todos os camundongos estejam totalmente acordados e atentos por pelo menos 5 minutos antes do teste.
- Prepare a configuração de teste posicionando o túnel sobre o papel e marcando o papel com o ID do mouse e a data do teste. Posicione a câmara do objetivo na extremidade do túnel, conectando ambas as extremidades abertas. Adicione sementes de girassol na extremidade do túnel (dentro da câmara do objetivo) para a motivação se necessário.
- Retire o mouse para ser testado a partir de sua gaiola e segure-o firmemente por seu Scruff, certificando-se de segurar a cauda para estabilizar o movimento de seus membros traseiros.
- Pinte as patas dianteiras para que toda a parte inferior de todos os dedos e o centro do pé estejam totalmente cobertas de tinta. Repita isso com uma cor contrastante de tinta em suas patas traseiras. Limpe toda a pintura que o rato começ em outras partes de seu corpo com um pano úmido limpo para impedir borrões que podem interferir com a coleção de dados.
Observação: o manuseio do mouse deve ser realizado por pesquisadores experientes para minimizar o estresse animal. - Coloc o rato no começo do túnel e permita que caminhe toda a maneira na câmara do objetivo, e recupere então o rato, limpe delicadamente fora de seus pés com um pano água-umedecido, e retorne-o a sua gaiola Home.
- Deixe o papel com as pegadas secar completamente antes de marcar. Limpe a área de teste e o túnel com etanol ou uma solução de limpeza equivalente entre cada animal.
3. critérios de Pontuação
- Use etapas que são consistentemente espaçadas com pegadas claras e não borrada para marcar. A Figura 1b é um bom exemplo de uma sequência de pegada que pode ser pontuada. A fim de gerar dados de Pontuação suficientes, deve haver pelo menos 2 etapas consecutivas de cada pé, mas 4-6 passos por pé é recomendado. Não inclua o primeiro e o último pegadas no papel, porque são improváveis representar a marcha normal porque o rato está mudando sua velocidade de passeio.
- Use o comprimento da passada, a largura da passada e a propagação do dedo do pé como três medidas diferentes da marcha que podem ser analisadas usando este método.
Nota: comprimento e largura da passada requerem impressões sequenciais claras em que a região do antepé está bem definida na pintura. A propagação do dedo do pé não exige cópias seqüenciais para marcar, somente cópias desobstruídas do primeiro e dos últimos dedos do pé em um único pés. No entanto, se uma determinada pegada não estiver incluída nas medições de comprimento ou largura da passada, ela não pode ser pontuada para a propagação do dedo do pé. Todas as três medidas são avaliadas em centímetros.- Defina o comprimento da passada como a distância entre duas pegadas sequenciais criadas pelo mesmo pé (ou seja, uma passada) (Figura 1A, 1B).
- Com um lápis, desenhe um círculo de 2-4 mm em torno da região do pé dianteiro de ambas as pegadas do membro torácico (identificado pela cor atribuída acima) em um único passo e desenhe uma linha entre eles usando uma régua.
- Registre a distância entre duas impressões a partir do meio de cada círculo (ou seja, centro de cada pé pad) como direita-Fore 1 (RF1) ou esquerda-Fore 1 (LF1).
- Repita para todas as etapas que podem ser pontuados (RF2, LF2, RF3, LF3 e assim por diante).
- Repita as pegadas das patas traseiras direitas e esquerdas.
- Média de todas as distâncias de Stride gravadas individuais para cada membro. Para a análise estatística, os membros individuais da coorte podem ser calculados em média juntos.
- Defina a largura da passada como a medida da distância entre os membros anteriores esquerdos e direito ou patas traseiras (Figura 1A, 1B).
- Para avaliar essa distância, desenhe e meça uma linha da região do antepé circundada de um membro posterior que cruza perpendicularmente com a linha para o comprimento da passada no membro traseiro contralateral.
- Repita isso para todas as impressões de membros posteriores que podem ser pontuados e, em seguida, a média das medições. O método de cálculo para a largura da passada é o mesmo para os membros dianteiros e traseiros.
- Defina a propagação do dedo do pé como a distância entre o primeiro e último dedos do pé em uma única pegada da frente ou do Hind-membro (Figura 1a, 1B).
- Use pinças para medir a distância entre a ponta da primeira impressão do dedo do pé e a ponta da última impressão do dedo do pé.
- Repita para todas as impressões de membros posteriores que podem ser pontuados e a média das medições. O método de cálculo para a propagação do dedo do pé é o mesmo para os membros dianteiros e traseiros.
- Defina o comprimento da passada como a distância entre duas pegadas sequenciais criadas pelo mesmo pé (ou seja, uma passada) (Figura 1A, 1B).
- Se o papel não puder ser pontuado, deixe o animal descansar por 10 minutos antes de tentar novamente.
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Representative Results
Com número suficiente de animais, este procedimento é capaz de detectar diferenças de marcha entre genótipos de camundongo, dentro da mesma cepa ao longo do tempo. A Figura 1b mostra traços representativos de imagens da pegada coletadas em nosso laboratório, usando um modelo do rato da atrofia muscular espinal e bulbar X-lig (SBMA), uma desordem neurodegenerativas que afeta uns mais baixos neurônios do motor e músculo esqueletal. Nós temos relatado previamente que os ratos machos do Bac fxAR121 transgênicas desenvolvem a perda de peso significativa, os prejuízos na força do aperto, e encurtaram o comprimento da passada em idades borne-sintomáticas quando comparados aos controles não-transgênicas do littermate9.
Aqui apresentamos os resultados da análise da marcha de uma coorte de camundongos machos pré-sintomáticos (2,5 meses de idade) e pós-sintomáticos (9 meses de idade) BAC fxAR121 transgênicos e littermate (Figura 2). Antes do início da doença, os camundongos transgênicos BAC fxAR121 exibem comprimento de passada semelhante, largura da passada e propagação do dedo do pé em comparação com seus controles não transgênicos de littermate. Após o início da doença, os camundongos transgênicos Bac fxAR121 exibem um comprimento de passada significativamente mais curto (pmembro torácico= 0, 1, pHind-membro= 0, 9) (Figura 2a). A análise longitudinal semelhante não revelou diferenças na largura da passada em qualquer idade testada (p2,5 meses= 0,709, p9 meses= 0,204) (Figura 2b). Os camundongos transgênicos pós-sintomáticos do BAC fxAR121 também têm uma propagação significativamente mais estreita do dedo do pé traseiro (p = 0,01) do que os controles de littermate com idade correspondente (Figura 2C). Os camundongos Bac fxAR121 modelam uma doença neuromuscular que afeta principalmente os membros posteriores, de modo que medidas detalhadas de marcha do membro torácico não foram coletadas. Nós incentivamos os investigadores que usam este método da análise da marcha considerar o phenotype de seus modelos do rato e escolher métricas do porte do membro torácico ou do Hind-membro conformemente.
Figura 1: medidas de análise da marcha e solução de problemas.
A. representação esquemática da análise da marcha em camundongos, representando o comprimento da passada, largura da passada e informações do dedo espalhado. B. exemplo representativo de uma seqüência de pegada de análise de marcha que pode ser pontuada, representando a medição de todos os três parâmetros. C. exemplos representativos de sequências de pegada de análise de marcha problemáticas que não podem ser pontuados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: os camundongos transgênicos da SBMA BAC fxAR121 exibem um fenótipo progressivo de marcha neurodegenerativa que pode ser detectado por meio da análise da marcha.
A. apesar de não existirem diferenças nas idades pré-sintomáticas (2,5 meses, nCTL= 11, nexpt= 12), os camundongos Bac fxAR121 desenvolvem um comprimento de passada significativamente reduzido em comparação com os seus controlos não transgênicos de littermate em estágios pós-sintomáticos (9 meses, nCTL= 8, nexpt= 12). B. não foram detectadas alterações na largura da passada em qualquer idade. C. SINTOMÁTICOS SBMA Bac fxAR121 camundongos transgênicos exibem redução significativa do dedo do pé de membro traseiro em comparação aos controles de littermate não transgênicos. N = 8-12/grupo. ANOVA com teste post-hoc de Tukey * p < 0, 5, * * p < 0, 1. As barras de erro representam SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usando o método de análise de marcha de baixo custo descrito acima, mostramos com sucesso a identificação de vários parâmetros de disfunção da marcha em idades pós-sintomáticas no modelo de mouse BAC fxAR121 da SBMA. As diminuições no comprimento da passada são consistentes com os estudos anteriores de SBMA de modelos do rato e de pacientes humanos9. Nós igualmente mostramos pela primeira vez que há umas diferenças significativas na propagação do dedo do pé do Hind-membro em ratos sintomáticos de SBMA comparados aos controles não-transgenic do littermate. Curiosamente, as diminuições no dedo traseiro que se espalha podem ser causadas por fraqueza nos músculos extensores da pata, aperto nos músculos flexor da pata, ou inervação nervosa fraca2,19, que também é consistente com a etiologia da SBMA.
Os ratos devem prontamente funcionar à câmara do objetivo devido a sua preferência comportável natural para espaços escuros pequenos, mas alguns ratos não podem continuamente mover-se através do túnel. Se um mouse pular, parar ou se virar dentro do túnel (veja exemplos na Figura 1C), repita o teste após um período de descanso em um novo papel de pontuação. Os resultados podem ser salvageable se um rato parar no começo do túnel desde que pode frequentemente delicadamente ser estimulado em funcionar à caixa do objetivo.
Aplicando demasiada ou demasiado pouca pintura aos pés de um rato pode produzir resultados inutilizáveis. O excesso de tinta pode levar a impressões desfocadas ou distorcidas, enquanto a tinta insuficiente pode produzir impressões fracas ou não identificáveis (Figura 1C). Em ambos os casos, repita o ensaio em um papel de Pontuação limpa para evitar medições imprecisas.
Os ratos muito novos (< 3 meses velhos) são mais prováveis saltar para a frente no túnel, visto que os ratos mais velhos (> 8 meses velhos) ou muito fenotípicos são mais prováveis parar ou resistir o movimento dianteiro inteiramente. Adicionar um incentivo comportamental (sementes de girassol) na câmara do objetivo pode ajudar a diminuir a freqüência de comportamentos problemáticos incentivando ratos desmotivados atravessar o túnel sem parar.
As dimensões do túnel devem refletir as dimensões do sujeito; Se estiver usando camundongos que são significativamente maiores ou menores do que um rato de laboratório médio (devido à idade, dieta ou mutações genéticas), recomendamos alterar as dimensões do túnel e da câmara do objetivo para corresponder ao tamanho do animal. No túnel, os ratos devem poder andar confortavelmente em uma linha reta, mas devem ter alguma dificuldade que giram ao redor para desencorajar este comportamento. A câmara do objetivo deve combinar a altura do túnel e os ratos devem caber confortavelmente dentro da câmara.
Pesquisadores que usam o método derecorte de identificação para seus camundongos podem não ser capazes de coletar dados sobre a propagação do dedo do pé, mas outras medidas de marcha como comprimento da passada e largura da passada ainda podem ser coletadas. Toe-clipping não impacta significativamente a marcha em camundongos, desde que não mais do que dois dedos são cortados por mouse20.
Este método de análise da marcha não reflete a função cognitiva, por isso não deve ser usado como uma medida de cognição. Outros pretendendo usar esse método devem considerar os grupos neuromusculares afetados em seu modelo de mouse e, em seguida, escolher as métricas de membro de frente ou de traseiras em conformidade. Este método de análise da marcha não é recomendado para pesquisadores que estudam respostas à dor que necessitem de injeções de coxim plantar, ou para estudos que necessitem de medidas biomecânicas de locomoção que não podem ser descritas apenas por pegadas, como medições temporais de membros movimento ou rotação conjunta21.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer à A.M. pela assistência de identificação animal. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos institutos nacionais de saúde dos EUA (R01 7 RF1 AG057264 para A.R.L.S. e C.J.C. e R01 NS100023 para a. R. L. S) e a associação de distrofia muscular (subsídio de pesquisa básica para A.R.L.S., subsídio de desenvolvimento para C.J.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Caliper | n/a | n/a | must have markings down to 0.1 mm |
| Craft Glue | E6000 | n/a | |
| Footprint Paint (Tempera Paint) | Artmind | n/a | must be non-toxic |
| Round Barrel Paintbrushes | Symply Simmons | n/a | 0.5 cm diameter |
| Ruler | n/a | n/a | must have markings down to millimeters |
| Scoring Paper (Watercolor Pads) | Canson | n/a | cut to size |
| Tunnel and Goal Chamber | Interstate Plastics | n/a | cut to size |
References
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